Questo protocollo affronta l'analisi di campioni limitati ottenuti da microbioreattori per estrarre informazioni vitali sugli attributi critici di qualità dei prodotti. Un altro vantaggio di queste tecniche è che utilizzano tempi minimi di analisi per determinare gli attributi chiave che dettano i parametri di qualità del prodotto fabbricato. A dimostrare la procedura saranno David Powers, Talia Faison e Phillip Angart, ricercatori del mio laboratorio.
Iniziare aprendo il software collegato al sistema di purificazione e posizionando 15 tubi conici millilitro per raccogliere l'eluato anticorpale purificato e tubi conici da 50 millilitri per raccogliere il flusso durante il lavaggio ad alto sale nel collettore di frazione. Aggiungere quindi un liquido di coltura cellulare raccolto filtrato a poro da 0,22 micrometri a una siringa vuota da 12 millilitri con un ugello chiuso. Dopo aver rimosso il cappuccio, inserire l'ugello della siringa nella porta di iniezione manuale del sistema di purificazione.
Ruotare la siringa per stringerla in posizione e deprimere lo stantuffo fino a quando l'intero volume del campione non è stato iniettato ed è visibile nell'anello del campione di grande volume da 10 millilitri collegato. Selezionare il metodo salvato e fare clic su Esegui quando richiesto dal software dello strumento. Quando tutto l'anticorpo è stato eluso, neutralizzare immediatamente la proteina purificata con una base tris molare ad un pH di circa 5,5.
Per concentrare l'anticorpo purificato mediante centrifugazione, posizionare 100 filtri di kilodalton in tubi di raccolta dei filtrati. Lavare i filtri con 500 microlitri di acqua distillata doppia, quindi centrifugare. Ripetere il lavaggio del filtro due volte.
Dopo il secondo lavaggio, scartare il filtrato e trasferire i filtri risciacquati in nuovi tubi di centrifuga. Aggiungere quindi 500 microlitri di campione a ciascun filtro per la centrifugazione. Al termine dello spin, invertire il filtro in un nuovo tubo di raccolta per ottenere il campione concentrato con una centrifugazione finale.
Per l'etichettatura e l'isolamento degli N-glicani, diluire 7,5 microlitri di ciascun campione di anticorpi concentrati. Con 15,3 microlitri di spettrometria di massa cromatografica liquida o acqua di grado LCMS in tubi da un millilitro dal kit e denaturare gli anticorpi con sei microlitri di una soluzione al 5% di un tensioattivo rispettoso dell'enzima e della spettrometria di massa a 90 gradi Celsius per tre minuti. Al termine della denaturazione, lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per tre minuti prima di aggiungere 1,2 microlitri di peptide N-glicosidasi F per un'incubazione di cinque minuti a 50 gradi Celsius.
Dopo aver raffreddato i campioni per tre minuti a temperatura ambiente, etichettare i campioni con 12 microlitri di reagente di tagging fluorescente sciolto in dimetilformamide anidra per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, diluire la miscela N-glicina etichettata con 358 microlitridi di acetonitrile e posizionare una lastra di cromatografia ad interazione idrofila in un collettore sottovuoto con shm e vassoio di scarto. Condizionare i pozzi con 200 microlitri d'acqua con il vuoto regolato a 10-15 kilopascal per garantire che il liquido ci prenderà dai 15 ai 30 secondi per passare attraverso la resina cromatografica ad interazione idrofila.
Equilibrare i pozzi con 200 microlitridi dell'85% di acetonitrile per 15-30 secondi prima di caricare 400 microlitri di ogni miscela di glicina etichettata su ogni pozzo, applicando il vuoto dopo l'aggiunta di ogni nuovo liquido. Una volta aggiunti tutti i campioni, lavare la resina due volte con 600 microlitri dell'1% di acido formico e del 90% di acetonitrile per lavaggio e sostituire il vassoio di scarto con tubi di raccolta a 600 microlitri. Quindi eluire gli N-glicani etichettati con tre volumi di 30 microlitri di tampone di eluizione della spettrometria e diluire le diluizioni della piscina con 310 microlitri di dimetilformamide in eluente campionato acetonitrile.
Per analizzare i campioni di eluizione N-glicina etichettati su un sistema di cromatografia liquida ad ultraperformance accoppiato a un rilevatore di fluorescenza e a un tempo quadruplo di spettrometro di massa di volo, utilizzare un formato di ammonio millimolare e acetonitrile di grado 100%LCMS per le fasi mobili. Impostare la portata iniziale su 0,4 millilitri al minuto, con il gradiente LC che fornisce un formato di ammonio crescente durante la fase di eluizione. Impostare il rivelatore di fluorescenza per misurare un'eccitazione di 265 nanometri e un'emissione di 425 nanometri con una frequenza di campionamento di due hertz.
Impostare il quadruplo tempo di volo sulla modalità di sensibilità agli ioni positiva ms1 con un intervallo di massa da 100 a 2.000 Dalton, un tempo di scansione di 0,25 secondi e un'acquisizione di dati continuum. Quindi caricare i campioni nel campionatore automatico impostato su 10 gradi Celsius ed eseguire il metodo caricato. Per dissaltare un campione in preparazione all'analisi della variante di carica, staccare il tappo inferiore di una colonna di desalting da 0,5 millilitri, allentare il tappo superiore e posizionare la colonna di dissalarizzazione in un tubo di centrifuga da 1,7 millilitri.
Trasferire la nuova colonna in un nuovo tubo di microcentrifugo e aggiungere 80 microlitri di una soluzione anticorpale da 3,5 milligrammi per millilitro nella parte superiore della colonna. Allineare la colonna all'orientamento originale e centrifugare la colonna. Quindi scartare la colonna di dissalezione e mescolare accuratamente il campione concentrato.
Diluire il campione a una concentrazione di due milligrammi per millilitro in 25 microlitri di acqua ultrapura in un unico pozzo di una piastra da 96 pozzetti e aggiungere cinque microlitri di tampone di etichettatura e cinque microlitri di reagente di etichettatura al pozzo. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce, mescolare 60 microlitri di acqua di grado reagente con il campione e coprire la piastra con una guarnizione della piastra per la centrifugazione. Per preparare il chip variante di carica, rimuovere la soluzione di stoccaggio e lavare i pozzi uno, tre, quattro, sette, otto e 10 con acqua.
Sostituire l'acqua con tampone di funzionamento pH 7.2 e aggiungere 750 microlitri di tampone di corsa al tubo tampone. Premere Scarica piastra sull'interfaccia utente dello strumento e rimuovere la guarnizione dalla piastra da 96 pozzi. Inserire la piastra e il tubo tampone nei punti indicati sul vassoio del campione GX2 e premere Piastra di carico.
Posizionare il chip nella camera del truciolo, chiudere il coperchio alla camera del chip, selezionare il saggio della variante di carica proteica HT quando richiesto e fare clic su Esegui. La purificazione del campione di coltura cellulare raccolta dal bioreattore automatizzato su microscala mediante cromatografia liquida a proteine veloci consente la caratterizzazione degli attributi critici di qualità delle proteine purificate con vari metodi analitici a valle, come dimostrato. I dati n-glicani provenienti da anticorpi monoclonali prodotti dall'ovaio del criceto cinese elaborati dalla spettrometria di massa dovrebbero apparire simili a questi cromatogrammi rappresentativi.
La cromatografia ad esclusione di dimensioni scattering di luce ad angolo multiplo può essere utilizzata per valutare il profilo di aggregazione e il peso molecolare dell'anticorpo. La piccola quantità di campione e l'importanza dell'aggregazione sono attributi di qualità critici per rendere questa tecnica uno strumento analitico complementare altamente prezioso al sistema di microbioreattori automatizzati. Il risultato dell'elettroforesi a zona micro capillare è un elettroferogramma e può essere utilizzato per mostrare il profilo della variante di carica per un anticorpo monoclonale, una firma unica per la proteina studiata che è altamente sensibile al pH operativo.
Il consumo di amminoacidi può anche essere monitorato per determinare se l'esaurimento causa cambiamenti negli attributi critici di qualità dell'anticorpo. È importante garantire una corretta ed efficiente purificazione del prodotto fabbricato, poiché le fasi analitiche possono essere eseguite solo con una proteina adeguatamente purificata. Il prodotto può anche essere sottoposto a mappatura peptidica e test di stabilità.
Ma una volta che la proteina è stata utilizzata per un metodo di caratterizzazione, in genere non può essere utilizzata per un altro. Queste tecniche consentono l'analisi di prodotti prodotti da piattaforme di screening del bioprocesso di piccolo volume e ad alta produttività per comprendere l'influenza dei parametri di biolavorazione sulla qualità del prodotto. Alcune di queste tecniche utilizzano acido perclorico concentrato, acido formico, N-dimetilformamide, che sono tutti pericolosi e devono essere maneggiati con cura mentre si indossano i dispositivi di protezione adeguati.
