L'analisi delle cellule della popolazione laterale è uno dei metodi comunemente usati per isolare e identificare le cellule staminali tumorali dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. Questo test è conveniente, veloce ed economico. Questo metodo può contribuire a una migliore comprensione dell'effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.
Molti fattori possono influenzare la percentuale di cellule SP in questa analisi, quindi è fondamentale esplorare le condizioni corrette prima dell'esperimento formale. Semina le cellule tumorali in una piastra di sei po', e incubale in un incubatore Celsius di 37 gradi fornito con anidride carbonica al 5%. Quando la densità cellulare raggiunge circa il 90% aspira il mezzo di coltura e lava le cellule due volte con tre millilitri di PBS.
Quindi, aggiungere 500 microlitri dello 0,25% di tripsiderina-EDTA a ciascun pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per uno o tre minuti. Toccare delicatamente la piastra per staccare le celle, aggiungere tre millilitri di PBS integrati con 2%FBS a ciascun pozzo e pipettare le celle su e giù da tre a cinque volte per disperdere i grumi cellulari. Esaminare la sospensione cellulare al microscopio.
Se sono presenti grumi cellulari, passare la sospensione attraverso un filtro da 70 micrometri. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugarle a 200 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in tre millilitri di PBS integrati con 2%FBS, pipettando le celle su e giù da tre a cinque volte per mescolare.
Contare le cellule al microscopio usando un emocitometro e diluirle in PBS integrato con 2%FPS ad una concentrazione finale di una per 10 alle sei cellule per millilitro. Preparare due provette a cinque millilitri, polistirolo, fondo tondo e aggiungere un millilitro della sospensione cellulare a ciascun tubo. Etichettare una provetta come provetta e l'altra come tubo di controllo del bloccante.
Preparare una soluzione di bloccante diluerla alla concentrazione appropriata. Aggiungilo al tubo di controllo del bloccante e mescola bene, quindi incuba il tubo a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Agitare il tubo ogni 10 minuti.
Preparare una soluzione di Hoechst 33342 diluerla alla concentrazione appropriata. Aggiungerlo separatamente alla provetta e al tubo di controllo del bloccante e mescolare bene, quindi incubare i tubi a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Agitare i tubi ogni 10 minuti.
Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule per cinque minuti a 200 volte g e quattro gradi Celsius, quindi aspirare attentamente il supernatante. Rimorsi le celle in ogni tubo con un millilitro di PBS ghiacciato integrato con 2%FBS, quindi pipettare le celle su e giù per mescolare. Aggiungere un microlitro di ioduro di propidio di un milligrammo per millilitro, o PI, a ciascun tubo e mescolare.
Fare clic sulla scheda Parametri nel software del citometro di flusso. In primo luogo, scegliete i parametri rispettivamente di FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI. In secondo luogo, scegliere la scala logaritmica per il parametro PI.
Infine, scegliete le scale di area e larghezza rispettivamente per i parametri FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI. Eseguire prima le celle dalla provetta, quindi eseguire le celle dal tubo di controllo del bloccante utilizzando le stesse tensioni e cancelli. Raccogli da 20 a 100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP.
Questo metodo è stato utilizzato per rilevare la proporzione di cellule SP nella linea cellulare del cancro al seno umano MDA-MB-231. La trama a punti di FSC-A contro PI-A mostrava una popolazione di cellule morte, detriti cellulari e la principale popolazione di cellule negative PI, che fu sottoposta ad ulteriori analisi. Una singola popolazione cellulare gateed dal grafico a punti di FSC-A contro FSC-W e il grafico a punti di SSC-A rispetto a SSC-W è stato utilizzato per analizzare la proporzione di cellule SP, che era di circa lo 0,9% nelle celle non trattate e circa lo 0,09% nelle celle trattate con reserpina.
Diverse concentrazioni di colorazione di Hoechst 33342 sono state testate su celle MDA-MB-435, ed è stato determinato che due microgrammi per millilitro erano ottimali per l'analisi SP. Basse concentrazioni hanno reso difficile distinguere le cellule SP dalle altre popolazioni, mentre alte concentrazioni hanno causato la scomparsa delle cellule SP. Verapamil e reserpina sono stati testati per determinare il blocco corretto per le celle MDA-MB-435.
Circa lo 0,4% delle cellule ha espulso il colorante dopo il trattamento con verapamil, ma il rapporto è sceso a circa lo 0,1% dopo il trattamento con reserpina, dimostrando che la reserpina è un bloccante più appropriato per questa linea cellulare. Questo protocollo è stato utilizzato anche per determinare la proporzione di cellule SP nelle cellule adenocarcinoma polmonari umane A549 trattate con attivatore STAT3 colivelin e nelle cellule tumorali del seno umano T47D trattate con inibitore FRA1 SKLB816. Questo saggio fornisce indizi sull'effetto regolatore delle vie di segnalazione sulle caratteristiche delle cellule staminali tumorali e facilita la scoperta di nuovi meccanismi, che possono in ultima analisi guidare la terapia mirata dei tumori.
