Riconosciamo le seguenti fonti di finanziamento: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), University of Virginia School of Medicine (JB).

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia.
1. Costruzione di elettrodi / costruzione di cavi
<ol><li>Utilizzare un filo di acciaio inossidabile isolato unipolare (diametro nudo di 0,005 ", 0,008") per creare un elettrodo collegato con un connettore a presa femmina (connettore presa femmina 0,079).</li>
	<li>Utilizzare uno speciale cavo su misura per collegare gli animali all'amplificatore.<ol>
<li>Collegare un connettore maschio a 4 pin (connettore maschio 0,079") all'amplificatore operazionale (op-amp) a 4 canali di unità di guadagno corrispondente all'impedenza. Collegare un resistore da 10K ai fili che si collegano alla batteria da 9 V. Un filo di terra non collegato all'amplificatore operazionale funge da punto medio della batteria.</li>
		<li>Collegare un'estremità del cavo (AWG, 0,012" OD) all'amplificatore operazionale e collegare l'altra estremità del cavo all'amplificatore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Chirurgia di impianto di elettrodi
<ol><li>Anestetizzare il cucciolo (giorno 9 postnatale) con il 4-5% di isoflurano in una cappa a flusso verso il basso. Prima dell'inizio della procedura, iniettare i cuccioli con bupivacaina (0,02-0,05 ml, 0,25% di infiltrazione locale sottocutanea).</li>
	<li>Una volta che l'animale è immobile, trasferirlo in uno stadio stereotassico con un cono nasale. Usa il retro della barra dell'orecchio in quanto è morbido per tenere la testa ferma. A questa età, i cuccioli non hanno un orecchio completamente sviluppato per utilizzare l'estremità appuntita della barra dell'orecchio.</li>
	<li>Abbassare il flusso di isoflurano e mantenerlo al 2,5-3%. Tieni d'occhio la respirazione costante del cucciolo durante la procedura chirurgica. Pizzicare la coda per controllare la risposta al dolore e quindi procedere all'incisione.</li>
	<li>Sterilizzare l'area di incisione sul cranio con betadina e alcool (3 cicli di alternanza di iodio ed etanolo al 70%). Drappeggiare la parte del corpo circostante in modo tale che la regione dell'incisione sia visibile.</li>
	<li>Aprire il cuoio capelluto anteriormente-posteriore da leggermente sopra gli occhi e ritrarre circa 0,5 cm di pelle. Riposizionare la testa del mouse sullo stadio stereotassico in modo che la pelle tiri verso l'esterno esponendo il cranio.</li>
	<li>Applicare il perossido di idrogeno sul cranio usando un batuffolo di cotone e raschiare il cranio pulito usando una lama di bisturi. Il cranio è molto morbido; prestare attenzione durante il raschiamento.</li>
	<li>Applicare una goccia (circa 50 μL) di adesivo e stenderlo intorno all'area del cranio esposta utilizzando il suo applicatore. Esporre alla luce UV per 40 s per impostare l'adesivo.</li>
	<li>Misurate le coordinate utilizzando il bregma esposto come riferimento. Impiantare elettrodi bilateralmente nella regione CA1 dell'ippocampo [-3,5 mm Dorsale-Ventrale (DV), ±2 mm Mediale-Laterale (ML), -1,75 mm Profondità (D)] e bilateralmente nella corteccia parietale [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] e un elettrodo di riferimento nel cervelletto17. Utilizzare un ago da 32 G per creare un foro nella regione contrassegnata.</li>
	<li>Pulire il sangue dalla superficie del cranio. Elettrodi inferiori attaccati al connettore della presa femmina nel cervello con l'aiuto del braccio stereotassico e fissati in posizione con acrilico dentale. Impiantare l'elettrodo nel cervello. L'auricolare con connettore a presa si trova sulla parte superiore del cranio incollato insieme da acrilico dentale.</li>
	<li>Iniettare ketoprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea nella regione interscapolare una volta fissato l'elettrodo. Rimetti i cuccioli con la madre. NOTA: introdurre metà della lettiera con l'auricolare in una sola volta alla madre piuttosto che introdurli uno alla volta. Ciò impedirà alla madre di danneggiare l'auricolare del cucciolo.</li>
</ol>3. Configurazione e registrazione EEG (baseline/pre-infortunio)
<ol><li>Dopo 24 ore di recupero dopo l'impianto dell'elettrodo, posizionare ogni animale in una camera di plexiglas riscaldata (37 °C) su misura per la registrazione EEG. Questa camera servirà anche come camera per l'ipossia.</li>
	<li>Collegare i cuccioli nella camera a un sistema di monitoraggio video-EEG tramite un cavo flessibile (cavo op-amp personalizzato). NOTA: con l'auricolare in posizione, i mouse sono liberamente mobili e non presentano differenze di comportamento. Una volta attaccati ai fili dell'elettrodo, i fili devono essere regolati all'interno del cavo della camera in modo da fornire la giusta quantità di allentamento in modo che il cucciolo possa muoversi liberamente in tutta la camera.</li>
	<li>Digitalizza i dati EEG a 1000 Hz con guadagno 1K utilizzando un amplificatore erba. Rivedere il segnale EEG (filtro passa banda tra 3-70 Hz) in un secondo momento utilizzando un software (ad esempio, LabChart Pro).</li>
	<li>Registrare un EEG al basale pre-lesione per 30 minuti prima di disconnettere gli animali per la procedura di legatura dell'arteria carotidea.</li>
</ol>4. Legatura dell'arteria carotide sinistra
<ol><li>Anestetizzare il cucciolo (giorno 10 postnatale) con il 4-5% di isoflurano in un cappuccio a flusso verso il basso e posizionarlo su una configurazione appositamente disposta su un waterbath pad. Posizionare l'animale supino e fissare gli arti anteriori con del nastro adesivo.<ol>
<li>Abbassare il flusso di isoflurano al 2-3%. Pizzicare la coda per la risposta al dolore e monitorare la respirazione durante la procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sterilizzare l'area di incisione (tra mandibola e clavicola) sul lato sinistro del collo con betadina e alcool (3 cicli di iodio alternato ed etanolo al 70%).</li>
	<li>Fai un'incisione lunga circa 1 cm sul lato sinistro del collo usando microscissori. Utilizzando un microscopio di dissezione, ritrarre con cura il tessuto sottocutaneo e la pelle per esporre l'arteria carotide. Fare attenzione a identificare il nervo vago (che corre lateralmente all'arteria) e separarlo delicatamente e ritrarlo dall'arteria.</li>
	<li>Infilare una sutura di seta sterile lunga 5 cm sotto l'arteria usando microforze. Legare una sutura a doppio nodo attorno all'arteria al flusso occluso.</li>
	<li>Tagliare la sutura in eccesso e chiudere l'arteria esposta tirando indietro il tessuto sottocutaneo e la pelle. Utilizzare il legame veterinario per sigillare l'incisione.</li>
	<li>Riposizionare l'animale su un monitoraggio EEG continuo in una camera a temperatura ambiente, che viene posizionata su un materasso riscaldante. Effettuare controlli della temperatura a infrarossi della temperatura interna del cucciolo per evitare di aprire la camera. Lasciare che l'animale si riprenda per 1 ora prima dell'ipossia.</li>
</ol>5. EEG e ipossia
<ol><li>Monitorare continuamente FiO2 (frazione di ossigeno inspirato) all'interno della camera tramite un monitor di ossigeno.</li>
	<li>Lavare la camera con 60 L/min di 100% N2 e 0,415 L/min per 100% O2. Una volta che la saturazione di ossigeno nella camera raggiunge il 12%, ridurre il flusso di N2 a 10 L / min mantenendo invariato il flusso di O2 . Con piccole regolazioni, mantenere il FiO2 all'8% per 45 minuti.</li>
	<li>Dopo 45 minuti di esposizione all'ipossia, riportare la FiO2 al 21%.</li>
	<li>Chiedi ai cuccioli di recuperare in camera e monitorare l'EEG per 2 ore post-ipossia.</li>
	<li>Dopo il completamento del periodo di registrazione, scollegare i topi dalla registrazione EEG e tornare alla madre.</li>
</ol>6. Analisi EEG
<ol><li>Analizza il file EEG con il video in LabChart Pro. Chiedi a un ricercatore in cieco di contrassegnare l'EEG per convulsioni e modelli di sfondo17. Le convulsioni sono definite come un evento elettrografico della durata superiore a 10 secondi con scariche d'onda acuta ritmiche ad alta frequenza (≥3x basale) con chiara evoluzione17.</li>
	<li>Chiedi a un secondo ricercatore in cieco di rivedere gli eventi contrassegnati a caso per l'accordo.</li>
	<li>Rivedere il video associato per ogni evento elettrografico marcato e analizzare in base al punteggio di crisi comportamentale del roditore neonatale16. In breve, questo punteggio varia da 0-6 (immobilità a grave comportamento tonico-clonico). Per caratterizzare ulteriormente la semiologia convulsiva, analizzare il comportamento per la lateralità (movimenti multifocali / bilaterali vs. focali / unilaterali vs. misti).</li>
	<li>Creare uno spettrogramma di potenza. Utilizzare una trasformazione di Fourier veloce con una finestra dati Coseno-Campana con una dimensione di 1024 punti dati. Crea un asse x liscio nello spettrogramma con l'aiuto di una sovrapposizione di finestre dell'87,5%. Esprimere la potenza come μV218.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vasudevan, C., Levene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+aetiology+of+neonatal+seizures.">Epidemiology and aetiology of neonatal seizures.</a> Seminars in Fetal &amp; Neonatal Medicine. , (2013).</li><li>Volpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Seizures.">Neonatal Seizures.</a> Volpe's Neurology of the Newborn. , 275-321 (2018).</li><li>Shankaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+EKSNNR.+Childhood+outcomes+after+hypothermia+for+neonatal+encephalopathy.">Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy.</a> New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).</li><li>Pappas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+outcomes+after+neonatal+encephalopathy.">Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy.</a> Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).</li><li>van Schie, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+motor+and+behavioral+outcome+after+perinatal+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Long-term motor and behavioral outcome after perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> European Journal of Paediatric Neurology. 19 (3), 354-359 (2015).</li><li>Rensing, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+analysis+of+developmental+changes+in+electroencephalography+patterns+and+sleep-wake+states+of+the+neonatal+mouse.">Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse.</a> PLoS One. 13 (11), 1-17 (2018).</li><li>Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat.">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).</li><li>Burnsed, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-ischemia+and+therapeutic+hypothermia+in+the+neonatal+mouse+brain--a+longitudinal+study.">Hypoxia-ischemia and therapeutic hypothermia in the neonatal mouse brain--a longitudinal study.</a> PLoS One. 10 (3), 0118889 (2015).</li><li>Semple, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+development+in+rodents+and+humans:+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species.">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Progress in Neurobiology. , 1-16 (2013).</li><li>Comi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+neuroprotection+and+seizure+suppression+in+immature+mouse+brain+ischemia.">Gabapentin neuroprotection and seizure suppression in immature mouse brain ischemia.</a> Pediatric Research. 64 (1), 81-85 (2008).</li><li>Comi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse.">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).</li><li>Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Electroencephalographic+Monitoring+with+Radio-Telemetry+in+a+Rat+Model+of+Perinatal+Hypoxia-Ischemia+Reveals+Progressive+Post-Stroke+Epilepsy.">Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).</li><li>Burnsed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Circuit+Activity+during+Neonatal+Hypoxic+-+Ischemic+Seizures+in+Mice.">Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice.</a> Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).</li><li>Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neonatal+seizures+in+an+animal+model+of+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).</li><li>Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+effect+of+flupirtine+in+an+animal+model+of+neonatal+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).</li><li>Kang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+sex-dependent+susceptibility+to+phenobarbital-resistant+neonatal+seizures:+role+of+chloride+co-transporters.">and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).</li><li>Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+transient+acute+hypoxia+on+the+developing+mouse+EEG.">Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG.</a> Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).</li><li>Lewczuk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EEG+and+behavior+patterns+during+experimental+status+epilepticus.">EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus.</a> Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).</li><li>Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+gradient+diffusion+MRI+reveals+unique+microstructural+information+in+normal+and+hypoxia-ischemia+injured+mouse+brains.">Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).</li></ol>

Abbiamo presentato un modello per il monitoraggio video-EEG continuo nei topi neonatali durante le crisi ipossico-ischemiche. L'analisi video in combinazione con l'EEG consente la caratterizzazione della semiologia convulsiva. L'analisi dell'EEG consente l'estrazione di spettrogrammi di potenza e l'analisi dell'ampiezza di fondo.
Il posizionamento corretto e attento degli elettrodi è fondamentale in questo protocollo, poiché lesioni durante il posizionamento dell'elettrodo o un posizionamento impreciso possono influire in modo significativo sui risultati. La valutazione della normale attività EEG al basale prima della lesione è fondamentale, poiché possono verificarsi sanguinamenti o lesioni durante il posizionamento dell'elettrodo, sebbene rari. In secondo luogo, al fine di confermare il corretto posizionamento dell'elettrodo, i cervelli possono essere sezionati ed esaminati per le tracce dell'elettrodo nel posizionamento corretto. Inoltre, la mancata restituzione dei cuccioli alla madre in gruppi (individualmente) può causare danni alle cuffie degli elettrodi o l'uccisione o la negligenza dei cuccioli da parte della madre.
Una limitazione di questo metodo è il limite di localizzazione spaziale delle registrazioni degli elettrodi di profondità in un piccolo cervello neonatale. Ciò limita la capacità di localizzare specifici focolai di convulsioni sulle registrazioni EEG. Un'altra limitazione in questo modello di ischemia da ipossia è la variabilità del carico convulsivo. La variabilità delle dimensioni della lesione e i deficit comportamentali in questo modello di ischemia da ipossia da roditore sono stati ben descritti in precedenza7,8,19. Non sorprende che questa variabilità esista nel carico convulsivo (sia la durata degli eventi convulsivi che il numero di eventi convulsivi). Tuttavia, in modo coerente, il 100% dei cuccioli in questo modello presenta convulsioni durante l'ipossia. Infine, la quantità di tempo in cui i cuccioli possono essere monitorati EEG (lontano dalla madre) è limitata. Pertanto, non siamo in grado di caratterizzare le convulsioni in corso con EEG continuo in momenti successivi rispetto alla lesione.
Sebbene in questo manoscritto abbiamo utilizzato un modello di crisi ipossia-ischemia, questo metodo per il monitoraggio video-EEG continuo nei cuccioli di topo neonatale potrebbe essere facilmente applicato ad altri modelli di malattia / convulsioni. Le convulsioni nei roditori neonatali sono difficili da riconoscere in base al solo comportamento, rendendo importante il monitoraggio video-EEG. Indagini future potrebbero utilizzare queste tecniche per analizzare il carico convulsivo e la semiologia in altri modelli di convulsioni neonatali o la risposta a terapie e misure neuroprotettive.

L'encefalopatia ischemica ipossica (HIE) è una condizione che colpisce 1,5 neonati su 1000 all'anno ed è la causa più comune di convulsioni neonatali1,2. I neonati che sopravvivono sono a rischio di varie disabilità neurologiche come paralisi cerebrale, disabilità intellettiva ed epilessia3,4,5.
I modelli animali svolgono un ruolo fondamentale nella comprensione e nello studio della fisiopatologia dell'ipossia ischemia e delle convulsioni neonatali6,7. Un modello di Vannucci modificato viene utilizzato per indurre l'ischemia da ipossia (HI) al giorno 10 postnatale (p10)7,8. I cuccioli di topo di questa età si traducono neurologicamente approssimativamente nel termine completo neonato umano9.
Il monitoraggio video elettroencefalografico continuo (EEG) utilizzato in combinazione con questo modello di lesione consente un'ulteriore comprensione e caratterizzazione delle crisi ischemiche ipossiche neonatali. Studi precedenti hanno utilizzato vari metodi per analizzare le convulsioni neonatali nei roditori, tra cui registrazioni video, registrazioni EEG limitate e registrazioni EEG di telemetria10,11,12,13,14,15,16. Nel seguente manoscritto, discutiamo in profondità il processo di registrazione di video EEG continui nei cuccioli di topo durante l'ipossia-ischemia. Questa tecnica per il monitoraggio video continuo dell'EEG nei cuccioli di topo neonatale potrebbe essere applicata a una varietà di modelli di malattie e convulsioni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ball Point Applicator</td>
			<td>Metrex Research</td>
			<td>8300-F</td>
			<td>i-bond applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cranioplast (Powder/Resin)</td>
			<td>Coltene</td>
			<td>H00383</td>
			<td>Perm Reline/Power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Bond</td>
			<td>Kulzer GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOOK Silk Suture</td>
			<td>Surgical Specialities Corporation</td>
			<td>SP115</td>
			<td>LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS-5168 Botvin Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5168</td>
			<td>Forcep for surgery/ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS-5138 Graefe Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5138</td>
			<td>Forcep for surgery/ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light for I-Bond</td>
			<td>Blast Lite By First Media</td>
			<td>BL778</td>
			<td>UV ligth for I-bond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Microdissecting Scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5618</td>
			<td>Scissor for ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Bond</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Vet Glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPOXIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxidial</td>
			<td>Starr Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen sensor</td>
			<td>Medical Products</td>
			<td></td>
			<td>MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG RECORDING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female receptacle connector 0.079&#34;</td>
			<td>Mill-Max Manufacturing Corp</td>
			<td>832-10-024-10-001000</td>
			<td>Ordered from Digikey</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Amplifier</td>
			<td>Natus Neurology Incorporated</td>
			<td></td>
			<td>Grass Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart Pro</td>
			<td>ADI Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software to run the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Socket Connector 0.079&#34;</td>
			<td>Mill-Max Manufacturing Corp</td>
			<td>833-43-024-20-001000</td>
			<td>Ordered from Digikey</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational Amplifier</td>
			<td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td>
			<td>TLC2274CD</td>
			<td>TLC2274 Quad Low&#8208;Noise Rail&#8208;to Rail Operational Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational Amplifier</td>
			<td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td>
			<td>TLC2272ACDR</td>
			<td>TLC2274 Quad Low&#8208;Noise Rail&#8208;to Rail Operational Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>791400</td>
			<td>0.005&#34; Bare/0.008&#34; Coated 100 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Flexible Wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9564T1</td>
			<td>36 Gauze wire of various color</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous video electroencephalogram during hypoxia-ischemia in neonatal mice

L'ischemia da ipossia è la causa più comune di convulsioni neonatali. I modelli animali sono cruciali per comprendere i meccanismi e la fisiologia alla base delle convulsioni neonatali e dell'ischemia da ipossia. Questo manoscritto descrive un metodo per il monitoraggio continuo dell'elettroencefalogramma video (EEG) nei topi neonatali per rilevare le convulsioni e analizzare lo sfondo EEG durante l'ischemia da ipossia. L'uso di video ed EEG in combinazione consente la descrizione della semiologia delle convulsioni e la conferma delle convulsioni. Questo metodo consente anche l'analisi degli spettrogrammi di potenza e delle tendenze del modello di sfondo EEG nel periodo di tempo sperimentale. In questo modello di ischemia ipossia, il metodo consente la registrazione EEG prima della lesione per ottenere una linea di base normativa e durante la lesione e il recupero. Il tempo totale di monitoraggio è limitato dall'incapacità di separare i cuccioli dalla madre per più di quattro ore. Sebbene in questo manoscritto abbiamo utilizzato un modello di convulsioni ipossico-ischemiche, questo metodo per il monitoraggio EEG video neonatale potrebbe essere applicato a diversi modelli di malattie e convulsioni nei roditori.

Semiologia convulsiva
L'esposizione neonatale all'ipossia-ischemia provoca convulsioni sia generalizzate che focali nei topi (Figura 1A-C). Le registrazioni video EEG consentono di correlare i risultati elettrografici al comportamento sul video. Questi comportamenti sono stati valutati utilizzando un punteggio comportamentale per roditori neonatali (BSS) precedentemente pubblicato. Oltre alla BSS, abbiamo classificato gli eventi in base al fatto che il comportamento fosse focale/unilaterale, bilaterale o misto (Figura 1B).
In questo modello, i topi hanno generalmente mostrato 3 modelli di semiologia convulsiva: 1) volteggio ripetitivo sul lato della legatura con estensione delle estremità controlaterali, 2) perdita di postura con flessione del corpo e coda arricciata sul lato della legatura, o 3) perdita di postura con pagaiata unilaterale o bilaterale delle estremità (diversa gravità e lunghezza). La maggior parte degli eventi osservati riguardava comportamenti focali/unilaterali o misti (Figura 1B). Inoltre, durante il periodo ipossico, un sottogruppo di topi ha mostrato attività convulsiva convulsiva, in cui il cucciolo era immobile con attività convulsiva sostenuta su EEG (Figura 1C).
Registrazioni elettrografiche
La registrazione EEG è stata avviata 30 minuti prima della legatura carotidea al fine di ottenere una linea di base pre-infortunio. L'attività basale (Figura 1A e Figura 2A) era simile allo sfondo precedentemente descritto nei cuccioli di topo p1017. Dopo la legatura, i cuccioli sono stati immediatamente rimessi in video EEG. Durante il periodo tra la legatura e l'inizio dell'ipossia, un sottogruppo di topi presenta convulsioni convulsive (Figura 1A-C).
A seguito dell'induzione dell'ipossia, l'ampiezza di fondo sull'EEG si è ridotta (Figura 3B) e ha mostrato in modo intermittente raffiche di scariche di onde spike, seguite da soppressione (Figura 2A). I topi mostrano convulsioni elettrografiche, che emergono da uno sfondo soppresso come scariche ritmiche di onde spike e progrediscono per diventare più complesse e frequenti, con onde polispike (Figura 2B). Durante l'ipossia, l'analisi dello spettrogramma di potenza è stata notevole per le asimmetrie tra l'emisfero ischemico e controlaterale (Figura 3A, B). L'emisfero ischemico ha mostrato un modello di soppressione dello scoppio e l'emisfero controlaterale ha mostrato uno sfondo soppresso (Figura 1A e Figura 3A, B). In media le convulsioni iniziano 5,5±8,1 minuti dopo l'induzione dell'ipossia, con ogni evento della durata di 56±57 secondi. C'è stato un tasso di mortalità del 13% durante l'ipossia (n = 4/30), con tutti i decessi a seguito di un attacco convulsivo (BSS = 5-6).
Durante la riossigenazione e il recupero, un sottogruppo di topi continua ad avere convulsioni per il resto del periodo di registrazione (2 ore post-ipossia). Lo sfondo EEG è stato soppresso rispetto al basale dopo ipossia (Figura 1A e Figura 3), con recupero graduale durante il periodo di registrazione post-ipossia. Durante l'intero periodo di registrazione, i topi hanno mostrato in media 9±5 eventi convulsivi, ciascuno durato 54±57,7 s.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61346/61346fig1v2.jpg"> Figura 1: Caratteristiche convulsive nei topi p10 esposti a ipossia-ischemia neonatale. (A) Spettrogramma di potenza rappresentativo dall'elettrodo della corteccia parietale ischemica attraverso la linea temporale sperimentale. (Scala della mappa di calore a colori di ampiezza x10-6). Le frecce indicano il tempo rappresentato dai tracciati dell'elettroencefalogramma grezzo al di sotto dello spettrogramma. (B) Comportamenti convulsivi per l'intero esperimento, postischemia/preipossia, durante l'ipossia e postiposia. (C) Punteggio di crisi comportamentale (BSS) e tempistica per tutti gli eventi convulsivi (n = 30 topi, ogni topo ha un simbolo unico, ogni punto è un evento convulsivo discreto). Il 100% dei topi sequestrati durante l'ipossia (scatola blu; il tempo = -60 minuti è il completamento della legatura carotidea, il tempo = 0 è l'inizio dell'ipossia). Il tredici per cento è morto durante l'ipossia a seguito di un attacco convulsivo (grado 5-6). Questa cifra è stata modificata da Burnsed et al13. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61346/61346fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61346/61346fig2v2.jpg"> Figura 2: Modelli caratteristici di elettroencefalografia (EEG) durante l'ischemia da ipossia. (A) Sfondo EEG da sinistra a destra: linea di base pre-infortunio, soppressione burst durante l'ipossia, soppressione postipoxia. Registrazione da elettrodo di profondità della corteccia parietale ipsilaterale. (B) Evoluzione di un attacco durante l'ipossia. Registrazione da elettrodo di profondità ippocampale ipsilaterale. Le caselle ombreggiate (I-V) corrispondevano agli estratti EEG espansi a destra di (B). Questa cifra è stata modificata da Burnsed et al13. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61346/61346fig2v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="bigfig" src="/files/ftp_upload/61346/61346fig03.jpg"> Figura 3: Asimmetrie sullo sfondo EEG tra emisferi ischemico e controlaterale. (A) Spettrogramma di potenza asimmetrica nei topi HI durante l'ipossia (periodo di 45 minuti) nella corteccia ischemica (sinistra) e nella corteccia controlaterale (destra; scala di ampiezza x10-6). Modello di soppressione burst e convulsioni nell'emisfero ischemico, soppressione nell'emisfero CL. (B) Soppressione dello sfondo durante l'ipossia e la riossigenazione negli emisferi IL e CL. Tutte le misurazioni della tensione media prese da estratti casuali di 10 secondi dell'encefalogramma nel periodo di tempo sperimentale (basale, 30 minuti dopo la postligazione, durante l'ipossia - 15 minuti e 30 minuti dopo l'inizio, dopo la riossigenazione - 15 minuti e 60 minuti dopo l'inizio) sono state confrontate con il basale. La linea di base di ogni animale fungeva da controllo a sé stante e i dati sono riportati come percentuale del basale (n = 5 topi). Le misurazioni sono state prese da elettrodi corticali. Questa cifra è stata modificata da Burnsed et al13. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61346/61346fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice at JoVE.com

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Questo manoscritto descrive un metodo per registrazioni EEG video continue utilizzando elettrodi di profondità multipli in topi neonatali sottoposti a ipossia-ischemia.

Elettroencefalogramma video continuo durante l'ipossia-ischemia nei topi neonatali

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

continuous-video-electroencephalogram-during-hypoxia-ischemia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.3K Views.  University of Virginia. Questo manoscritto descrive un metodo per registrazioni EEG video continue utilizzando elettrodi di profondità multipli in topi neonatali sottoposti a ipossia-ischemia.

Video: Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

Video-oculografia in Mouse

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Ricerca

Neuroscienze

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Neonatale Elettroporazione zona subventricolare

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

Neonatale Pial elettroporazione Surface

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

Registrazione di EEG nei ratti neonatali liberamente in movimento utilizzando un metodo novello

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...