يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية المتعلقة بدور الخلايا خارج الخلية في الجسم الحي ، من خلال توفير مصدر للحرفيات التي تمثل البيئة المجهرية الأنسجة المحلية. دراسات من حوريات خارج الخلية داخل محيط الأنسجة يمكن أن تزيد فهمنا للأدوار الفسيولوجية من الخلايا خارج الخلية والتغيرات في العمليات الفيزيولوجية في الجسم الحي. مظاهرة بصرية من الوريدي المدخل مفيد كما صغر حجم الوريد يجعل من الصعب تحويل التلاعب.
إظهار الإجراء مع الدكتور كاوري إيشيغورو سيكون إيرين يان، أخصائية تقنية بحثية من مختبري. قبل البدء في العملية، وتأمين أطراف فأر تخدير وتوصيل إبرة قياس 23 من مجموعة الدم المجنح تعيين إلى نهاية حرة من قطعة من أنابيب مضخة حقنة. تنظيف جلد البطن من الماوس مع 70٪ الإيثانول ومنصة الكحول واستخدام مقص لفتح الماوس من الجزء الأمامي من الصدر إلى عظم الحوض، مع الحرص على عدم تلف أي الأعضاء الداخلية.
استخدام القطن يميل قضيب لنقل بلطف الأمعاء إلى الجانب الأيمن من تجويف البطن لفضح الوريد المدخل وسفاح الوريد السفلي واستخدام ملقط منحنية لوضع موضوع تحت الوريد المدخل. ربط عقدة فضفاضة في الغرزة للتحضير لcinnching بعد التكبوس وملء القنية مع 40 درجة مئوية HBSS حتى الحل يصل إلى طرف إبرة القنية. أدخل القنية في الوريد المدخلي من خمسة إلى 10 ملليمترات تحت الرباط وأضمن القنية مع الغرزة.
بدء ضخ بمعدل تدفق 1-2 ملليلتر في الدقيقة. إذا تم وضع الكنبة بشكل صحيح، سيبدأ الكبد في التبييض. قطع الكافا الوريدي السفلي والسماح للسوائل المفرطة داخل الكبد لاستنزاف.
زيادة معدل التدفق ببطء إلى ثمانية ملليلتر في الدقيقة حتى تم غرس 50 ملليلتر كامل من HBSS من خلال الكبد على مدى الدقائق الخمس المقبلة. قبل أن ينفد HBSS، وتغيير أعدت حديثا 40 درجة مئوية الكولاجين حل أربعة إلى befusate منقار واستخدام ملقط لتطبيق ضغط عابر على الكافا فينا السفلية على فترات ثانية خمس للتسبب في تضخم الكبد والمساعدة في هضم الأنسجة والتفكك. كما تقدم الهضم، سوف تنتفخ الكبد وتصبح بيضاء.
عندما يبقى الاكتئاب بعد التحقيق لطيف مع قضيب القطن يميل، ووقف المضخة وإزالة القنية. إزالة المرارة من الكبد، مع الحرص على عدم تمزيق أنسجة المرارة، واستخدام مقص نظيفة والملقط لحصاد الكبد في طبق ثقافة معقمة 10 سم من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل اللطيف، قم بنقل الكبد إلى طبق ثقافة جديد طوله 10 سنتيمترات يحتوي على محلول كولاجيناز طازج أربعة واستخدم ملقطين نظيفين لتمزيق الكبد أثناء الهز بلطف لفك الخلايا عن أنسجة الكبد.
عندما يكون العضو بأكمله مجزأً، استخدم حقنة ثلاثة ملليلتر لتتريك ملاط الأنسجة حتى تهتز قطع الكبد غير المهضومة. صب حل الخلية الناتجة من خلال 70 ميكرون مصفاة شبكة النايلون في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وغسل الطبق مع HBSS لجمع أي الخلايا المتبقية. تجمع غسل مع تعليق خلية واحدة وإزالة خلايا الكبد عن طريق الطرد المركزي.
ثم نقل المناط إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر. لإزالة أي خلايا أخرى، الطرد المركزي المافق قبل نقله إلى أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر. إزالة الخلايا الميتة مع طرد مركز آخر ونقل عظمى في أنبوب مستدير القاع لإزالة أي حطام الخلية والمجاميع.
الآن نقل فائقة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي فائقة البولي وإعادة فرض بيليه في حوالي 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني للطرد المركزي للغاية الثانية والأخيرة. ثم resuspend بيليه النانوفيسيل خارج الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني للتخزين ناقص 80 درجة مئوية إذا لم يتم تحليل الفينات على الفور. من كبد فأر واحد، تعطي هذه الطريقة تركيز الأنسجة خارج الخلية الذي يتراوح بين 1.74 إلى أربع مرات 10 إلى الثاني عشر مع متوسط 3.46 مرة 10 إلى الجسيمات الثانية عشرة لكل ملليلتر كما يحددها تحليل تتبع الجسيمات النانوية.
متوسط حجم أنسجة الكبد المعزولة خارج الخلية هو 157.7 نانومتر مع حجم وضع 144.5 نانومتر وأحجام من الخلايا خارج الخلية تتراوح بين 100 إلى 600 نانومتر من خلال تحليل تتبع الجسيمات النانوية. إنَّ الحوَيَّات الخارجة عن الخلية التي يتم عزلها باستخدام هذا النهج هي مناسبة للتطبيقات المصبّية، وقد يشمل التوصيف الإضافي تقييمات مورفولوجية عن طريق التنظير الكهربائي أو تحليل علامات سطحها أو محتواها.
