Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell&#39;Agenzia Nazionale per la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), l&#39;Associazione Francia Alzheimer e Bpifrance. Il nostro laboratorio è anche supportato da Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie Curie e il programma &quot;Investigations d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vorremmo ringraziare l&#39;assistenza della centrale CELIS per la coltura delle cellule.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali presso l&#39;Istituto ICM e dal Comitato per gli animali etnici di Darwin, e sono trattati con il protocollo 01407.02. 1. Preparazione <ol><li> Preparare il cocktail di digestione in un tubo da 1,5 ml combinando le seguenti forme per ogni topo: 1 mL di fosfato bucidato salina (PBS); 123 μL di enzima di digestione (vedere tabella dei materiali) a 13 wunsch / mL (soluzione di riserva), concentrazione finale 1,6 wunsch / mL; E 5 μL DNasi I (vedere tabella dei materiali) a 100 mg / ml (soluzione di scorta), concentrazione finale 0,5 mg / ml. </li></ol> 2. Perfusione e dissezione <ol><li> Eutanizzare i topi con una dose letale di pentobarbital (100 μL a 400 mg / ml). </li><li> Posizionare l&#39;animale in posizione supina e bagnare il corpo con il 70% di etanolo. </li><li> Tagliare la pelle ventrale con forbici sottili appena al di sotto del processo xifoide per esporre la cavità toracicay. </li><li> Effettuare un&#39;incisione nel diaframma e tagliare gli aspetti laterali della gabbia con una raffinata scissorsin in direzione caudale-rostrala per esporre il cuore (evitando di tagliare altri organi). Identificare il ventricolo sinistro (LV) e l&#39;atrio destro (RA). </li><li> Inserire un catetere a farfalla con un ago da 25 G all&#39;interno del LV. Effettuare un&#39;incisione sulla RA con forbici finissime e all&#39;inizio del flusso sanguigno, iniziare la perfusione a 10 mL / min di portata attraverso il LV con 20 mL di PBS per rimuovere le cellule e il sangue dalle vasi; La perfusione efficace è nota dal blanching dei polmoni e del fegato in quanto il sangue viene spostato. </li><li> Decapitare l&#39;animale con forbici medio. Disseccare la colonna vertebrale con forbici fine e separarla dal corpo escitando la muscolatura della parete addominale sul lato ventrale della colonna vertebrale e tagliando la colonna vertebrale alla base della coda. </li><li> Inserire una siringa da 10 ml contenente PBS e una punta pipetta montata da 200 μL nel lato lombare diLa colonna vertebrale e sciacquare il midollo spinale sul lato cervicale. NOTA: La punta della pipetta da 200 μL viene tagliata con forbici alla sua estremità più larga (circa 1 cm) e strettamente inserita su una siringa da 10 ml precedentemente riempita con PBS. </li><li> Rimuovere la pelle sopra il cranio e utilizzare le pinze per esporre il cervello. Inserire una lama di forbice alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la sutura sagittale. Inserire piccole pinze nel taglio e sollevare delicatamente il cranio. Disseccare il cervello dalla testa del mouse e rimuovere la lampadina olfattiva e il cervelletto. </li><li> Raccogliere il cervello e il midollo spinale in un tubo da 1,5 mL contenente 1,128 ml di PBS con il cocktail di digestione (dal punto 1.1). </li></ol> 3. Dissociazione delle cellule <ol><li> Tagliare finemente il cervello e il midollo spinale nel tubo da 1,5 ml (passo 2.9) in 1-2 mm 3 pezzi con forbici piccole ( figura 1 ). </li><li> Incubare il tubo da 1,5 ml contenente i tessuti macinati per 30 minuti in un incubatoA 37 ° C con 5% di CO 2 . NOTA: Preparare il gradiente di densità a questo punto. </li><li> Aggiungere 20 μl 0,5 M EDTA (soluzione di riserva), concentrazione finale 10 mM, al tubo da 1,5 mL per fermare la reazione enzimatica. </li><li> Creare delicatamente una sospensione cellulare pipettando su e giù con una pipetta da 5 ml. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso una maglia di nylon (dimensioni di pori da 70 μm) in un tubo da 50 ml utilizzando lo stantuffo di una siringa da 10 ml. </li><li> Lavare la maglia di nylon con 20 ml di 5% Fetal Bovine Serum (FBS) -PBS. </li><li> Centrifugare per 7 minuti (300 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Scartare il surnatante aspirando e procedere alla fase successiva. Prestare particolare attenzione quando si rimuove il surnatante; Non disturbare il pellet, che può essere facilmente aspirato dalla pipetta aspirante. </li></ol> 4. Gradiente di densità <ol><li> Preparare una soluzione di scorta del mezzo di gradiente di densità aggiungendo la quantità appropriata di 10x PBS al mezzo di gradiente di densità. NOTA: Aggiunta di una parte di 10X PBS a nove parti di gradiente di densità. </li><li> Diluire il medium di gradiente di densità di stock con 1x PBS per le diverse percentuali come descritto nella Tabella 1 . </li><li> Riposizionare il pellet (dal punto 3.7) con 4 mL di 30% di gradiente di densità e trasferire in un tubo da 15 mL. </li><li> Posizionare una pipetta Pasteur nel fondo del tubo da 15 ml e sottovalutare lentamente 4 mL di mezzo di gradiente di densità del 37%. </li><li> Aggiungere 4 mL di media di gradiente di densità del 70%, come descritto in precedenza. </li><li> Centrifugare il gradiente per 40 min (800 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Assicurarsi che la centrifuga si arresti con un minimo o nessun freno in modo che l&#39;interfaccia non sia disturbata. NOTA: il tubo sarà stratificato. Le cellule stratificate all&#39;interfaccia di gradiente di densità del 70% -37% sono le cellule immunitarie mononucleate (sottopopolazioni microglia e macrofagi); I livelli superiori sono detriti cellulari e mielina, rispettivamente ( Figura 2 ). </li><lI&gt; Usando una pipetta di trasferimento, togliere delicatamente lo strato di mielina. </li><li> Raccogliere 3-4 mL della interfaccia di gradiente di densità del 70-37% contenente le cellule di subpopulazioni del macrofage in un tubo pulito da 15 mL. </li><li> Lavare le cellule 3x con PBS, volume totale di 15 ml. Assicurarsi che il mezzo di gradiente di densità contenente le cellule sia diluito almeno tre volte con PBS e centrifughi per 7 minuti (500 xg, 4 ° C) con il freno &quot;on&quot;. </li><li> Resuspendere il pellet cellulare con 1 ml di PBS per l&#39;etichettatura delle cellule o per altri dosaggi funzionali. </li></ol> 5. Etichettatura cellulare per la citometria di flusso <ol><li> Trasferire le celle (punto 4.10) in un tubo di citometria a flusso. </li><li> Aggiungere 1 μl di reagente per la macchiatura della cellula morta fissabile a ciascun campione di cellule ottenuto al punto 4.10. Incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetto dalla luce. </li><li> Lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min (300 xg, 4 ° C). </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellula con400 μl PBS 1% BSA, 0,1% azide. </li><li> Aggiungere 1 μg di anticorpi CD16 / CD32 a 100 μL delle cellule per bloccare i recettori Fc. Incubare 10-15 min su ghiaccio, protetto dalla luce. </li><li> Preparare la miscela anticorpale primaria in PBS 1% BSA, 0,1% azide o PBS 1% BSA, 0,1% azide, 0,25% saponin, per la permeabilizzazione delle cellule per la colorazione intracellulare. </li><li> Aggiungere 100 μL di anticorpi primari mescolare (2x) e incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetto dalla luce. NOTA: Tutti gli anticorpi devono essere titolati prima di condurre l&#39;esperimento per garantire risultati ottimali. </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min (300 xg, 4 ° C). Ripetere questo passaggio tre volte. </li><li> Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario se gli anticorpi primari non sono direttamente coniugati a un fluoroforo e incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetti dalla luce. </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C). Ripetere questo passaggio tre volte. </li><li> Fissare ilCellule con 100 μl 1% PFA per 15 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. NOTA: Attenzione: il PFA è tossico. Usare in una cappa aspirante e indossare equipaggiamento protettivo personale. </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C. Ripetere questo passaggio tre volte. </li><li> Resuspendere il pellet cellulare con 200 μl di PBS e procedere all&#39;acquisizione e all&#39;analisi della citometria a flusso. Seguire la strategia di gating in Figura 3 . </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare

È stato dimostrato che la microglia e l&#39;MDM hanno funzioni e fenotipi diversi nel CNS e quindi l&#39;identificazione e l&#39;analisi di queste subpopulazioni macrofagi sono essenziali per meglio capire le malattie neurologiche 9 , 18 , 25 . L&#39;analisi della citometria a flusso utilizzando due marcatori (CD11b e CD45) consente la distinzione tra ciascuna sottopopolazione ( Figura 3C ). Questa strategia è stata precedentemente convalidata utilizzando altri marcatori specifici, come CCR2 per MDM e CX3CR1 per la microglia e un approccio recentemente sviluppato con un anticorpo a Tmem119 ( Figura 3E - 3G ). Abbiamo eseguito esperimenti con anticorpi CCR2 e CX3CR1 ( Figura 3F , 3G ) come abbiamo precedentemente pubblicato 18 . Il CD11b + CD45Med popolazione altamente espresso Tmem119 e CX3CR1 ma non CCR2 in contrasto con la popolazione alta CD11b + CD45. La popolazione elevata di CD11b + CD45 è composta da varie sottopopolazioni con o senza espressione di CCR2. L&#39;identificazione e la caratterizzazione di queste subpopulazioni macrofagi (macrofagi perivascolari, macrofagi infiltrati, ecc. ) Sono un&#39;ampia area di ricerca. Inoltre, i marcatori di queste popolazioni possono cambiare a seconda dei processi patologici. Infatti, la CCR2 viene ridotta quando i monociti attraversano la barriera ematoca 26 . Gli anticorpi CD45 e CD11b hanno riconosciuto gli antigeni della superficie cellulare, quindi il trattamento permeabilizzante non è necessario. Pertanto, questa tecnica potrebbe anche essere usata per purificare ogni sottopopolazione dei macrofagi mediante la selezione delle cellule per l&#39;analisi mRNA o altri dosaggi funzionali. È da notare che l&#39;uso dell&#39;enzima e della densità gradIenti possono indurre, in una certa misura, l&#39;attivazione di microglia. Abbiamo già osservato che dopo l&#39;isolamento, la microglia e i macrofagi esprimono l&#39;indottabile sintesi dell&#39;ossido nitrico (iNOS). Tuttavia, aumentato il livello di espressione iNOS osservato nella patologia rispetto alla condizione normale può essere evidenziato utilizzando questo metodo 18 . Inoltre, questa tecnica raggiunge una popolazione cellulare ben separata (singlet) con una elevata percentuale di cellule vive. Per la replica di questo protocollo, sono presenti diversi parametri critici. L&#39;impostazione del gradiente è più importante. La nostra esperienza indica che la preparazione dei gradienti in tubi da 15 mL contro quelli di 50 mL ottiene migliori separazioni. Se non si vedono cellule nell&#39;interfaccia del 70-37%, la quantità di tessuto CNS utilizzato per l&#39;isolamento cellulare dovrebbe essere considerata. Di solito raccogliamo ~ 400.000 cellule da un cervello del mouse. Sebbene questa resa fluttua da varie condizioni sperimentaliUno per una migliore visualizzazione dell&#39;interfaccia del 70-37% è quello di rendere il livello di gradiente di densità del 37% con PBS e fenolo rosso. Con l&#39;aiuto di diversi laser e filtri nel citometro di flusso, questo protocollo può quantificare diversi marcatori espressi da ciascuna delle sottopopolazioni 18 dei macrofagi. Questa tecnica è utile anche per valutare il coinvolgimento di altre cellule immunitarie come le cellule T e le cellule B nello stesso campione. Infatti, le tecniche usando l&#39;arricchimento immunomagnetico consentono solo lo studio delle popolazioni precedentemente selezionate 21 . Nel complesso, questa tecnica costituisce uno strumento utile per caratterizzare le diverse subpopulazioni dei macrofagi nei modelli di topi di malattie neurologiche. Questa alternativa unica può valutare gli effetti del trattamento sui processi infiammatori in condizioni patologiche.

La microglia sono i macrofagi del tissue-residuo parenchimale del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono due ruoli funzionali chiave: difesa immunitaria e mantenimento dell&#39;omeostasi CNS. In contrasto con l&#39;MDM, che vengono continuamente rinnovate dalle cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo, le cellule microgliali si differenziano dalle cellule progenitrici primitive ematopoietiche originate dal sacco di tuorlo (YS) che colonizzarono il cervello durante lo sviluppo embrionale 1 , 2 , 3 . Nei roditori il fattore di trascrizione Myb svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di tutti i monociti e macrofagi derivanti dal midollo osseo, ma per Yglia microglia, questo fattore è dispensabile e la differenziazione rimane dipendente dal fattore di trascrizione PU.1. Nel sano CNS, microglia sono cellule dinamiche che continuamente esemplare il loro ambiente, scaNning e indagini per l&#39;invasione di patogeni o danni ai tessuti 5 . La rilevazione di tali segnali inizia un percorso per risolvere il danno. La microglia va rapidamente da una morfologia ramificata a quella amoboide, seguita da fagocitosi e rilascio di vari mediatori, come citochine pro o anti-infiammatorie. Pertanto, a seconda del loro microambiente, la microglia attivata può acquisire uno spettro di stati distinti di preparazione 6 . La microglia influenza profondamente lo sviluppo e la progressione di molti disturbi neurologici. Nei modelli roditori della malattia di Alzheimer (AD) 7 , della sclerosi laterale amyotrofica (ALS) 8 , della sclerosi multipla (MS) 9 o della malattia di Parkinson (PD) 10 , la microglia dimostra di svolgere un ruolo doppio, o indurre neurotossicità dannosa o agire In modo neuroprotettivo, che è dipendente oN la malattia specifica, la fase della malattia e se la malattia è stata influenzata dal vano immunitario sistemico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La maggior parte delle lesioni CNS osservate nelle malattie citate sopra contengono una popolazione eterogenea di cellule mieloide, tra cui non solo microglia parenchimale, ma anche macrofagi perivascolari e meningiali, nonché MDM infiltrante CNS. Questi tipi di cellule possono contribuire in modo differenziato ai meccanismi patofisiologici legati alla lesione e alla riparazione 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . La sfida attuale per gli investigatori che stanno studiando questi modelli di malattia è stabilire se i monociti e i macrofagi periferici si infiltrano nel CNS e, in caso affermativo, a distInguiare la microglia residente da queste cellule. Infatti, le cellule microgliali sono molto plastiche; Quando sono attivati, i marcatori di re-espressione di microglia che sono solitamente espressi da monociti e macrofagi periferici. La questione si basa pertanto sull&#39;individuazione di marcatori che possono distinguere la microglia residente dai monociti infiammatori e dai macrofagi. La discriminazione di queste popolazioni sulle fette del cervello mediante applicazioni immunohistologiche è limitata a causa della mancanza di anticorpi specifici. Tuttavia, l&#39;analisi della citometria a flusso è una tecnica efficace per valutare l&#39;espressione di diversi marcatori e per distinguere le popolazioni cellulari (ad esempio, i linfociti, i macrofagi / MDM CD11b + CD45 e microglia CD11b + CD45 med ), così come le sottopopolazioni di cellule 16 , 17 , 18 . Questo protocollo descrive le procedure per l&#39;isolamentoCellule mononucleari del topo CNS nei modelli di malattia neurologica utilizzando una dissociazione tissutale ottimizzata e enzimatica e una centrifugazione di gradiente di densità; Nonché un metodo per differenziare le popolazioni di microglia e MDM nel CNS utilizzando la citometria a flusso. Un altro approccio è quello di eliminare la mielina e purificare le cellule utilizzando perline magnetiche coniugate a specifici anticorpi 19 , 20 , 21 . La rimozione della mielina usando le perline magnetiche anti-mieline è più costosa e influenza la vitalità e la resa delle cellule isolate 22 . Questo passaggio e la seguente separazione immunomagnetica della microglia, limitano ulteriori studi di popolazioni specifiche delle cellule immunitarie 21 , 22 . Queste procedure forniscono un modo semplice per studiare le sottopopolazioni dei macrofagi nello sviluppo delle malattie, ePer determinare gli effetti farmacologici o le modificazioni geniche sui fenotipi macrofagi e sugli stati di attivazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5-month-old Mice</td>
			<td style="width:223px;">Janvier</td>
			<td style="width:119px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liberase TL Research Grade</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5401020001</td>
			<td>Digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Percoll</td>
			<td style="width:223px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01&#160;</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Cell Strainer size 70 &#181;m Nylon</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">731751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Venofix 25G</td>
			<td style="width:223px;">BRAUN</td>
			<td style="width:119px;">4056370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Piston syringe 10 mL</td>
			<td style="width:223px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS+10ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Pasteur pipette 230 mm</td>
			<td style="width:223px;">Dustcher</td>
			<td style="width:119px;">20420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,5 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">15 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">50 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td style="width:223px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Bovine Serum Albumin solution 30%</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Paraformaldehyde 32% Solution</td>
			<td style="width:223px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714-S</td>
			<td>Caution -Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Saponin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">45-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">45-4031&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">563890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BV421 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control RUO</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3)</td>
			<td style="width:223px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">14-0161</td>
			<td>Mouse Fc Block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fixable Dead Cell Stain Kits</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L34969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">FAB5538A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">IC013A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">FAB5825P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Goat IgG PE-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">IC108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Cell analyzer</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD FACSVERSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Data Analysis Software</td>
			<td style="width:223px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14010-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry

Numerosi studi hanno dimostrato il ruolo delle cellule immunitarie, in particolare dei macrofagi, nelle patologie del sistema nervoso centrale (CNS). Esistono due principali popolazioni di macrofagi nel CNS: (i) la microglia, che sono i macrofagi residenti del CNS e sono derivate da progenitori di sacchi di tuorlo durante l&#39;embriogenesi e (ii) i macrofagi derivanti da monociti (MDM), che possono infiltrarsi Il CNS durante la malattia e sono derivate da progenitori del midollo osseo. I ruoli di ciascuna sottopopolazione dei macrofagi variano a seconda della patologia studiata. Inoltre, non esiste un consenso sui marcatori istologici o sui criteri distintivi utilizzati per queste sottopopolazioni macrofagi. Tuttavia, l&#39;analisi dei profili di espressione dei marker CD11b e CD45 mediante citometria a flusso ci consente di distinguere la microglia (CD11b + CD45 med ) dall&#39; MDM (CD11b + CD45 alta ). In questo protocollo mostriamo che la centrifugazione di gradiente di densitàE l&#39;analisi della citometria a flusso può essere utilizzata per caratterizzare queste subpopulazioni del macrofago del CNS e per studiare diversi marcatori di interesse espressi da queste cellule come abbiamo recentemente pubblicato. Così, questa tecnica può ulteriormente comprendere il ruolo dei macrofagi nei modelli di topi di malattie neurologiche e può anche essere usato per valutare gli effetti della droga su queste cellule.

Dopo la centrifugazione di gradiente di densità e la colorazione degli anticorpi, le cellule sono state acquisite su un citometro di flusso e analizzate utilizzando una strategia di gating morfologica come segue. Un primo cancello è stato definito nella zona di puntamento di Forward-Spattered-Area (FSC-A) rispetto alla Forward-Spattered-Height (FSC-H) per discriminare singole celle da dublets ( Figura 3A ). Le singole cellule sono state quindi gated su FSC-A versus Side-Spattered-Area (SSC-A) dot plot per escludere detriti cellulari e cellule pyknotic, basata sulla relativa dimensione cellulare e granularità cellulare ( Figura 3B ). Quindi, la microglia e L&#39;MDM è stato identificato sulla base dei loro livelli di espressione dei marker CD11b e CD45 ( Figura 3C , 3D ). Infine, altri marcatori di espressione sono stati analizzati per ogni sottopopolazione dei macrofagi ( Figura 3E -3G ). Il microglSono stati riportati per esprimere il CX3CR1 ma non il marker CCR2 in contrasto con MDM 23 . Recentemente, è stato dimostrato che Tmem119 è un marker specifico per microglia 19 . I seguenti marcatori (Tmem119, CX3CR1 e CCR2) sono stati valutati mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi rivelatori specifici per ciascun marker; Tutte le cellule CD11b + CD45 med sono state dimostrate positive per i marker Tmem119 e CX3CR1, ma non per il marker CCR2, che convalida questa strategia di gating ( Figura 3E -3G ). In assenza dell&#39;isolamento di gradiente di densità, le subpopulazioni del macrofage non potevano essere definite nel punteggio FSC-A rispetto a SSC-A a causa della presenza di molte cellule e residui di mielina ( Figura 3H ). Da notare, il trattamento di permeabilizzazione induce un ritiro delle cellule e quindi le sottopopolazioni di macrofage sono apparse smAller nella FSC versus punteggio SSC ( Figura 3I , J ) come descritto in precedenza 24 . La vitalità delle cellule è stata determinata usando il kit di macchia morta fissabile. Dopo il gradiente di densità, l&#39;85-95% delle cellule sono vive ( Figura 3K ). Le microglie e le popolazioni MDM possono essere definite dai marker CD45 e CD11b su un plot di punti dopo l&#39;isolamento del cervello e delle cellule del midollo spinale in un solo campione ( Figura 3L ) e anche dal cervello o dal midollo spinale ( Figura 3M , 3N ). Per l&#39;etichettatura della citometria a flusso, è importante sapere se la proteina e / o l&#39;epitopo riconosciuto dall&#39;anticorpo sono intra- o extracellulari. Nel caso di antigeni intracellulari è necessario un tampone di permeabilizzazione. Tmem119 è una proteina transmembrana ma l&#39;epitopo è riconosciutoDalle macchie degli anticorpi come intracellulari 19 . In assenza di permeabilizzazione delle cellule, non vi era alcuna etichettatura ( Figura 3O ). L&#39;assenza di questa fase di permeabilizzazione potrebbe portare a falsi risultati negativi. Poiché l&#39;anticorpo Tmem119 non è direttamente coniugato ad un fluoroforo, le cellule sono state etichettate con un anticorpo secondario; Il controllo negativo è stato solo anticorpo secondario (linea nera) ( Figura 3E , 3O-3R ). Quando vengono utilizzati anticorpi coniugati direttamente, ci sono due strategie principali per valutare l&#39;etichettatura specifica: anticorpi isotipici come controlli negativi o controlli di fluorescenza minus (FMO). I controlli FMO contengono ogni anticorpo di etichettatura nella miscela tranne l&#39;anticorpo di controllo per quel campione. Pertanto, è necessario un controllo FMO per ciascun marcatore, mentre è necessaria una sola miscela di etichettatura per il controllo degli anticorpi isotipici, per campione. Per l&#39;etichettatura delle cellule immunitarie del cervello, abbiamo scelto l&#39;isotControllando che un numero limitato di cellule (400.000 celle) si ottiene dopo il gradiente di densità da un cervello del mouse. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55781/55781fig1.jpg" /> Figura 1: Fasi della procedura di dissociazione delle celle. ( A ) Il tessuto è stato collocato in un tubo con enzimi del cocktail di digestione. ( B ) Il tessuto è stato finemente tagliato in piccoli pezzi con forbici. ( C ) I piccoli pezzi di tessuto sono stati incubati per 30 minuti (37 ° C) per una digestione tissutale efficiente. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55781/55781fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55781/55781fig2.jpg" /> Figura 2: Schema del gradiente di densità dopo CenFase di trifugazione. Dopo la centrifugazione, la mielina è presente nella parte superiore del gradiente di densità e le cellule immunitarie contenenti popolazioni di macrofagi si trovano all&#39;interfaccia tra i livelli di gradiente di densità del 37% e 70%. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55781/55781fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55781/55781fig3.jpg" /> Figura 3: Analisi della citometria rappresentativa dei macrofagi. È stata applicata una strategia di logica logica: ( A ) La discriminazione dei doppi si riferisce al punto grafico FSC-A rispetto a FSC-H. ( B ) La strategia di gancio morfologico si riferisce al punto grafico FSC-A rispetto a SSC-A. ( C ) Le sottopopolazioni di macrofagi si riferiscono al punto grafico CD45 contro CD11b. ( D ) Il puntino di cellule staIned con anticorpi isotipici come controllo per la colorazione CD45 e CD11b. L&#39;analisi dei marcatori espressi da queste due subpopulazioni di macrofage: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) e CCR2 ( G ) (10.000 eventi in porta P2). ( J ) o dopo l&#39;isolamento del gradiente di densità e con il trattamento permeabilizzante ( I ) o senza ( J ), i diagrammi di punti indicanti la dimensione cellulare (FSC-A) e la granularità (SSC-A) delle cellule del cervello e del midollo spinale prima del gradiente di densità . ( K ) L&#39;istogramma della citometria a flusso illustra la percentuale di cellule morte dopo il gradiente di densità. Le porte mostrate nei diagrammi a punti illustrano la popolazione CD11b + CD45 med microglia e la popolazione MDM alta CD11b + CD45 nel cervello e nel midollo spinale ( L ) o nel cervello ( M ) o nel midollo spinale ( N ) separatamente. Analisi di Tmem119 espresseDalle sottopopolazioni macrofagi nel cervello e nelle cellule del midollo spinale permeabilizzate ( O ) o non permeabilizzate ( P ), e nel cervello ( Q ) o nelle cellule permeabilizzate del midollo spinale ( R ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55781/55781fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Volume per 1 tubo (mL) </td><td> Media di gradiente di densità 1x </td><td> PBS 10x </td><td> PBS 1x </td></tr><tr><td> Densità media gradiente 30% </td><td> 1.5 </td><td> 0.15 </td><td> 3.35 </td></tr><tr><td> Densità media gradiente 37% </td><td> 1.85 </td><td> 0,185 </td><td> 2.965 </td></tr><tr><td> Densità media gradiente 70% </td><td> 3.5 </td><td> 0.35 </td><td> 1.15 </td></tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione delle diverse percentuali del medium di gradiente di densità.

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Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Questo protocollo fornisce un&#39;analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

analysis-microglia-monocyte-derived-macrophages-from-central-nervous

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.6K Views.  Inserm U 1227, CNRS UMR 7225.  Questo protocollo fornisce un'analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule. 

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Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Caratterizzazione fenotipica dei macrofagi dal rene di ratto mediante citometria di flusso

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier between the periphery and the CNS. The CNS is an immunologically specialized site, and in steady state conditions, immune privilege is most evident in the CNS parenchyma. In contrast, the meninges harbor a diverse array of resident cells, including innate and adaptive immune cells. During inflammatory conditions triggered by CNS injury, autoimmunity, infection, or even neurodegeneration, peripherally derived immune cells may enter the parenchyma and take up residence within the meninges. These cells are thought to perform both beneficial and detrimental actions during CNS disease pathogenesis. Despite this knowledge, the meninges are often overlooked when analyzing the CNS compartment, because conventional CNS tissue extraction methods omit the meningeal layers. This protocol presents two distinct methods for the rapid isolation of murine CNS tissues (i.e., brain, spinal cord, and meninges) that are suitable for downstream analysis via single-cell techniques, immunohistochemistry, and in situ hybridization methods. The described methods provide a comprehensive analysis of CNS tissues, ideal for assessing the phenotype, function, and localization of cells occupying the CNS compartment under homeostatic conditions and during disease pathogenesis.

This paper presents two optimized protocols for examining resident and peripherally derived immune cells within the central nervous system, including the brain, spinal cord, and meninges. Each of these protocols helps to ascertain the function and composition of the cells occupying these compartments under steady state and inflammatory conditions.

Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolamento delle cellule CD8 + T residenti neireni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...