Candida è la causa più comune di infezione fungina diffusa negli ospiti immunocompro compromessi. L'incapacità degli agenti terapeutici di infiltrarsi completamente nel biofilm a causa della matrice è uno dei motivi per cui i biofilm resistono alle terapie tradizionali. Il nostro protocollo valuta come la fototerapia, utilizzando la luce rossa, interferisca con la crescita e la disposizione dei biofilm candida albicans.
I metodi applicati sono ben consolidati, poiché il ceppo utilizzato in questo studio aveva la sua matrice extracellulare caratterizzata e il dispositivo luminoso è stato applicato con successo ad altre sospensioni e biofilm di microrganismi planctonici. Il più grande vantaggio di questo dispositivo è la riduzione dei tempi di trattamento, che lo rende più visibile per le applicazioni cliniche. Quando si coltivano Candida albicans essere consapevoli che gli anticorpi possono essere acquisiti.
Pertanto, è importante non utilizzare colonie che hanno più di sette giorni, non iniziare le piastre a quattro gradi Celsius e non ristriare le cellule dalle piastre esistenti. Allo stesso modo, un ceppo deve essere usato prima di 18 ore di crescita notturna. Quando si utilizza uno spettrofotometro per la prima volta è importante ottenere prima la fattoria delle colonie nel conteggio delle unità, per correlare ai valori di densità ottica.
Pertanto, gli esperimenti inizieranno a utilizzare la fase centrale di crescita nella concentrazione iniziale delle cellule da 10 a sette cellule per millilitri. Questa concentrazione cellulare ha dimostrato di fornire i biofilm di materia più dipendenti e stabili. Per iniziare, sospendere 65 grammi di SDA, integrati con 50 milligrammi per litro di cloramfenicolo, in 1.000 millilitri di acqua distillata in un becher.
Posizionare il becher su un riscaldatore per far bollire, al fine di sciogliere completamente il mezzo. Quindi trasferire il supporto in una bottiglia di vetro. Posizionare il tappo sulla bottiglia, ma non avvitarlo completamente per assicurarsi che la bottiglia sia in grado di sfogarsi.
Mettere la bottiglia in autoclave per sterilizzare la soluzione a 15 PSI e 121 gradi Celsius per 30 minuti. Raffreddare la soluzione a circa 45 gradi Celsius. Utilizzare una pipetta sterile usa e getta, per mescolare bene, e pipettare 20 millilitri di SDA in piastre di Petri sterili.
Per preparare il mezzo YNB, integrato con glucosio millimolare 100 millimolare, mescolare 6,7 grammi di YNB e 18 grammi di destrosio a 1.000 millilitri di acqua ultra pura in un bicchiere. Posizionare una barra di agitazione nel becher e mettere il becher su una piastra di agitazione per mescolare. Filtrare il mezzo attraverso un sistema di filtranti sottovuoto da 0,22 micrometri per sterilizzare.
Preparare il mezzo RPMI mescolando 10,4 grammi di RPMI-1640 e 34 grammi di MOPS, a 1.000 millilitri di acqua ultra pura. Mescolare in un agitatore senza calore e regolare il PH a sette aggiungendo un normale idrossido di sodio. Sterilizzare il mezzo utilizzando un sistema di filtranti sottovuoto da 0,22 micrometri.
In primo luogo, scongelare il microrganismo Candida albicans SN 425 a temperatura ambiente. Semi 10 microlitri della coltura di arresto su piastre petri precedentemente preparate contenenti SDA, integrate con cloramfenicolo. Incubare i piatti di Petri aerobicamente a 37 gradi Celsius per 48 ore.
Per il pre-inoculo utilizzare un lubrificante sterilizzato per raccogliere 10 colonie di albicani Candida dalle piastre di Petri e metterli in un tubo di centrifuga contenente 10 millilitri di mezzo YNB, integrato con glucosio. Incubare il tubo aerobicamente a 37 gradi Celsius per 16 ore. Quindi, preparare gli inoculi aggiungendo questa coltura iniziale nel mezzo YNB fresco, integrato con glucosio, in una proporzione da uno a 10 per la diluizione.
Utilizzare lo spettrofotometro per misurare l'OD iniziale a 540 nanometri. Incubare gli inoculi aerobicamente a 37 gradi Celsius per otto ore e misurare l'OD finale a 540 nanometri. Sottrarre l'OD finale dall'OD iniziale per verificare se l'OD degli inoculi è in fase di crescita a metà log.
Per ottenere un inoculo con 10 alle sette cellule per millilitro, centrifugare l'inoculo per cinque minuti a 5.500 volte G.Versare il supernatante in un bicchiere contenente ipoclorito di sodio e aggiungere YNB fresco per concentrare l'inoculo a metà del volume precedente. Aggiungere un millilitro dell'inoculo ad ogni pozzo di una piastra di polistirolo da 24 pozzetti. Incubare aerobicamente a 37 gradi Celsius per 90 minuti per consentire l'adesione cellulare al fondo dei pozzi.
Trattare i biofilm per un minuto con un millilitro dello 0,12% di clorexidina per i biofilm a controllo positivo. Per il controllo negativo, trattare i biofilm per un minuto con un millilitro sterile, 0,89% cloruro di sodio. Successivamente, lavare i pozzi due volte, un minuto ciascuno, con un millilitro di cloruro di sodio sterile allo 0,89% per rimuovere le cellule non aderenti.
Quindi accendi una luce rossa non coerente e usa un misuratore di potenza per misurare la densità di potenza della luce. Determinare il tempo di esposizione in base al fabbisogno di densità energetica di 87,6 joule per centimetro quadrato. Posizionare la piastra sotto la luce rossa.
Mantenere la distanza tra la sorgente luminosa e il biofilm a cinque millilitri per evitare di riscaldare il campione. Dopo l'esposizione per un minuto, aggiungere un millilitro del mezzo RPMI sterilizzato ad ogni pozzo e incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Al mattino, ripetere lo stesso lavaggio, trattamento leggero, trattamenti di controllo positivi e negativi e incubazione per sei ore con mezzo RPMI.
Ancora una volta, lavare i biofilm due volte, esporli a luce rossa ed eseguire trattamenti di controllo positivi e negativi. Aspirare la soluzione nei pozzali e aggiungere il mezzo RPMI. Ripetere l'incubazione, il lavaggio, il trattamento leggero e i trattamenti di controllo positivi e negativi, fino a raggiungere 48 ore di sviluppo di biofilm.
Per iniziare la lavorazione, scartare il mezzo e aggiungere un millilitro di sterile, 0,89% cloruro di sodio al pozzo, e utilizzare una punta di pipetta per graffiare il biofilm dal pozzo. Trasferire il biofilm rimosso su un tubo sterile. Aggiungere un altro millilitro di sterile, 0,89% cloruro di sodio al pozzo.
Graffiare di nuovo e aggiungere la sospensione allo stesso tubo, per un volume totale di 2 millilitri. Vortice vigoroso della sospensione del biofilm per un minuto. Per l'analisi CFU, trasferire un'aliquota di 0,1 millilitri dalla sospensione del biofilm a un tubo di micro centrifuga contenente 900 microlitri di soluzione di cloruro di sodio allo 0,89% per ogni diluizione.
Diluire la soluzione di biofilm da 10 a quella negativa, a 10 a quattro negativi, in soluzione salina. Seme 50 microlitri di ogni diluizione alle piastre SDA e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 48 ore. Contare le colonie e applicare la formula.
Per l'analisi del peso a secco, pesare ed etichettare prima i tubi di microfuga. Aggiungere 0,1 millilitri della sospensione del biofilm e un millilitro di etanolo assoluto nei tubi e conservarli a -20 gradi Celsius per 18 ore. Quindi, centrifugarlo 10.000 volte G per 10 minuti.
Scartare il supernatante e posizionare i tubi in un essiccatore per asciugare i campioni per una settimana. Pesare di nuovo i tubi di micro centrifuga e fare la sottrazione per ottenere il peso della biomassa. In questo esperimento, dopo trattamenti giornalieri con luce rossa per un minuto ai biofilm Candida albicans, il CFU è stato ridotto, rispetto al controllo negativo trattato con cloruro di sodio.
I risultati della biomassa dei biofilm Candida albicans dopo trattamenti quotidiani, mostrano che il gruppo trattato a luci rosse ha presentato una riduzione della biomassa simile a quella osservata nel gruppo di controllo positivo, trattato con clorexidina. I due gruppi hanno inoltre mostrato una somiglianza statistica tra loro. Mentre entrambi hanno mostrato una riduzione della biomassa, rispetto al controllo negativo trattato con cloruro di sodio.
Quantità inferiori di Candida albicans solubili e insolubili EPS, sono state osservate in controllo positivo, rispetto al controllo negativo. Anche se non statisticamente significativa, l'applicazione giornaliera del semaforo rosso ha diminuito numericamente le quantità di EPS solubili ed EPS insolubili. Il controllo negativo e il gruppo trattato a luci rosse hanno mostrato somiglianza statistica.
Misurare la densità di potenza della luce, utilizzando un misuratore di potenza prima di iniziare il trattamento per determinare i periodi esatti di applicazione. I passaggi assicurano che la densità energetica sarà sempre di 87,6 joule per centimetro al quadrato. Utilizzare la formula citata in precedenza.
La misurazione viene effettuata utilizzando lo stesso dalla luce alla bottiglia delle piastre, cinque millimetri. Un'associazione tra fototerapia e farmaci antifungini può essere studiata per verificare se il pretrattamento con luce rossa, seguito dall'applicazione di farmaci, migliora la penetrazione del farmaco nel biofilm. Per il trattamento due volte al giorno abbiamo adattato i protocolli del nostro laboratorio, fornendo un modello di biofilm facile e riproducibile, che fornisce risposte su vitalità, peso secco e quantità extracellulari di polisaccaride dopo il trattamento a luci rosse.
Il protocollo è generico e può essere utilizzato per testare altre terapie, oltre alla luce rossa, inclusi farmaci, altre luci o la combinazione di luce e farmaci. Lavorare con microrganismi richiede attrezzature speciali, come occhiali di sicurezza, camice da laboratorio a bottone e guanti nitro.
