Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti il ciclo biogeochimico del cadmio e del mercurio, ad esempio come le diverse variabili ambientali influenzano la loro biodisponibilità ai batteri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre dati di biodisponibilità quasi in tempo reale e cellule vitali indipendentemente dalla presenza di ossigeno. Generalmente le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà perché ci sono molti passaggi sensibili al tempo che richiedono un'attenzione molto meticolosa ai dettagli.
A dimostrare la procedura sarà Ben, uno studente laureato del mio laboratorio. Per prepararsi al saggio, recuperare il biosensore induttibile al mercurio e il biosensore espresso in modo costitutivo da un porcile criogenico di meno 80 gradi Celsius. Placcare le cellule su piastre di brodo di lisogenia contenenti 120 microgrammi per millilitro di ampicillina.
Far crescere le colture di piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. Tra le 16:30 e le 17:00.m. inoculare una coltura in dieci millilitri di LB con ampicillina e crescere durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min.
Tra le nove e le dieci .m la mattina successiva portare la cultura e il mezzo di crescita precedentemente preparato nella camera anaerobica. Quindi aggiungere otto millilitri di mezzo di crescita fresco e 210 microgrammi per millilitro di ampicillina in un tubo di balsamo sterile.
Ora raccogli due millilitri della coltura coltivata durante la notte e trasferisci in un tubo di micro centrifuga a due millilitri. Dopo aver centrifugato a 10.000 RCF per 90 secondi, rimuovere il supernatante e rimescolare in due millilitri di mezzo di crescita fresco. Quindi aggiungere la coltura rimorsiata al tubo di balsamo contenente otto millilitri di mezzo di crescita fresco e ampicillina.
Utilizzando una tecnica sterile, posizionare con cura un tappo di gomma sul tubo di balsamo prima di rimuoverlo dalla camera anaerobica. Quindi posizionare il tubo in un'incubatrice e crescere anaerobically a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min. Tra le tre e le cinque p.m.
portare il tubo di balsamo con la coltura, un nuovo tubo di balsamo sterile e il mezzo di crescita nella camera anaerobica. Aggiungere 100 microlitri della coltura a 10 millilitri di mezzo di crescita fresco con ampicillina nel tubo di balsamo sterile. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare con cura un tappo di gomma sul tubo di balsamo.
Rimuovere il tubo dalla camera anaerobica prima di coltivarlo durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min. Tra le nove e le .m giorno successivo, trasferire la cultura e il mezzo di crescita alla camera anaerobica.
Aggiungere nuovamente otto millilitri di mezzo di crescita e ampicillina in un tubo di balsamo sterile. Trasferire due millilitri della coltura coltivata durante la notte in un tubo di micro centrifuga a due millilitri. Dopo la centrifugazione come prima, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in due millilitri di mezzo di crescita fresco.
Quindi aggiungere la coltura rimorsiata al tubo di balsamo contenente il mezzo di crescita fresco e l'ampicillina. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare con cura un tappo di gomma sul tubo di balsamo. Rimuoverlo dalla camera e crescere anaerobically a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min.
Monitorare la crescita della coltura utilizzando uno spettrofotometro vortice la coltura e quindi misurare la densità ottica a 600 nanometri o OD600. Dopo tre o quattro ore di crescita prevista, la cultura dovrebbe raggiungere un OD600 di 6. Ora porta il tubo nella camera anaerobica e trasferisci la coltura in due tubi di micro centrifuga a due millilitri.
Dopo la centrifugazione come prima rimuovere il supernatante e rimescolare ogni palato cellulare in due millilitri di mezzo di esposizione fresca. Ripetere questa fase di lavaggio una volta per rimuovere qualsiasi traccia del mezzo di crescita. Ora combina entrambi i tubi di micro centrifuga della coltura cellulare in una fiala standard PTFE da sette millilitri per ottenere il materiale del biosensore da utilizzare nel saggio di esposizione.
Prima di iniziare l'esperimento controllare il monitor anaerobico per assicurarsi che non vi sia ossigeno nella camera anaerobica. Progettare il layout della piastra secondo un modello di pozzo 96. Per eseguire esperimenti in repliche tecniche di tre questo consentirà 32 trattamenti diversi, che è meglio rappresentato con una griglia quattro per otto per impostare le fiale.
Impostare la griglia quattro per otto in base al layout della piastra di dosaggio. Quindi posizionare sette flaconcini standard PTFE millilitro nel vassoio. Le fiale devono essere gestite solo manipolando l'esterno del flaconcino.
Aggiungere il volume medio di esposizione in ogni flaconcino corrispondente a ciascun trattamento. Ad ogni flaconcino aggiungere il volume corrispondente della variabile chimica da testare in base alla disposizione della piastra. Ora aggiungere nitrato a ogni flaconcino in modo che la concentrazione sia di 200 micromolari.
Escludere questo passaggio per gli spazi vuoti costitutivi per il trattamento del biosensore. Per aggiungere mercurio alle fiale, prima prendi il titolo da quattro a otto micromolare e scuoti bene. Diluire la soluzione e il mezzo di esposizione in una fiala PTFE da sette millilitri a una concentrazione da 100 a 250 nanomolare per creare una soluzione di mercurio funzionante.
Da questa soluzione di lavoro, aggiungere mercurio alle fiale richieste in base al layout della piastra. Dopo aver aggiunto il mercurio o il cadmio scuotere manualmente la piastra in un moto orbitale. L'esperimento può essere messo in pausa ora a seconda del tempo necessario al mercurio o al cadmio per speciare in soluzione.
Quando l'esperimento viene ripreso, pipettare delicatamente il materiale del biosensore di pipette avanti e indietro per garantire l'omogeneità. Quindi aggiungere 100 microlitri del materiale biosensore a ogni fiala e scuotere manualmente la piastra come prima. Riscaldare il lettore di lastre a 37 gradi Celsius e impostare una corsa cinetica per dieci ore con letture ogni due punti da cinque a cinque minuti.
Uno scuotimento orbitale tra una lettura e l'altro. Impostare la corsa per effettuare misurazioni della fluorescenza con un'eccitazione a fluorescenza di 440 nanometri e un'emissione di 500 nanometri. Ora pipetta 200 microlitri da ogni flaconcino PTFE nella griglia quattro per otto nei pozzi corrispondenti della piastra del pozzo 96.
Pipetta avanti e indietro cinque volte prima di trasferire ogni 200 microlitri. Anziché scartare la punta della pipetta, lasciare la punta della pipetta nel flaconcino PTFE per tenere traccia dell'avanzamento della pipetta. Posizionare la piastra del pozzo 96 nel vassoio del lettore di lastre.
Quindi posizionare il coperchio sulla piastra del pozzo 96 e iniziare il saggio. Ecco i risultati rappresentativi che mostrano i dati corretti sulla fluorescenza in funzione del tempo. La fluorescenza è mostrata con concentrazioni crescenti di mercurio al biosensore indutbile.
Tutti i valori sono vuoti per il controllo no mercury. I picchi fluorescenti possono essere quantificati per mostrare il segnale fluorescente in funzione della concentrazione di mercurio o cadmio. Sia per i biosensori induttibili che per i biosensori costitutivi, la concentrazione di mercurio o cadmio al centro dell'intervallo lineare dei sensori induttibili deve essere utilizzata per le variabili di prova.
Ecco esempi di un risultato inconcludente con lo zinco. E un risultato conclusivo con magnesio e manganese sulla biodisponibilità di mercurio al biosensore. Il risultato con lo zinco è inconcludente perché la fluorescenza costitutiva decade con fluorescenza induttiva che indica tossicità.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di inserire le concentrazioni di cadmio o mercurio in quanto queste verranno utilizzate per calibrare il biosensore. Seguendo questa procedura, altri metodi come la modellazione termodinamica dei sistemi acquosi possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come specifiche specie chimiche di mercurio o cadmio influenzano la loro biodisponibilità. Non dimenticare che lavorare con cadmio e mercurio e acidi forti come l'acido solforico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
Dopo il suo sviluppo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia ambientale per esplorare il mercurio anaerobico quasi in tempo reale o la biodisponibilità di cadmio e i microbi geneticamente trattabili.
