ניתוח של תאי אוכלוסייה בצד היא אחת השיטות הנפוצות לבודד ולזהות תאי גזע סרטניים מרקמות הגידול וקווי תאים סרטניים. הבדיקה הזו נוחה, מהירה וחסכונית. שיטה זו יכולה לתרום להבנה טובה יותר של ההשפעה של גנים או אותות חוץ תאיים אחרים על תכונות גזע של תאים סרטניים.
גורמים רבים יכולים להשפיע על אחוז תאי SP בניתוח זה, ולכן חיוני לחקור את התנאים המתאימים לפני הניסוי הפורמלי. זרע תאים סרטניים בצלחת שש בארות, ולהדגיר אותם באינקובטור 37 מעלות צלזיוס מסופק עם 5% פחמן דו חמצני. כאשר צפיפות התא מגיעה כ 90%לשאוף את מדיום התרבות, ולשטוף את התאים פעמיים עם שלושה מיליליטר של PBS.
לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של 0.25%trypsin-EDTA לכל באר, ולהדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך דקה עד שלוש דקות. הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים, הוסף שלושה מיליליטרים של PBS בתוספת 2%FBS לכל באר, ופיפט התאים למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לפזר את גושי התא. בחן את השעיית התא מתחת למיקרוסקופ.
אם גושי תאים קיימים, להעביר את ההשעיה דרך מסננת 70 מיקרומטר. להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, וצנטריפוגה אותם ב 200 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את supernatant, ו resuspend התאים בשלושה מיליליטר של PBS בתוספת 2%FBS, pipeting התאים למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לערבב.
לספור תאים מתחת למיקרוסקופ באמצעות hemocytometer, לדלל אותם PBS בתוספת 2%FPS לריכוז הסופי של פעם אחת 10 לשישה תאים למיליליטר. הכינו שני מבחנות של חמישה מיליליטר, פוליסטירן, תחתית עגולה, והוסיפו מיליליטר אחד של השעיית התא לכל צינור. סמן צינור אחד כמבחנה והשני כמצינור בקרה חוסם.
הכן פתרון של חוסם על ידי דילול אותו לריכוז המתאים. מוסיפים אותו לצינור הבקרה חוסם ומערבבים היטב, ולאחר מכן דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לנער את הצינור כל 10 דקות.
הכן פתרון של Hoechst 33342 על ידי דילול אותו לריכוז המתאים. מוסיפים אותו למבחנה ולשיטת החוסם בנפרד ומערבבים היטב, ואז דגירה את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לנער את הצינורות כל 10 דקות.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות ב 200 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס, ואז בזהירות לשאוף את supernatant. לשים מחדש את התאים בכל צינור עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח בתוספת 2%FBS, ואז פיפטה התאים למעלה ולמטה לערבב. הוסף מיקרוליטר אחד של מיליגרם למיליליטר פרופידיום יודיד, או PI, לכל צינור ומערבבים.
לחץ על הכרטיסיה פרמטרים בתוכנת סיטרומטר זרימה. ראשית, בחר את הפרמטרים של FSC, SSC, Hoechst כחול, Hoechst אדום, ו PI, בהתאמה. שנית, בחר בסולם הלוגריתמי עבור הפרמטר PI.
לבסוף, בחר סרגלי שטח ורוחב עבור הפרמטרים FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red ו- PI, בהתאמה. הפעל את התאים מהמבחנה תחילה, ולאחר מכן להפעיל את התאים מצינור הבקרה חוסם באמצעות מתחים ושערים זהים. אסוף 20 עד 100,000 אירועים מכל מדגם כדי לנתח את אחוז תאי SP.
שיטה זו שימשה לגילוי חלקם היחסי של תאי SP בקו התאים של סרטן השד האנושי MDA-MB-231. העלילה נקודה של FSC-A לעומת PI-A הראה אוכלוסייה של תאים מתים, פסולת תאים, ואת האוכלוסייה העיקרית של תאים שליליים PI, אשר היה נתון לניתוח נוסף. אוכלוסיית תאים בודדים מגודרת מהתווית הנקודות של FSC-A לעומת FSC-W ותווית הנקודות של SSC-A לעומת SSC-W שימשה לניתוח היחס של תאי SP, שהיה כ- 0.9% בתאים לא מטופלים וכ- 0.09% בתאים שטופלו ב- reserpine.
ריכוזי כתמים שונים של Hoechst 33342 נבדקו על תאי מד"א-MB-435, ונקבע כי שני מיקרוגרם למיליליטר היו אופטימליים לניתוח SP. ריכוזים נמוכים הקשו על ההבחנה בין תאי SP לבין אוכלוסיות אחרות, בעוד שריכוזים גבוהים גרמו לתאי SP להיעלם. Verapamil ו reserpine נבדקו כדי לקבוע את החוסם הנכון עבור תאים MDA-MB-435.
כ -0.4% מהתאים גירשו את הצבע לאחר טיפול verapamil, אבל היחס ירד לכ 0.1% לאחר טיפול reserpine, הוכחת כי reserpine הוא חוסם מתאים יותר עבור קו התא הזה. פרוטוקול זה שימש גם כדי לקבוע את חלקם של תאי SP בתאי אדנוקרצינומה ריאות אנושי A549 שטופלו קוליבלין מפעיל STAT3 ובתאי סרטן השד האנושי T47D שטופלו במעכב FRA1 SKLB816. בדיקה זו מספקת רמזים להשפעה הרגולטורית של איתות מסלולים על התכונות של תאי גזע סרטניים ומאפשרת גילוי של מנגנונים חדשים, אשר בסופו של דבר יכול להנחות את הטיפול הממוקד של גידולים.
