Questo metodo può aiutarci ad affrontare le questioni chiave relative al ruolo delle vescicole extracellulari in vivo, fornendoci una fonte di vescicole rappresentative del microambiente tissutale locale. Gli studi sulle vescicole extracellulari all'interno dell'ambiente tissutale possono promuovere la nostra comprensione dei ruoli fisiologici delle vescicole extracellulari e delle loro alterazioni nei processi fisiopatologici in vivo. Una dimostrazione visiva della cannula della vena portale è utile in quanto le piccole dimensioni della vena rendono difficile girare manipolare.
A dimostrare la procedura con il dottor Kaori Ishiguro sarà Irene Yan, una tecnologa di ricerca del mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura, fissare gli arti di un topo anestetizzato e collegare l'ago calibro 23 di una raccolta di sangue alato impostata all'estremità libera di un pezzo di tubi di pompa per siringhe. Pulire la pelle addominale del topo con il 70% di etanolo e un tampone alcolico e utilizzare le forbici per aprire il mouse dalla parte anteriore del torace all'osso pelvico, facendo attenzione a non danneggiare gli organi interni.
Utilizzare un applicatore con punta di cotone per spostare delicatamente l'intestino sul lato destro della cavità addominale per esporre la vena del portale e la vena cava inferiore e utilizzare forcep curve per posizionare un filo sotto la vena del portale. Legare un nodo liberamente nella sutura per prepararsi a stringere dopo la cannula e riempire la cannula con 40 gradi Celsius HBSS fino a quando la soluzione raggiunge la punta dell'ago della cannula. Inserire la cannula nella vena porta da cinque a 10 millimetri sotto la legatura e fissare la cannula con la sutura.
Iniziare l'infusione con una portata da uno a due millilitri al minuto. Se la cannula è stata posizionata correttamente, il fegato inizierà a sbiancarsi. Tagliare la vena cava inferiore e lasciare drenare il liquido eccessivo all'interno del fegato.
Aumentare lentamente la portata a otto millilitri al minuto fino a quando un intero 50 millilitri di HBSS è stato perfuso attraverso il fegato nei prossimi cinque minuti. Poco prima che l'HBSS si esaurisa, cambiare la soluzione di collagenasi a 40 gradi Celsius appena preparata al becher perfusato e utilizzare le flessione per applicare una pressione transitoria alla vena cava inferiore a cinque secondi intervalli per far gonfiare il fegato e aiutare con la digestione e la dissociazione dei tessuti. Man mano che la digestione progredisce, il fegato si gonfierà e diventerà bianco.
Quando il rimane depresso dopo un delicato sondaggio con un applicatore con punta di cotone, arrestare la pompa e rimuovere la cannula. Rimuovere la cistifellea dal fegato, facendo attenzione a non strappare il tessuto della cistifellea e utilizzare forbici e forcelle pulite per raccogliere il fegato in un piatto sterile da coltura di 10 centimetri di PBS. Dopo un lavaggio delicato, trasferire il fegato in un nuovo piatto di coltura di 10 centimetri contenente soluzione fresca di collagenasi quattro e utilizzare due forcelle pulite per strappare il fegato mentre si trema delicatamente per dissociare le cellule dal tessuto epatico.
Quando l'intero organo è stato frammentato, utilizzare una siringa da tre millilitri per triturare i liquami tissutali fino a quando i pezzi di fegato non digeriti non vengono scrollati di mente. Versare la soluzione cellulare risultante attraverso un colino in rete di nylon da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri, lavando il piatto con HBSS per raccogliere eventuali cellule rimanenti. Mettere in comune il lavaggio con la sospensione a cella singola e rimuovere gli epatociti per centrifugazione.
Quindi trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 50 millilitri. Per rimuovere qualsiasi altra cellule, centrifugare il supernatante prima di trasferirlo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Rimuovere le cellule morte con un'altra centrifugazione e trasferire il supernatante in un tubo a fondo rotondo per rimuovere eventuali detriti cellulari e aggregati.
Ora trasferisci il supernatante in un tubo ultra centrifuga in policarbonato e rimescola il pellet in circa 20 millilitri di PBS per una seconda e ultima ultra centrifugazione. Quindi rimostrare il pellet di nanovesicola extracellulare in un millilitro di PBS per meno 80 gradi Celsius di stoccaggio se le vescicole non verranno immediatamente analizzate. Da un singolo fegato di topo, questo metodo produce una concentrazione di vescicola extracellulare tissutale che varia da 1,74 a quattro volte 10 al dodicesimo con una media di 3,46 per 10 alla dodicesima particella per millilitro come determinato dall'analisi di tracciamento delle nanoparticelle.
La dimensione media delle vescicole extracellulari del tessuto epatico isolato è di 157,7 nanometri con una dimensione della modalità di 144,5 nanometri e dimensioni delle vescicole extracellulari che vanno da 100 a 600 nanometri mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Le vescicole extracellulari isolate utilizzando questo approccio sono adatte per applicazioni a valle e l'ulteriore caratterizzazione può includere valutazioni morfologiche mediante elettromicroscopia o analisi dei loro marcatori superficiali o contenuto.
