Questo lavoro è stato supportato dalla concessione R01AI118694 NIH di Michael R. Betts, che include Sub-premio 566950 a Yuri Sykulev. Ringraziamo la Sidney Kimmel Cancer Center bioimmagini ha condiviso risorsa per il loro sostegno eccellente.

Questo studio è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki. Consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti, e campioni di sangue e di linfonodo sono stato acquistati con l'approvazione del Comitato di revisione istituzionale presso l'Università della Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Tutti i soggetti umani erano adulti. I campioni di sangue del cordone sono state gentilmente concesse da travaglio e il parto del reparto di Ostetricia & Ginecologia presso la Thomas Jefferson University. Tutti i campioni sono stati de-identificati.
1. isolamento di CD4+ T cellule per un'analisi di immagine
<ol><li>
Scongelare un'aliquota da 1 mL contenente 10 cellule mononucleari del sangue periferico7 congelati (PBMCs) o cellule mononucleari di linfonodo (LNMCs) da campioni raccolti. In una cappa sterile, è necessario aggiungere le cellule scongelate a 9 mL di RPMI completate con penicillina/streptomicina e glutammina.
	<ol>
<li>Centrifugare le cellule per 10 min a 300 x g a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 mL di RPMI supplementato contenente 10% FBS (sostanza completa). Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a CO2 a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno successivo, purificare CD4+ T cellule immunomagnetica negativa l'ordinamento utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Per misurare il numero di CD4 appena purificato+ T cellule, mescolare 5 µ l di sospensione cellulare con un volume uguale di una soluzione di blu di trypan. Caricare un emocitometro con un cellulare-trypan blu miscela e contare le cellule vive all'interno delle 5 sezioni dell'emocitometro.</li>
	<li>Prendere la media del numero delle cellule e determinare il numero di cellule in sospensione delle cellule originali: il numero di cellule/1 mL = conteggio medio x 2 x 104. Se il numero totale di cellule isolate è troppo piccolo, è possibile utilizzare le celle come è senza contare.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min e risospendere in un buffer di analisi (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2mm Na2HPO4, 5mm D-glucosio, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2mm CaCl2e 1% di albumina sierica umana) 105 < /C13 > cellule/50 µ l o meno e mantenere le cellule a 4 ° C (per 1 – 2 h) fino all'uso negli esperimenti.</li>
	<li>Smaltire tutti i rifiuti biologici secondo le pertinenti linee guida istituzionali.</li>
	<li>Se si desidera come una popolazione delle cellule di controllo, preparare le cellule T CD8 attivate da sangue cordonale PBMC, posto 107 cellule in 5 mL di terreno completo in un matraccio di cultura T25 coperto con una miscela di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 a 10 µ g/mL e 1 µ g/mL , rispettivamente.</li>
	<li>Il giorno successivo, rimuovere le cellule del sangue di cordone attivato dalla beuta, lavarli 1x con freschi completare medio ed espandere le cellule in presenza di IL-2 ricombinante (100 U/mL) per 2 settimane.</li>
	<li>Purificare il sangue del cordone ombelicale CD8+ T cellule immunomagnetica negativa l'ordinamento utilizzando il kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore. Contare le celle e scambiare i media per il tampone, come descritto nei passaggi 1.3-1.6 per LN e PB CD8+ T cellule.</li>
</ol>2. i componenti per la preparazione della lipidici planare
<ol><li>Preparare 3 tipi di liposomi come descritto altrove5: (a) 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glicero-3-fosfocolina) liposomi, (b) 0,4 mM DOPC liposomi 33% in moli cani-NTA (1,2-dioleoyl -sn- glicero - 3-[(N-(5- ammino-1-carboxypentyl) acido iminodiacetic) succinil] (sale di ammonio)) lipidi, (c) 0,4 mM DOPC liposomi contenenti 4 mol % biotynil-Cap-PE (1,2-dioleoyl -sn- glicero-3-phosphoethanolamine - N-(cap biotynil) (sale di sodio)).</li>
	<li>
Preparare soluzione 5% caseina come descritto in precedenza5.
	<ol>
<li>Sciogliere 5 g di polvere di caseina in 100 mL di acqua ultrapura e 350 µ l di 10 M di idrossido di sodio. Mescola il tutto su un agitatore magnetico regolare a bassa velocità secondo la scala disponibile, a temperatura ambiente per 2 h e quindi durante la notte a 4 ° C. Regolare il pH a 7.3 e ultracentrifuga la soluzione per 2 h a 100.000 x g a 4 ° C. Filtrare il surnatante con un filtro sterile da 0,22 µm e conservare la soluzione in aliquote a-80 ° C. Attenzione: la soluzione di idrossido di sodio può causare ustioni chimiche e può indurre cecità permanente al contatto con gli occhi. Utilizzare guanti di gomma, indumenti di sicurezza e protezione degli occhi durante la manipolazione di questo prodotto chimico o le relative soluzioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Anticorpo anti-CD3 di etichetta con biotina per produrre molecole di anticorpo mono-bionylated con un approccio descritto in precedenza8.
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di biotina-PEO4-NHS in dimetilsolfossido (DMSO) a 0,1 mg/mL. Aggiungere 3,7 µ l della soluzione di biotina-PEO4-NHS a 1 mg di anticorpo in 0,5 mL di tampone fosfato salino (PBS) contenente bicarbonato di sodio 100 mM.</li>
		<li>Incubare la miscela per 2 h a temperatura ambiente. Preparare una soluzione di estere di Alexa Fluor 488 NHS a 10 mg/mL in DMSO. Aggiungere la soluzione di Alexa Fluor 488 NHS estere per l'anticorpo marcato da biotina-PEO4-NHS presso un eccesso molare 10 volte.</li>
		<li>Incubare la miscela per 1 h a temperatura ambiente con agitazione lenta su un agitatore magnetico regolare. Separare il colorante non associato mediante cromatografia di esclusione dimensionale.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di anticorpi misurando la densità ottica della soluzione dell'anticorpo a 280 nm (A280). Misurare la densità ottica degli anticorpi con etichettati a 577 nm (un577).</li>
		<li>Determinare il rapporto di tintura-a-anticorpo usando la seguente equazione: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58143/58143eq1.jpg"> Nota: Trovare ulteriori dettagli nel protocollo del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esprimono una proteina ricombinante di ICAM-1 solubile in un sistema di espressione di Drosophila come descritto in precedenza3,4,9,10.
	<ol>
<li>Clone, con cDNA encoding, il ectodomain di ICAM-1 in Drosophila espressione vettoriale pMT/V5-His con un promotore inducibile metallotioneina per produrre una proteina ricombinante aggiunta con una sua etichetta6 all'estremità C-terminale.</li>
		<li>Co-transfect cellule S2 con il plasmide contenente risultante di ICAM-1 e un vettore di espressione G418. Selezionare trasfettanti stabili utilizzando supporti di Drosophila di Schneider completati con 10% siero fetale di vitello (FCS) e 0,5 mg/mL di G418 per 3 settimane. Espandere le cellule in medium senza siero insetto e indurre un'espressione della proteina con 0,5 mM di CuSO4 per 3 d.</li>
		<li>Concentrarsi sulla cultura surnatante x 10 e Dializzare contro PBS tramite un concentratore di flusso tangenziale come descritto in precedenza11.</li>
		<li>Applicare il surnatante della cultura concentrata a una colonna contenente Sepharose con un anticorpo monoclonale anti-ICAM-1 in covalenza immobilizzato ed eluire l'ICAM-1 associato con un tampone di glicina 50 mM, pH 3.0. Immediatamente neutralizzare la proteina di ICAM-1 eluita con un tampone di Tris di 2 M, pH 8.0.</li>
		<li>Dializzare il materiale contro PBS, pH 8.0 e aggiungere il materiale dializzato a una colonna contenente Ni-NTA dell'agarosi. Eluire ICAM-1 solubile con imidazolo di 200 mM, pH 8.0. Dializzare il materiale contro un tampone PBS, pH 8.0.</li>
		<li>Etichettare l'ICAM-1 purificata con estere NHS Cy5 secondo le istruzioni del fabbricante. Nota: Il miglior rapporto finale della tintura--proteina è 1:1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fab di produrre frammenti da un anticorpo anti-CD107a di digestione di papaina e purificare il Fab frammenti mediante cromatografia a scambio ionico come descritto in precedenza3. Etichetta il Fab frammenti con estere di Alexa Fluor 568 NHS secondo le istruzioni del fabbricante.</li>
</ol>3. formazione di vetro-supportati planare lipidici
<ol><li>Preparare una soluzione piranha acida fresca con 140 mL di acido solforico concentrato e 60 mL di perossido di idrogeno 30%. Lavare i vetrini coprioggetti per le diapositive di flusso da li ammollo nella soluzione acida piranha per 30 min. Hold il vetrino coprioggetti con una pinza a forbice in polipropilene. Attenzione: La soluzione Piranha è un ossidante molto forte. Ricordarsi di indossare occhiali di sicurezza o occhiali di protezione o uno scudo integrale con guanti di gomma spessa in ogni momento mentre si maneggia la soluzione. Funzionano solo con soluzione piranha sotto cappa aspirante. Evitare il riscaldamento, trasporto o scuotendolo in qualsiasi momento durante l'uso, perché potrebbe esplodere. Raccogliere i rifiuti di piranha in una bottiglia di vetro con un buco contenenti piombo. Contattare il Comitato istituzionale di sicurezza circa l'utilizzo corretto dei rifiuti.</li>
	<li>
Sciacquare i coprioggetti lavati 7 x con acqua ultrapura trasferendoli in sequenza nel becher contenente acqua fresca. Set lamelle bagnate da parte per lasciare che il restante acqua rotolare fuori il vetro pulito, lasciando il vetro asciutto.
	<ol>
<li>In alternativa, è possibile utilizzare un puntale attaccato ad una pompa di vuoto per rimuovere accuratamente le gocce d'acqua rimanenti da lamelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nella cappa sterile, eseguire diluizioni dei vari lipidi per produrre il mix di liposomi per fare strati lipidici. In primo luogo, combinare 37 µ l di liposomi DOPC e 3 µ l di liposomi biotynil-Cap-PE. In secondo luogo, mix 14 µ l di liposomi DOPC e 15 µ l di liposomi di cani-NTA. In terzo luogo, aggiungere 1 µ l della miscela prima a 29 µ l della miscela seconda per fabbricare la miscela finale liposoma.</li>
	<li>
Nella cappa sterile, impostare un'area di lavoro con vetrini coprioggetti asciutti nelle vicinanze. Aliquotare 2 µ l della miscela finale liposoma (Vedi punto 3.3) proprio nel centro di un canale di diapositiva autoadesiva. Immediatamente e molto precisamente allineare un coprioggetto pulito e asciutto con la diapositiva e abbassare delicatamente il vetrino coprioggetto sul lato appiccicoso della diapositiva.
	<ol>
<li>Se preparare più di una diapositiva, lavorare su una diapositiva alla volta poiché la miscela del liposoma evapora rapidamente. Capovolgere la diapositiva e utilizzare l'anello esterno del forcipe forbice in polipropilene per applicare una leggera pressione al contatto periferico del coprivetrino con lo scivolo, assicurandosi che lo slittamento è strettamente collegato alla diapositiva per escludere perdite. Nota: Non premere contro i canali della diapositiva per evitare la rottura o fessurazione il vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Capovolgere nuovamente la diapositiva e segnare la posizione del bilayer formata, che assomiglia ad una goccia tra il vetrino coprioggetto e lo scivolo di canale, da disegno 4 punti con un pennarello indelebile intorno il bilayer sul lato slitta esterna dell'Assemblea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prima la prima iniezione di un liquido nel canale, è necessario designare una porta del canale come la porta di entrata e l'altro come la porta di uscita e mantenere questa designazione in tutto l'esperimento.</li>
	<li>Per evitare la formazione di bollicine, inserire l'estremità della punta della pipetta direttamente la porta di entrata del canale. Riempire lentamente i canali della diapositiva con 50 µ l di caldo (temperatura ambiente di almeno) tampone del saggio (Vedi punto 1.5 per la composizione di buffer).</li>
	<li>Preparare una soluzione di cloruro di nickel 0,5 M. Scongelare un'aliquota di 2 mL di soluzione di caseina in un bagno di acqua a 37 ° C per 30 min e integrarla con una soluzione di cloruro di nichel ad una concentrazione finale di 200 µM.</li>
	<li>Lavare il bilayer prima iniezione di 100 µ l della soluzione di caseina nella porta di entrata del canale e quindi immediatamente rimuovendo 100 µ l fuori la porta di uscita sulla diapositiva di pipettaggio. Bloccare il bilayer con la stessa soluzione da iniettare 100 µ l della soluzione caseina la porta di ingresso di ciascun canale e incubando il vetrino per 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Disgelare aliquote di Cy5-ICAM-1-His proteine6 e streptavidina. Combinare le proteine nel tampone alla concentrazione finale di 2 µ g/mL. Centrifugare la soluzione per 30 min a 20.000 x g e a 4 ° C per rimuovere qualsiasi aggregazione.</li>
	<li>Rimuovere il resto della soluzione bloccante dalla porta di uscita del canale diapositiva pipettando. Iniettare 100 µ l di soluzione contengono ICAM-1 e streptavidina alla porta di ingresso.</li>
	<li>Incubare il vetrino per 45 min a temperatura ambiente. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione della proteina della porta di uscita. Lavare il bilayer 2 x prima iniezione di 100 µ l di tampone di dosaggio nella porta di entrata del canale e quindi immediatamente rimuovendo 100 µ l fuori la porta di uscita.</li>
	<li>Diluire un anticorpo anti-CD3 Alexa-Fluor-488-etichettati con il tampone di dosaggio a una concentrazione finale di 2 µ g/mL. Iniettare 100 µ l di soluzione di anticorpo alla porta di entrata della diapositiva e incubare per 45 min a temperatura ambiente. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione della proteina della porta di uscita. Lavare il bilayer 2 x con 100 µ l di tampone di dosaggio come descritto al punto 3.11.</li>
</ol>4. imaging dell'interazione cellule T con il Bilayer planare
<ol><li>
Preriscaldare la fase e l'obiettivo di un microscopio a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale o confocale fino a quando la temperatura è equilibrata a 37 ° C. Impostare la diapositiva con il bilayer(s) sul piatto riscaldato. Spostare il palco in una posizione appropriata secondo i segni di inchiostro e concentrarsi sul bilayer impiegando la fluorescenza di molecole ICAM-1 Cy-etichettati.
	<ol>
<li>Utilizzare un obiettivo X 61 per il microscopio confocale, o un obiettivo 100x per il microscopio TIRF, con le impostazioni di filtro appropriato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per granello release formazione immagine di microscopia TIRF, aggiungere Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a frammenti di anticorpo Fab alla sospensione di cellule ad una concentrazione finale di 4 µ g/mL prima di iniettare le cellule nelle porte di entrata.
	<ol>
<li>Risospendere il CD4 preparato+ T cellule isolate da LN o PB o cavo di alimentazione del sangue e iniettare 50 µ l di sospensione cellulare nella porta di entrata del canale diapositiva contenente il bilayer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scegliere il numero desiderato di campi e registrare le immagini di ogni campo 1 x ogni 2 min per 30 min dopo l'iniezione.</li>
	<li>Sfruttare il campo chiaro, riflessi luce fluorescente canali e (Alexa 488 e Cy5) del microscopio confocale per acquisire le immagini. Utilizzare la modalità TIRF per fluorescenza Alexa-Fluor-488 e Alexa-Fluor-568 e widefield per Cy5 fluorescenza, come pure il campo chiaro imaging, il microscopio di TIRF.</li>
</ol>5. image Analysis
<ol><li>Analizzare le immagini acquisite utilizzando il software appropriato. Osservare la morfologia delle cellule in immagini di luce trasmesse ed Escludi cluster e visibilmente danneggiati o cellule apoptotiche dall'analisi. Includere nell'analisi solo quelle cellule che interagiscono in modo produttivo con la superficie di doppio strato (cioè, Alexa-Fluor-488 fluorescenza (anticorpi anti-CD3) all'interfaccia di accumulo delle cellule).</li>
	<li>Determinare la dimensione della zona di adesione delle cellule a 20 min dopo l'inizio dell'interazione cellula-doppio strato. Nota: L'area di adesione è l'area scura sviluppato all'interfaccia cellula-doppio strato sulle immagini di microscopia (IRM) riflessione di interferenza.</li>
	<li>Osservare eventuali accumuli di fluorescenza di Cy5-ICAM-1 e una formazione di anello di giunzione segregata Cy-ICAM-1 molecole all'interfaccia cellula-doppio strato. Se accumulate ICAM-1 molecole formano un anello di giunzione adesione su almeno due immagini consecutive, designare tali cellule come le cellule in via di sviluppo una periferica d'attivazione supramolecolari cluster (pSMAC)12.</li>
	<li>Valutare la versione di granulo misurando l'intensità della fluorescenza di Alexa-Fluor-568 all'interfaccia cellula T-doppio strato sopra la fluorescenza di fondo fuori l'area di contatto in prossimità della cella. Designare le cellule con un rapporto di Alexa-Fluor-568 segnale--fondo di almeno 1,3 come cellule degranulating.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La nuova tecnica descritta qui utilizza simili reagenti necessari per costruire bilayer planare in flusso convenzionale cella5 e può essere applicata con successo per eseguire l'imaging del primario umano delle cellule T – doppio strato interfacce3,4 ,15. La tecnica offre una significativa riduzione nell'uso di molecole fluorescenti e richiede 10-20 volte meno cellule di T rispetto ad un flusso cellulare sistema5, creando la possibilità di analizzare cellule T umane primarie da sangue e altri tessuti.
Il numero di cellule iniettate utilizzato in questo studio ci ha permesso di immagine circa 50 cellule per campo con un obiettivo 60x dell'imaging. Una concentrazione più grande ha provocato l'aggregazione delle cellule, riducendo il numero di cellule per l'analisi. Abbiamo potuto ridurre ulteriormente il numero delle cellule iniettate 10 – 50 x, ma il limite inferiore di numero delle cellule dipende dalla eterogeneità cellulare, al numero di campi di imaging e sul disegno sperimentale. Alcuni ricercatori hanno usato in precedenza bilayer costruito in una camera aperta con un fondo di vetro che ha richiesto un numero simile di cellule per analisi16. Tuttavia, il sistema chiuso descritto qui, con un'altezza di canale di 0,1 - 0,4 mm, consente per sedimentazione rapida delle cellule sincronizzare il collegamento delle cellule e l'analisi della risposta delle cellule T senza il rischio di evaporazione del liquido. Ulteriormente il sistema di appiccicoso scivolo permette la formazione di fino a tre strati lipidici per canale. Così, lo stesso campione di cella potrebbe essere utilizzato per l'analisi del comportamento delle cellule su doppii strati distinti con una composizione diversa degli stimolatori, l'adesione e molecole di costimolazione.
Dovrebbero essere prese alcune precauzioni durante l'Assemblea delle diapositive appiccicosi e lamelle per una formazione di successo doppio strato. In particolare, le lamelle devono essere completamente asciutte, come anche una piccola quantità di liquido lasciato sulla superficie del vetro potrebbe provocare fuoriuscite di liquido durante il bilayer procedura di lavaggio. Cosa importante, è essenziale anche per il coprioggetto associato ai bordi del contatto con l'anello esterno del forcipe forbice in polipropilene per evitare perdite (come descritto al punto 3.4.1). È inoltre importante evitare qualsiasi gorgogliare nelle porte di entrata dei canali. Se tutte le bolle di entrare in un canale, sono quasi impossibili da rimuovere e rovinare il bilayer nel canale. Allo stesso modo, è importante evitare qualsiasi pipettaggio veloce, poiché il flusso turbolento di liquido possono introdurre bolle nel canale e danneggiare il bilayer.
Un rilascio di granuli citolitiche viene rilevato dalla comparsa di CD107a all'interfaccia cellula T-doppio strato. Fab regioni di Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a anticorpi vengono aggiunti alle cellule T CD8 prima del caricamento sul bilayer. Microscopia TIRF sfrutta un'onda evanescente per illuminare l'area di circa 100 nm sopra il bilayer del volume definito come volume evanescente, che permette di aumentare la risoluzione verticale dell'imaging. Fabs anticorpo marcato, che si diffondono molto rapidamente all'interno del volume evanescente a 37 ° C, non generano un segnale fluorescente rilevabile. Durante la fusione della membrana dei lisosomi specializzati contenenti molecole litiche con la membrana cellulare, proteina di membrana di CD107a appare sul T cellule contatto con superficie in località distinte. Per la proteina di CD107s a quel tempo l'associazione con i Fab. Associata alla proteina CD107a, con etichetta fluorescente Fab(s) formare ammassi immobile che generano una brillante fluorescenza rilevabile da microscopia TIRF, indicativa del degranulation delle cellule T.

Conoscenza scientifica delle caratteristiche strutturali delle sinapsi immunitarie T-cellula e loro collegamento con l'attività funzionale delle cellule T è stata generata principalmente dallo studio di linee cellulari e cloni derivata da PB. A quale grado di questi risultati si riferiscono a cellule T primarie ottenute da sangue o tessuti linfoidi umani rimane poco chiaro, come le interfacce sinaptiche delle cellule di T che risiedono nei tessuti linfoidi e altri non sono stati finora analizzate. Cosa importante, i dati emergenti suggeriscono che le cellule di T di residenti in tessuto e linfoide-organo-derivati possono avere differenze significative nel loro fenotipo e l'attività funzionale rispetto a quelli in PB6,7. Questo ulteriore ha solidificato la necessità di comprendere meglio le caratteristiche dell'interfaccia sinaptica delle cellule T in cellule T umane primarie.
A tal fine, abbiamo sviluppato un approccio di mini-scala romanzo sfruttando lipidici incorporati nelle slitte di flusso multicanale che ci permette di eseguire l'imaging delle interfacce di T-cellula/doppio strato con meno di 10 cellule T primarie5 isolate da PB umano e LN. Questa nuova tecnica consente lo studio delle proprietà biofisiche delle interfacce primarie della T-cellula umane sinaptiche al fine di meglio modellare e capire in vivo interazioni cellula-cellula.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD4 T cell isolation kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 T cells Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOGS NTA</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790528C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl Cap PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870273C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Octapharma USA</td>
			<td>NDC 68982-643-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sticky-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips for sticky-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioptech FCS2 Chamber</td>
			<td>Bioptech</td>
			<td>060319-2-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-0037-81</td>
			<td>OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- CD28 antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX14664</td>
			<td>9.3 clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEO4-NHS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Cy5 NHS Ester</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>PA15101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V412020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>37409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free Drosophial media Insect-XPRESS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-730Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma YN1/1.7.4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1878</td>
			<td>The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9142</td>
			<td>Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex tangential flow concentrator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77601-60 7592-40</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Lab Tangential Flow Systems</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>FS002K10 OS010T12 FS005K10</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>131384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human antibody against CD107a</td>
			<td>BD Bioscences</td>
			<td>555798</td>
			<td>Clone H4A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ansell Natural Blue Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-014-539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6320-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>ProZyme</td>
			<td>SA10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Premier Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the synaptic interface of primary human t cells from peripheral blood and lymphoid tissue

L'attuale comprensione delle dinamiche e caratteristiche strutturali delle interfacce sinaptiche della T-cellula sono stato in gran parte determinati attraverso l'utilizzo di vetro-supportato bilayer planare e in vitro-derivata T-cellula clona o linee1,2 ,3,4. Come applicano questi risultati a cellule T umane primarie isolate da sangue o linfoide tessuti non è noto, in parte a causa di notevoli difficoltà nell'ottenimento di un numero sufficiente di cellule per analisi5. Qui ci rivolgiamo questo attraverso lo sviluppo di una tecnica sfruttando le diapositive di flusso multicanale per costruire planare lipidici contenenti molecole di adesione e di attivazione. La bassa altezza delle diapositive flusso promuove sedimentazione rapida delle cellule al fine di sincronizzare l'attaccamento cellulare: doppio strato, consentendo ai ricercatori di studiare la dinamica della formazione sinaptica interfaccia e la cinetica del rilascio granuli. Applichiamo questo approccio per analizzare l'interfaccia sinaptica di minor come 104 a 105 primaria crioconservati T cellule isolate da linfonodi (LN) e nel sangue periferico (PB). I risultati rivelano che la tecnica del doppio strato lipidico planare romanzo consente lo studio delle proprietà biofisiche delle cellule T umane primarie derivate dal sangue e dai tessuti nel contesto della salute e nella malattia.

In primo luogo, abbiamo confrontato la struttura dell'interfaccia sinaptica formata da attivati CD8 cavo-sangue-derivate+ T cellule esposte a lipidici costruito sia in flusso tradizionale su larga scala sistemi di cellule (Vedi la Tabella materiali particolari)1 ,2,3,4 o nelle diapositive di flusso multicanale. Il bilayer contenuti fluorescenti-etichetta anti-CD3 e ICAM-1 in 50 molecole/µm2 e 300 molecole/µm2, rispettivamente. CD8+ T le cellule derivate dal sangue del cordone ombelicale umano sono state attivate da una stimolazione con piastra-associazione anti-CD3 e anti-CD28 anticorpi13,14. Non c'era differenza tra CD8+ T cellule che sinapsi immunologica classica formata sui lipidici costruiti in cella di flusso o la diapositiva di flusso multicanale (Figura 1). Tutti gli altri esperimenti sono stati eseguiti con lipidici fatta nelle diapositive flusso multicanale.
Successivamente, abbiamo esaminato la capacità di PB - e LN-derivati umani CD4+ T cellule per formare sinaptiche interfacce con i planar lipidici e rilasciare granuli. Abbiamo sfruttato la microscopia TIRF per massimizzare la risoluzione verticale all'interfaccia cellula T-bilayer visualizzare degranulating cellule e per valutare la cinetica del rilascio del granello. Abbiamo osservato 4 gruppi di cellule per entrambi il CD4 LN - e PBMC-derivati+ T cellule: alcune cellule T stabilita mature sinapsi immuni, ma uno ha fatto o non ha rilasciato i granuli, altre cellule T rilasciato i granuli senza una formazione delle sinapsi mature e ancora altre cellule T formano sinapsi né rilasciato i granuli (Figura 2)7. La differenza tra CD4 LN - e PBMC-derivati+ T cellule è diventato evidente quando è stata valutata la cinetica del rilascio del granello. Derivata da PBMC CD4+ T cellule erano in grado di iniziare a rilasciare granuli quasi due volte più velocemente CD4 LN-derivati+ cellule (Figura 3)7. Nel complesso, i dati dimostrano che nonostante un'eterogeneità di CD4 LN - e PBMC-derivati+ T cellule, quest'ultimo contenuta una frazione di T cellule capaci di degranulazione rapida.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig1.jpg"> Figura 1: confronto tra il sistema di scorrimento del flusso e flusso convenzionale camera. (A), questo pannello mostra il flusso multicanale slide che consente un assemblaggio di 6 vetro-supportati planare lipidici. Ogni doppio strato è collegato alla consegna e le porte di uscita. Meno di 1 x 105 celle sono sufficienti per l'analisi. (B), questo pannello mostra il sistema di alloggiamento di flusso convenzionale permettendo un'Assemblea di 1 vetro-supportati planare doppio strato lipidico. 2 x 106 cellule sono necessari per l'analisi. Visualizza gli altri pannelli (C e D) rappresentante TIRF microscopia e (E e F) confocale con microscopia di riflessione di interferenza immagini (IRM) dell'interfaccia sviluppata da attivato cellule CD8 T cavo-sangue-derivate. Le cellule sono state esposte a un doppio strato lipidico contenente ICAM-1 (300 molecole/µm2) ed anticorpi anti-CD3 (50 molecole/µm2) acquistati (C ed E) in diapositive di flusso o (D e F) in un convenzionale sistema di flusso in condizioni simili. La microscopia TIRF e confocale con IRM immagini sono scattate utilizzando 100 X e 60X obiettivi ingrandimento, rispettivamente. La percentuale di cellule T che forma matura sinapsi il bilayer costruito in una diapositiva di flusso o camera di flusso convenzionale era molto simile, ma varia tra esperimenti dal 75% al 90%. In tutte le immagini, le molecole di Cy-5-labelled ICAM-1 sono mostrati in blu; Gli anticorpi anti-CD3 Alexa-Fluor-488-labeled sono mostrati in verde; Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a anticorpi associati a CD107a sono mostrati in rosso; Immagini IRM sono mostrati in ciano; e le barre di scala sono 10 µm di lunghezza. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58143/58143fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig2.jpg"> Figura 2: Struttura di un'interfaccia di cellula T – doppio strato e il modello del degranulation di linfonodo e periferico del sangue CD4 mononucleari+ T cellule. Cellule derivate da LNMC o PBMC sono state ordinate per separare CD4+ T cellule che sono stati esposti a bilayer contenenti 50 molecole/µm2 degli anticorpi anti-CD3 e 300 molecole/µm2 della proteina ICAM-1. L'interfaccia tra le cellule e il bilayer era imaged da microscopia TIRF. Le barre di scala sono 5 µm. (A) queste immagini rappresentative di una cellula di T - interfaccia doppio strato mostrano la struttura delle cellule T – doppio strato interfacce e reticolo di degranulazione. (B) questi diagrammi mostrano una rappresentazione di PBMC-derivata e LNMC CD4+ T cellule con una struttura diversa delle interfacce sinaptiche e modelli di rilascio del granello. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58143/58143fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig3.jpg"> Figura 3: Cambiamenti dinamici della struttura di un'interfaccia di cellula T – doppio strato e la cinetica di una degranulazione del linfonodo e periferico del sangue CD4 mononucleari+ T cellule. (A), questo pannello spettacoli dipendente dal tempo cambiamenti di un'interfaccia di cellula T – doppio strato e la comparsa di granuli rilasciati. Le barre di scala sono 5 µm. (B), questo pannello mostra una quantificazione della cinetica di un rilascio di granello di CD4 LN-derivati+ T cellule (circoli chiusi) e derivata da PBMC CD4+ T cellule (cerchi aperti). Ogni singolo cerchio indica il tempo della prima apparizione di un rilascio di granuli rilevabile da singole celle. I mediani e IQR (range interquartile) sono indicati per tutti i grafici a dispersione. Per confrontare le differenze tra i gruppi indicati delle cellule di T sono stati effettuati test di Mann-Whitney. P < 0,05, * * P < 0.01. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58143/58143fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide

Il protocollo descrive una tecnica per studiare la capacità delle cellule T umane policlonali primarie per formare sinaptiche interfacce utilizzando lipidici planare. Usiamo questa tecnica per dimostrare la capacità di formazione di sinapsi differenziale delle cellule T umane primarie derivata da linfonodi e nel sangue periferico.

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

assessment-synaptic-interface-primary-human-t-cells-from-peripheral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.4K Views.  Thomas Jefferson University. Il protocollo descrive una tecnica per studiare la capacità delle cellule T umane policlonali primarie per formare sinaptiche interfacce utilizzando lipidici planare. Usiamo questa tecnica per dimostrare la capacità di formazione di sinapsi differenziale delle cellule T umane primarie derivata da linfonodi e nel sangue periferico.

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

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Immunologia e infezioni

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

L&#39;isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...