Questo protocollo ci aiuta a determinare come le alterazioni della biomeccanica locale, dell'architettura tissutale, degli ambienti paracrini e delle interazioni giustaprena influenzano il fenotipo cellulare. Questa tecnica ci permette di esplorare paradigmi classici ed embriologia sperimentale senza causare gli insulti tissutali su larga scala che normalmente sorgono nei tradizionali esperimenti di grafica. Per trovare la giusta pressione per l'iniezione, è utile iniziare da una pressione di iniezione inferiore e aumentare in modo incrementale fino a ottenere un flusso costante di cellule.
La visualizzazione di questa tecnica aiuta a raggiungere una comprensione diretta di come l'apparecchiatura di iniezione deve essere posizionata in relazione al tessuto bersaglio. A dimostrare la procedura saranno due membri del mio laboratorio, Trevor Henley e Kandace Thomas. 24 ore prima dell'impianto, tirare i capillari di vetro su un estrattore di micropipette secondo i protocolli standard e immergere i capillari in agente siliconizzante per rivestire le superfici esterne degli aghi.
Successivamente, caricare da 5 a 10 microlitri di agente siliconizzante in una punta di pipetta di microiniezione e posizionare la punta nell'estremità larga di un capillare di vetro tirato rivestito esternamente. Posizionare la punta della pipetta il più vicino possibile alla punta dell'ago di vetro ed espellere l'agente siliconizzante mentre si ritrae lentamente la pipetta di carico per ridurre al minimo le bolle d'aria all'interno dell'ago. Lasciare l'agente siliconizzante nell'ago di vetro per 10 minuti prima di utilizzare una nuova pipetta di carico per aspirare la soluzione.
Quindi asciugare gli aghi in un cappuccio di fumi durante la notte. Per la preparazione dell'embrione ospite, incubare uova di gallina fertili in orientamento orizzontale in un'incubatrice umidificata a 38 gradi Celsius e utilizzare pini angolati per fare una puntura di diametro superiore a un millimetro nella parte inferiore dell'estremità piatta di ogni uovo lungo l'equatore dell'uovo. Inserire un ago calibro 18 attaccato a una siringa da 10 millilitri nella puntura per rimuovere circa cinque millilitri di albume.
E applicare nastro trasparente sulla parte superiore del guscio d'uovo. Segnare la regione nastrata lungo la parte superiore dell'uovo con forcelle angolate e utilizzare forbici tenotomiche curve per tagliare una finestra di circa 2,5 centimetri nella sezione nastrata dell'uovo. Ispezionare e far scorrere l'embrione in base ai criteri stabiliti da Hamburger e Hamilton e utilizzare una siringa da un millimetro dotata di un ago calibro 32 per iniettare circa 200 microlitri di una diluizione da uno a cinque di inchiostro indiano in HBSS sotto l'embrione.
Quindi sigillare la puntura con nastro trasparente e aggiungere un millilitro di HBSS per goccia sul disco embrionale prima di sigillare il guscio finestrato con pellicola di paraffina per il posizionamento dell'uovo nell'incubatrice umidificata. Quando gli embrioni raggiungono la fase 19 di Hamburger e Hamilton, sciacquare i capillari di vetro rivestiti in silicone con acqua deionizzata e lasciare asciugare i capillari per tre o quattro ore a temperatura ambiente. Nel tempo medio, trasferire un embrione da un uovo in una piastra di Petri da 100 x 15 millimetri contenente HBSS sterile a temperatura ambiente e posizionare la piastra al microscopio stereo.
Usando le forcep, le forbici per la tenotomia e una micro spatola, isolare l'intero cuore embrionale dall'embrione e isolare gli atri dal cuore. Posizionare il tessuto atriale in un tubo sterile di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di HBSS sul ghiaccio. Quando tutto il tessuto donatore è stato raccolto, pellet i tessuti per centrifugazione in un microcentrifugo angolato fisso.
Per la digestione dei tessuti donatrici, sospendere di nuovo i pellet in un millilitro di EDTA prerifavorato allo 05% di tripparina per un'incubazione di 15 minuti in un blocco termico tremante a 300 rotazioni al minuto. Al termine dell'incubazione, pipettare più volte la soluzione di digestione per rompere il tessuto rimanente e pelletare il lisato cardiaco per centrifugazione. Sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di soluzione neutralizzante di tripina per un'altra centrifugazione seguita da ri-sospensione in 400 microlitri di soluzione colorante fluorescente rossa.
Dopo 20 minuti a 37 gradi Celsius, pellettò le cellule per centrifugazione per uno o tre lavaggi in un millilitro di HBSS per lavaggio. Quindi sospendere di nuovo le cellule etichettate a una concentrazione di cinque volte dieci-quarta per microlitro in HBSS fresco. Per l'iniezione in vivo delle cellule donatrici, eseguire il backload della sospensione cellulare in una pipetta capillare in vetro secco trattato con silicone come dimostrato e montare la pipetta nell'apparato microiniettore a pressione.
Trasferire ogni embrione ospite da iniettare dall'incubatore umidificato in un portaovo al microscopio stereo sezionato fluorescente. E utilizzare forcep fini sterili per aprire la membrana vitellina. Fare un'incisione da 5 a un millimetro nel pericardio e posizionare il microiniettore in modo che la punta dell'ago di microiniezione penetri nel tessuto bersaglio.
Impostare il microiniettore per applicare impulsi singoli di 5 secondi di durata e che vanno da 100 a 400 ettopascal in pressione. E iniettare pressione nelle cellule. È fondamentale verificare un impianto cellulare di successo imagingando il segnale fluorescente prima di risigillare l'uovo.
L'embrione può anche essere fotografato per documentare questa procedura. Quando tutte le cellule sono state iniettate, ritrarre l'apparato del microiniettore e rimuovere l'uovo dal supporto. Quindi aggiungere un millilitro di HBSS caldo per quanto riguarda la goccia sull'embrione.
Sigillare l'uovo con nastro adesivo trasparente e riportare l'uovo nell'incubatrice umidificata per 24 ore dopo l'impianto. Qui, viene mostrato il cuore e il tessuto circostante di un cuore embrionale ospite dopo l'impianto del miocita atriale del donatore. In questo esperimento rappresentativo, le cellule donatrici sono state microiniettate nel proepicardio di un embrione ospite di uno stadio simile.
La sessatura ottica con un microscopio confocale ha rivelato che le uniche cellule positive del marcatore muscolare cardiaco all'interno del proepicardio erano le cellule positive rosse fluorescenti impiantate focalmente. Fare attenzione a non manipolare empatica troppo l'embrione ricevente poiché le rotture nel cuore e la vascucolatura locale causata dall'ago di iniezione possono comportare una ridotta vitalità. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una varietà di saggi a valle, tra cui l'immunoistochimica, l'ibridazione in situ e lo smistamento cellulare.
L'agente siliconizzante è estremamente infiammabile e acutamente tossico. Deve sempre essere maneggiato con cura e dispositivi di protezione individuale adeguati all'interno di una cappa aspirante.
