Questo protocollo è applicabile a una vasta gamma di progetti di screening volti a sviluppare inibitori dell'ATPasi, sia come sonde per la ricerca di base che per potenziali composti clinici. Questo metodo è stato ottimizzato per applicazioni di screening ad altissima produttività. È stato anche progettato per evitare diversi artefatti comuni e non richiede la movimentazione di materiali pericolosi.
Nel nostro laboratorio abbiamo usato questo saggio per sviluppare nuovi e specifici inibitori della miosina II non muscolare per il trattamento del disturbo da uso di metanfetamina. In teoria, questo metodo può essere facilmente applicato a qualsiasi enzima che produce ATP. La dimostrazione visiva aiuta a chiarire tutti i dettagli tecnici importanti.
Per iniziare, preparare 4.500 microlitri di soluzione di actina diluita micromolare per ogni micropiapia di polistirolo nero da 384 porri diluire la soluzione concentrata di stock di actina in tampone di actina. Mescolare accuratamente la soluzione tubazione su e giù 30 volte per rompere i filamenti di actina per ridurre la viscosità e l'eterogeneità. Quindi centrifugare la soluzione per rimuovere eventuali proteine precipitate presenti.
Trasferire con cura il supernatante in un tubo di centrifuga pulito. Preparare la miscela enzimatica master in un tubo di centrifuga conica da 15 millilitri per ogni piastra di dosaggio combinando 3,252,9 microlitri di tampone di miosina per il saggio che coinvolge miosina muscolare scheletrica II, 171,4 microlitri di soluzione LDH e 171,4 microlitri di soluzione PK. Preparare la miscela di substrato principale in un tubo di centrifuga conica da 15 millilitri per ogni piastra combinando 162,1 microlitri di ATP, 162,1 microlitri di PEP e 324,1 microlitri di soluzione NADH.
Non aggiungere actina a questo punto per evitare l'aggregazione e le precipitazioni. Per creare diluizioni seriali da uno a due in sette punti di NADH per la calibrazione, preparare otto tubi a microcentrifugo da 1,5 millilitri. Mescolare 12,3 microlitri di soluzione stock di NADH con 257,7 microlitri di tampone di miosina nel primo tubo per fare una soluzione micromolare 250.
Quindi aliquota 135 microlitri di tampone di miosina in ciascuno dei restanti sette tubi. Trasferire 135 microlitri della soluzione dal primo tubo al secondo e mescolare mediante pipettazione. Ripetere fino a raggiungere il settimo tubo.
Utilizzare l'ultimo tubo come controllo no-NADH con solo tampone. Includere sempre controlli positivi e negativi sulle piastre composte e diluizioni NADH per la calibrazione sulle piastre di dosaggio. Questi controlli sono estremamente importanti per identificare gli artefatti durante l'analisi dei dati.
Utilizzando una pipetta a otto canali, trasferire 20 microlitri delle soluzioni di calibrazione NADH in prima fila in triplicati in una piastra di dosaggio. Ora aggiungete 4,2 microlitri di miosina muscolare scheletrica II al mix enzimatico. Vortice brevemente.
Aggiungere la miosina alla miscela enzimatica subito prima dell'erogazione. La lunga incubazione di soluzioni diluite di miosina può comportare una perdita di attività a causa delle precipitazioni e un legame non specifico con le superfici plastiche. Caricare la miscela di enzimi della miosina preparata in uno dei contenitori campione di un distributore automatico.
Nella piastra, ad eccezione della prima fila, erogare 8,4 microlitri dell'enzima miosina mescolare in ogni pozzo della piastra di dosaggio. Quindi posizionare la piastra di dosaggio e la piastra composta sui posizionatori labware di un sistema automatizzato di movimentazione dei liquidi dotato di una testa utensile a spillo da 100 nanoliter. Quindi eseguire il metodo appropriato nel software per trasferire 100 nanolitri di soluzioni dalla piastra composta preparata alla piastra di dosaggio.
Quindi, posizionare la piastra di dosaggio su uno shaker di micropiastra per agitare per un minuto a temperatura ambiente a 1.200 giri/min. Aggiungere brevemente 4.052 microlitri della soluzione di actina centrifugata alla miscela di substrato e al vortice. Per iniziare la reazione enzimatica, erogare 11,6 microlitri di substrato di actina mescolare in ogni pozzo della piastra di dosaggio utilizzando un distributore automatico, ad eccezione della prima fila.
Su uno shaker a micropiastra, agitare la piastra di dosaggio per un minuto a temperatura ambiente a 1.200 giri/min. Centrifugare la piastra di dosaggio a 101 volte g per 30 secondi. Usa un filtro di eccitazione di 380 nanometri, 10 nanometri di larghezza della banda e un filtro di emissione di banda di 470 nanometri e 24 nanometri in combinazione con lo specchio dicroico cutoff da 425 nanometri per i test.
Ottimizza il numero di flash, il guadagno del rilevatore, le dimensioni della piastra e l'altezza di misurazione prima di eseguire i test. Eseguire la misurazione in modalità ad alta concentrazione. Assicurarsi che la temperatura interna del lettore di lastre si sia stabilizzata a 25 gradi Celsius.
Caricare la piastra nel lettore di lastre e agitare per altri 30 secondi per rendere simile la forma della superficie liquida in ogni pozzo e consentire alla piastra di raggiungere la temperatura di misurazione. Scansionare la piastra a intervalli di 45 secondi e registrare la fluorescenza NADH per 30 minuti. Con i dati esportati, tracciare l'intensità di fluorescenza osservata rispetto al tempo per ogni pozzo.
Eseguire una semplice regressione lineare per determinare la pendenza e intercettare le risposte di fluorescenza per ogni pozzo. La pendenza è proporzionale al tasso di consumo di NADH che può essere utilizzato come un'ottima approssimazione del tasso di consumo di ATP. L'intercetta è proporzionale alla concentrazione di NADH all'inizio della misurazione.
Quindi, costruire una curva di calibrazione per NADH tracciando le intercette ottenute per la prima riga della piastra contro la concentrazione di NADH. Le intercettazioni stimano le intensità di fluorescenza reale all'inizio con molta più fiducia rispetto alla media dell'intensità di fluorescenza grezza che si legge all'inizio. Eseguire una semplice regressione lineare per ottenere la pendenza e intercettare la linea di calibrazione NADH.
Qui, le intercettazioni descrivono il segnale di fondo a fluorescenza senza NADH presente, mentre la pendenza corrisponde all'intensità di fluorescenza teorica estrapolata di una soluzione di NADH molare. Per convertire le variazioni di fluorescenza in tassi di consumo ATP dividere la pendenza della risposta di fluorescenza ottenuta per il resto dei pozzi per la pendenza della linea di calibrazione NADH. Successivamente, tracciare i tassi di consumo di ATP rispetto alla concentrazione dell'inibitore.
Per determinare le costanti inibitorie, utilizzare qualsiasi software statistico appropriato in grado di adattarsi a curve non lineari, come Origin 2017. Selezionare la curva non lineare adatta per adattare i dati di risposta alla dose a un'equazione quadratica corrispondente a un semplice modello di equilibrio di legame uno-a-uno. Y è il tasso di consumo ATP.
Il minimo Y è il tasso di consumo di ATP in assenza di inibitore. Y-maximum è il tasso di consumo teorico di ATP al 100% di inibizione. t e t sono rispettivamente la concentrazione totale dell'enzima della miosina e dell'inibitore.
KI è la costante inibitoria. In questo studio, le reazioni di miosina atpasi muscolare scheletrica e cardiaca II hanno mostrato tracce lineari di intensità di fluorescenza indipendentemente dalla miosina utilizzata o dalla presenza di inibitori. I tassi di ATPasi basali e attivati dall'actina hanno mostrato una dipendenza lineare dalla concentrazione di miosina muscolare scheletrica o cardiaca II.Un coefficiente della finestra di screening o fattore Z di 0,78 ha indicato un saggio affidabile con controlli positivi e negativi molto ben separati.
Blebbistatin, para-Amminoblebbistatin e para-Nitroblebbistatin hanno mostrato curve regolari di risposta alla dose a valori di solubilità riportati o inferiori. Le costanti inibitorie sia per le miosinie muscolari cardiache che per le miosinie muscolari scheletriche sono state determinate adattando un'equazione quadratica che rappresenta un semplice modello di legame di equilibrio ai dati. Tracce di intensità di fluorescenza per la blebbistatina ottenute in un saggio ATPasi utilizzando miosina muscolare scheletrica II hanno mostrato un normale segnale decrescente lineare a seconda della quantità di inibitore presente.
Tuttavia, al di sopra della solubilità della blebbistatina è stato osservato un aumento inaspettato del segnale molto probabilmente a causa della formazione di cristalli di blebbistatina brillantemente florescenti. Nel caso della para-nitroblebbistatina con tracce normali di intensità di fluorescenza grezza, i tassi di reazione ottenuti al di sopra della solubilità si sono discostati dalla curva di risposta alla dose determinata a causa delle precipitazioni. Utilizzando questo metodo, abbiamo sviluppato nuovi, potenti e selettivi inibitori della miosina che potrebbero essere utilizzati come strumenti scientifici nella ricerca di base o come candidati diretti in futuro.
Si consiglia sempre di utilizzare un atpasi diverso o un altro saggio funzionale specifico per l'enzima di interesse per distinguere tra colpi reali e falsi positivi. Tutte le proteine legano superfici plastiche. Questo problema può influenzare molto i risultati, specialmente se la proteina è presente a basse concentrazioni.
Evitare sempre una manipolazione non necessaria del liquido e utilizzare tubi non legabili. I saggi alternativi atpasi di solito richiedono la manipolazione di acido solforico, sostanze tossiche o materiali radioattivi. Al contrario, il saggio ATPasi collegato al NADH richiede reagenti senza o solo tossicità molto bassa.
