Questo metodo è utile per rilevare e co-localizzare più biomarcatori in una singola criosezione, inclusi marcatori che normalmente non sono rilevabili nelle sezioni di paraffina. Utilizzando questo metodo di colorazione sperimentale, il tempo di colorazione è significativamente ridotto e il metodo può essere eseguito in qualsiasi laboratorio. A dimostrare questo metodo sarà Dinesh Jaishankar.
È un abile postdoc del laboratorio, e anche il nucleo di valutazione dell'immunoterapia, responsabile delle strutture. Quando si selezionano gli anticorpi per l'analisi, considerare i set di filtri di eccitazione ed emissione disponibili sul sistema di imaging semi-automatizzato. E dopo aver testato varie combinazioni di anticorpi primari coniugati al fluoroforo, preparate i fluorofori da utilizzare in modo da avere una sovrapposizione spettrale minima come suggerito nella tabella.
Per la colorazione multiplex, preparare un cocktail di anticorpi con fluorofori compatibili a delusioni ottimali predeterminate e aggiungere il cocktail alle sezioni tissutali di interesse. Per la colorazione a marcatore singolo, aggiungere l'anticorpo coniugato primario solo alla diapositiva. Per tutte le colorazioni, includere uno scivolo non macchiato di controllo che subisce la stessa procedura di colorazione senza l'aggiunta di un anticorpo coniugato primario.
Dopo un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente protetta dalla luce, lavare gli scivoli due volte con PBS per cinque minuti per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, ricollere le diapositive macchiate multiplex con DAPI per sette minuti a temperatura ambiente protette dalla luce, seguite da due lavaggi di cinque minuti in PBS. Per creare una libreria spettrale, impostare la potenza della lampada del sistema di imaging multispettrale sul 100% e aprire il software operativo al microscopio.
Selezionare Modifica protocollo e nuovo protocollo. Immettere un nome di protocollo e selezionare Fluorescenza in modalità di imaging. Quindi fornire un nome di studio e caricare le singole diapositive macchiate sul palco.
Fate clic su Modifica esposizione (Edit Exposure) e utilizzate le opzioni messa a fuoco automatica ed esposizione automatica per regolare i tempi di esposizione e acquisire istantanee per le singole diapositive macchiate. Dopo aver imaging delle singole diapositive macchiate, salvare il protocollo. E nel software di machine learning sotto la scheda Build Library, carica ogni singola immagine macchiata.
Selezionare il piano appropriato e fare clic su Estrai. Il software estrae automaticamente il segnale fluorescente selezionato nel pavimento. Per salvare il colore estratto, fare clic su Salva per archiviare.
È possibile creare un nuovo gruppo o archiviare il colore estratto in un gruppo esistente. Per l'imaging multispettrale, una volta creata e verificata la libreria spettrale, regolare la messa a fuoco e i tempi di esposizione sulla diapositiva macchiata multiplex come dimostrato e aprire diapositive digitalizzate per creare una nuova attività. Fornire un ID diapositiva e selezionare un protocollo.
In Attività selezionare l'analisi dell'intera diapositiva per eseguire un'analisi completa delle diapositive nella diapositiva macchiata multiplex. Nell'intera immagine di scansione delle diapositive selezionare le aree di interesse nell'immagine. Queste aree verranno scansionate utilizzando i tempi di esposizione impostati in precedenza sulla diapositiva multiplex da utilizzare per l'unmixing spettrale e l'analisi.
Nel software operativo al microscopio selezionare acquisisci campi MSI in attività, quindi fare clic su Process Slide per acquisire aree di interesse con un ingrandimento di 20x. Una volta acquisite le aree di interesse, nel software di machine learning fare clic su File e Apri nella scheda analisi manuale per caricare le immagini macchiate multiplex. Selezionate l'origine della libreria spettrale e fate clic su Seleziona piani (Select Floors) per scegliere la libreria spettrale salvata in precedenza.
Fare clic su File e apri per caricare l'immagine non macchiata. Quindi fare clic sull'icona del marcatore di inchiostro ad autofluorescenza e disegnare una linea o un'area nella diapositiva non macchiata per identificare l'autofluorescenza all'interno del tessuto. Quindi, nella scheda Modifica marcatori e colori assegnare i nomi per ogni marcatore e fare clic su Prepara tutto.
Dopo aver verificato l'immagine spettralmente non mixata, nel software di machine learning, selezionare le opzioni di membrana citoplasmatica e marcatore dal pannello. E usando il pulsante con i puntini di sospensione, selezionare usa questo segnale per trovare, per configurare il marcatore per rilevare i nuclei, il citoplasma o la membrana. quando si sceglie un marcatore citoplasmatico o a membrana, selezionare l'opzione Usa il segnale per facilitare la scissione nucleare.
Il software rileverà e creerà automaticamente maschere individuali per il nucleo, il citoplasma e la membrana. Utilizzare la visualizzazione patologia per un marcatore specifico e le opzioni di configurazione nel software per regolare le maschere e fare clic su Segmento tutto per creare una mappa di segmentazione cellulare. Dopo la segmentazione delle celle, selezionare i marcatori per fenotipare le celle positive.
Inoltre, selezionare almeno cinque celle non macchiate con il marcatore scelto per fenotipare le celle negative. Quindi fare clic su Addestra classificatore per addestrare il software per rilevare automaticamente tutte le celle macchiate con i marcatori selezionati all'interno dell'immagine. Verrà creata una mappa fenotipo.
Come dimostrano queste immagini, gli anticorpi convalidati per la citometria a flusso potrebbero essere utilizzati per visualizzare la colorazione dei tessuti utilizzando il filtro tonnibile a cristalli liquidi nel sistema di imaging semi-automatizzato. Qui si può osservare un'immagine spettralmente non mixata della tonsille umana congelata che include l'etichettatura delle cellule B e delle cellule proliferanti all'interno del centro germinale follicolare e la regione inter follicolare delle cellule T. L'opzione visualizzazioni patologia consente la visualizzazione del modello di colorazione individuale per ogni marcatore all'interno del tessuto di interesse, suggerendo che il metodo di colorazione multiplex e l'imaging spettrale funzionano sul tessuto congelato.
Come dimostrato su una sezione tumorale del topo congelata, l'imaging multispettrale può anche essere utilizzato per visualizzare le cellule T infiltrazioni tumorali e altre lignaggi delle cellule mieloidi tra cui macrofagi associati al tumore. È possibile generare mappe di segmentazione cellulare e fenotipo e il numero di celle macchiate per ogni marcatore analizzato dal software, dimostrando che il software può essere utilizzato per la quantificazione della colorazione multispettrale sui tessuti congelati. Per qualcuno di nuovo 6 alla tecnica, è importante conoscere le caratteristiche specifiche dei fluorocromi e preparare diapositive della libreria di qualità per l'unmixing spettrale con sovrapposizione spettrale minima.
È anche importante eseguire la titolazione degli anticorpi. A nostro avviso, questo metodo può fornire informazioni sul comodino sull'efficacia dell'immunoterapia per il cancro e altre applicazioni terapeutiche, in particolare quando la tempistica è essenziale.
