Ringraziamo Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama per i loro consigli sugli esperimenti elAbSca, Charles Yokoyama per l'editing del manoscritto, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di ricerca da RIKEN T.H. e localizzativi per ricerca scientifica dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone di T.H. (aree Innovative "Mesoscopiche neurocircuiti"; 22115004) e S.S. (25890023).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di esperimenti di RIKEN Wako animale e RIKEN genetico ricombinante esperimento Safety Committee ed eseguite secondo le linee guida istituzionali dell'animale il RIKEN Brain Science: Servizi Istituto.
1. preparazione di Imaging Chambers
<ol><li>
Imaging camera19
	<ol>
<li>Utilizzando lastre di gomma siliconica, preparare una camera con uno spessore di circa 5 mm e piano lamiere di vari spessori. Inoltre, preparare piatti Petri con e senza un fondo di vetro (Figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distanziale di fetta
	<ol>
<li>Preparare i distanziali per contenere campioni, utilizzando lastre di gomma siliconica con uno spessore di 0,5 mm (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tracer iniezione
Nota: Fare iniezioni nel collicolo superiore (2.2) o pons (2.1). Iniezione nei neuroni di proiezione Sub-cerebrale di etichetta pons in una regione vasta cervello, comprese le aree visive e motorie, mentre l'iniezione nel collicolo superiore etichette neuroni di proiezione Sub-cerebrale nel campo visivo. Per gli esperimenti di controllo, iniettare soluzione fisiologica invece di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B. Per il mantenimento dello stato sterile utilizzare attrezzature sterilizzate e guanti di plastica puliti con etanolo.
<ol><li>
Fare le iniezioni nel ponte di topi adulti.
	<ol>
<li>Disegnare 1 µ l di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B (25 µ g / µ l di PBS) in una siringa Hamilton G 26.</li>
		<li>Posto un iniettore pompa della siringa.</li>
		<li>Posizionare la siringa e la pompa al supporto utensile di un manipolatore posizionato su uno strumento stereotassica. Inclinare il manipolatore 12° posteriormente rispetto all'asse verticale.</li>
		<li>Anestetizzare un topo adulto maschio o femmina (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9) iniettando sodio pentobarbital intraperitonealmente (60 mg/kg di peso corporeo) o con la somministrazione di isoflurano (2 – 3%). Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.</li>
		<li>Posizionare il mouse sullo strumento stereotassica.</li>
		<li>Rimuovere accuratamente i capelli con una lama di rasoio per prevenire l'infezione e tagliare 10 mm del cuoio capelluto in modo che il bregma e lambda sono visibili. Somministrare 0,1 mL di lidocaina 1% utilizzando una pipetta. Regolando la posizione verticale del boccaglio sullo strumento stereotassica affinché il bregma e lambda hanno lo stesso livello di z, impostare l'angolo della testa.</li>
		<li>Regolare la posizione del manipolatore facendolo sullo strumento stereotassica in modo che la punta della siringa è vicino il bregma e registrare la posizione del manipolatore. Ritrarre la siringa spostando il portautensile sul manipolatore.</li>
		<li>Spostare il manipolatore 5,4 mm posteriormente e 0,4 mm lateralmente. Avanzare la siringa in modo che la punta si trova vicino al punto di entrata sul cranio. Ritrarre la siringa e segnare il punto di ingresso.</li>
		<li>La posizione contrassegnata, praticare un foro con un diametro di circa 1 mm.</li>
		<li>Inserire la punta della siringa nel foro in modo che la profondità della punta è 6,9 mm più di quella misurata presso il bregma.</li>
		<li>Iniettare 1 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.</li>
		<li>Rimuovere la siringa dal cervello.</li>
		<li>Se necessario, coprire il cervello esposto con piccoli frammenti di microfibrillare emostato e adesivo istantaneo.</li>
		<li>Sciacquare il cervello esposto utilizzando soluzione fisiologica consegnato con una pipetta per prevenire l'infezione e suturare il cuoio capelluto.</li>
		<li>Rimuovere il mouse dallo strumento stereotassica. Consentire il mouse per recuperare dall'anestesia in un incubatore a 30 ˚ c, in genere per 1 h. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Restituire il mouse per la compagnia di altri animali dopo che completamente ha recuperato.</li>
		<li>Mantenere il mouse per 3 – 7 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare le iniezioni nel collicolo superiore di topi adulti.
	<ol>
<li>Preparare una pipetta di vetro con un diametro di punta di 30 – 50 µm.</li>
		<li>Connettere la pipetta di vetro una siringa Hamilton attraverso un tubo di plastica (Figura 2A).</li>
		<li>Riempire la pipetta di vetro, tubo di plastica e siringa Hamilton con il liquido paraffina.</li>
		<li>Posto un iniettore pompa della siringa.</li>
		<li>Inserire la pipetta di vetro sul manipolatore e inclinare il manipolatore 60° posteriormente rispetto all'asse verticale (Figura 2B).</li>
		<li>Eseguire 2.1.4–2.1.9. La posizione del manipolatore è 1,4 mm posteriore, laterale di 0,5 mm per l'espressione lambda.</li>
		<li>Posizionare una pellicola di plastica piccolo paraffina sul cranio, quindi mettere circa 1 µ l della soluzione tracciante su di esso. Avanzare la pipetta di vetro e riempirlo con almeno 0,5 µ l della soluzione tracciante rapidamente.</li>
		<li>Inserire la pipetta di vetro in modo che la profondità di punta è di 3,0 mm dalla superficie del cervello.</li>
		<li>Iniettare 0,5 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.</li>
		<li>Rimuovere la pipetta di vetro dal cervello.</li>
		<li>Eseguire 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fissazione e rifilatura
<ol><li>Iniettare per via intraperitoneale sodio pentobarbital (60 mg/kg di peso corporeo) in un mouse (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9, con o senza l'iniezione tracciante come descritto nel passaggio 2. Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.</li>
	<li>Eutanasia il mouse umanamente irrorando il mouse via20 con soluzione fisiologica allo 0,9%.</li>
	<li>Difficoltà il mouse20 irrorando paraformaldeide al 4% (PFA) in 0.1 M tampone fosfato (pH 7.5).</li>
	<li>
Tagliare il cuoio capelluto utilizzando un paio di forbici per esporre il cranio come descritto20.
	<ol>
<li>Tagliare la linea mediana del cranio esposto utilizzando un paio di forbici. Rimuovere il cranio usando il forcipe.</li>
		<li>Se contrassegnare la posizione del bregma e lambda è necessario, prima di rimuovere un emisfero del cranio. Inserire gli aghi sottili di tungsteno nel cervello alle posizioni del bregma e lambda sul cranio restanti sul cervello, quindi rimuovere il cranio rimanente. Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ˚ c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per eseguire la macchiatura dell'anticorpo dei neuroni inibitori, tagliare a fette i campioni di cervello.
	<ol>
<li>Posizionare il campione di cervello su un vibratomo.</li>
		<li>Tagliate le fette fino a 500 µm di spessore in PBS a temperatura ambiente e procedere al passaggio 5 (il AbScale metodo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se la macchiatura dell'anticorpo è necessaria, trim il campione di cervello a blocchi (fino a 3 mm di spessore) con una lama di rasoio (Figura 3) e procedere al passaggio 4 (metodo SeeDB). Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ° C dopo il taglio o rifilatura. Il metodo di SeeDB è preferibile quando la macchiatura dell'anticorpo non è necessaria perché richiede meno tempo rispetto al metodo dil. e AbSca.</li>
</ol>4. compensazione senza anticorpi (metodo SeeDB)
<ol><li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 20% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 40% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 60% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80% (w/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 100% (p/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica di 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80,2% di fruttosio (w/w) e incubare per 24 h con agitazione delicata a temperatura ambiente. Nota: Maneggiare il campione accuratamente per evitare deformazioni più piccolo possibile. Non Incubare i campioni più lunghi rispetto a quanto indicato, come campioni possono rapidamente diventare opachi.</li>
	<li>Incorporare il campione in una camera di imaging riempita con la soluzione di fruttosio 80,2% (Figura 1B). Se necessario, correggere l'esempio mettendo piccoli pezzi di adesivo di gomma intorno. Se la camera è troppo profonda, mettere un piatto piano in Aula prima di mettere i campioni.</li>
	<li>Mettere la capsula di Petri con un coperchio di vetro sulla camera imaging e mettere l'acqua nel piatto e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione filtri sono descritti nella tabella 1. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato.</li>
</ol>5. schiarimento con anticorpo che macchia (il AbScale metodo)
<ol><li>Preparare i reagenti come descritto in tabella 2.</li>
	<li>Trasferire le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL di soluzione di Sca/eS0 e li Incubare per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C (Figura 4B).</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 36 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eB4 e incubare le fette per 24 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.</li>
	<li>Incubare con gli anticorpi primari (tabella 3) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48-72 h a 37 ° C (Figura 4) con agitazione delicata.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 5 mL con una spatola.</li>
	<li>Incubare in 4 mL di soluzione di AbScale per 2 h 2 volte a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.</li>
	<li>Incubare con anticorpi secondari con etichetta fluorescente (Tabella materiali, 1: 100) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48 h a 37 ° C con agitazione delicata.</li>
	<li>Rimuovere le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL della soluzione elAbSca con cautela e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL della soluzione elAbSca e incubare le fette per 2 h 2 volte con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di 4% PFA e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca-eS4 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.</li>
	<li>Posizionare il distanziale su un vetrino e mettere le fette nel distanziale e immergere le fette con Sca-eS4 soluzione. Sigillare il distanziatore con un vetro di copertura (Figura 1).</li>
	<li>Mettere l'acqua sul vetro di copertura e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato. Nota: Controllare se le parti profonde del campione sono etichettate allo stesso modo per le parti superficiali per confermare l'assenza di una significativa distorsione d'etichettatura. Nota: La penetrazione degli anticorpi testati è descritto nella tabella 3.</li>
</ol>6. determinazione della posizione di cella
<ol><li>Per ciascuna posizione in immagini digitalizzate, calcolare i valori di correlazione utilizzando un'immagine tridimensionale filtro14 (Figura 5A-5D).</li>
	<li>Determinare le posizioni dei picchi del valore di correlazione (Figura 5).</li>
	<li>Indagare le immagini intorno alle cime per individuare le celle (Figura 5E).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lein, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo presentato le procedure per ottenere immagini tridimensionali su larga scala dell'organizzazione cellulare specifico del tipo dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5. Rispetto alla fetta convenzionale macchiatura, il metodo è più utile nel determinare l'organizzazione tridimensionale della neocorteccia. Il metodo consente acquisizione immagini dalla più ampia e le regioni del cervello più profonde rispetto al tipico in vivo microscopia 2-fotone o microscopia confocale convenzionale e, quindi, possono permettere l'analisi completa del cellulare neocortical organizzazione.
Un passaggio fondamentale del metodo è la penetrazione dell'anticorpo. Un sottoinsieme degli anticorpi Mostra scarsa penetrazione nella spessi esemplari (tabella 3) e, pertanto, non può essere utilizzato per il metodo dil. e AbSca. Per ottenere l'etichettatura uniforme con gli anticorpi utilizzati in questo studio, è stato necessario tagliare il cervello a 500 µm fette. L'uso di più piccoli frammenti di anticorpo, per esempio, Fab F(ab') 2 frammenti e/o altri metodi21,22,23,24,25,26, di compensazione 27,28 può migliorare i risultati.
Specificità dell'anticorpo antigene-legante è caratterizzato solitamente in fettine di tessuto sottile ma potrebbero essere diversi in tessuti spessi elaborati per schiarimento. Per controllare la specificità dell'anticorpo, abbiamo co-etichettato tessuti con tracciante iniezione e indicatore di espressione genica in animali transgenici e anche eseguiti esperimenti di blocchi utilizzando antigene proteine e peptidi14. Tali procedure e gli esperimenti di controllo utilizzando animali mutanti carenti gli antigeni bersaglio dovrebbe essere utili per confermare la specificità degli anticorpi.
Una limitazione del metodo è che qualche deformazione del provino è inevitabile dovuto la manipolazione dei campioni di massa morbida. Come ottenere immagini in vivo prima della fissazione e utilizzare queste immagini come riferimenti aiuterà a correggere tali deformazioni.
Le procedure presenti sono state progettate per l'analisi dello strato neocortical 5. Recenti analisi hanno identificato molti marcatori molecolari che tipi di un neurone delle cellule di etichetta in altri strati4,5,6,7, e l'applicazione di questi creatori per il presente metodo può consentire identificazione di importante organizzazione cellulare negli altri strati. Inoltre, dovrebbe essere possibile eseguire analisi simili nelle regioni del cervello diverso da neocorteccia e in altri organi rispetto al cervello, di indagare se una precisa organizzazione cellulare simile a microcolonne è presente.

La neocorteccia dei mammiferi è composta da un gran numero di tipi di cellule, ognuna con il pattern di espressione genica specifici, proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni1,2 ,3,4,5,6,7. Se questi tipi di cellule sono organizzati in strutture ripetute è stato poco chiaro. Colonne corticali, comprese le colonne di orientamento visivo e somatosensoriali botti, hanno ripetuto le strutture, ma la loro organizzazione cellulare rimane poco chiaro8,9. Questi sono presenti nelle specifiche aree corticali e non sono un sistema di tutto il cervello.
Nello strato neocortical 5, la grande maggioranza dei neuroni è classificata in quattro tipi principali. Un tipo principale di neuroni eccitatori, neuroni di proiezione Sub-cerebrale, proietta assoni subcortical obiettivi inclusi pons, midollo spinale e il collicolo superiore e, pertanto, rappresenta i principali output corticale via10. Neuroni di proiezione corticale, un altro tipo di neuroni eccitatori, innervano la corteccia10. Neuroni inibitori contengono anche due grandi classi: le cellule che esprimono parvalbumina ed esprimendo la somatostatina11.
Recenti analisi indicano che i tipi di quattro cellule sono organizzati in strutture ripetute12,13,14. Sia sub-cerebrale proiezione neuroni12,13,14 e proiezione corticale neuroni14 organizzare in cellula-tipo microcolonne specifico con un diametro di 1 – 2 celle. Le cellule che esprimono parvalbumina e somatostatina-esprimendo allineare specificamente con microcolonne dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale ma non con microcolonne di proiezione corticale neuroni14. Microcolonne stessi allineare periodicamente a forma esagonale della grata di matrice14 e sono presenti in più aree corticali, comprese le zone visivi, somatosensoriali e motori nel cervello del mouse12,14 e in lingua aree del cervello umano13. Neuroni nella microcolonna singolo esibiscono l'attività sincronizzata e avere risposte sensoriali simili14. Queste osservazioni indicano che tipi di cellule strato 5 organizzano in una struttura di reticolo microcolonna che rappresenta l'organizzazione di tutto il cervello nota prima di ripetere moduli funzionali.
Microcolonne hanno un raggio di circa 10 µm e hanno una periodicità spaziale di circa 40 µm. Inoltre, l'orientamento delle microcolonne è parallelo alla loro dendriti apicali e cambia a seconda della loro posizione nella corteccia14. Pertanto, il sistema microcolonna è difficile da analizzare utilizzando fette corticali convenzionale con uno spessore tipico di poche decine di micrometri. Inoltre, l'analisi della periodicità richiede dati tridimensionali da una vasta gamma di aree cerebrali e, pertanto, l'area di imaging tipico di microscopia confocale o in vivo imaging 2-fotone è troppo stretta.
Recentemente, le tecniche sono state sviluppate per deselezionare tessuti spessi15,16. Qui descriviamo l'applicazione di questi metodi per ottenere immagini tridimensionali, su larga scala dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5 che compongono il sistema microcolonna. Neuroni di proiezione subcerebral sono etichettati dall'etichettatura retrograda o dall'espressione della proteina fluorescente verde avanzata in Crym-egfp topi transgenici12e proiezione corticale neuroni sono etichettati da entrambi il retrogrado etichettatura o dall'espressione del tdTomato Tlx3-cre/Ai9 topi17. Le cellule che esprimono parvalbumina e che esprimono somatostatina sono etichettate da immunohistochemistry. Il metodo (anticorpo scala S) AbScale18 viene utilizzato per l'anticorpo che macchia esperimenti, mentre il metodo SeeDB (vedere cerebrale profonda)19 viene utilizzato per altri esperimenti. Questi metodi superare le suddette difficoltà dei metodi convenzionali di formazione immagine e rivelano l'organizzazione accurata di strato 514.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Crym-egfp transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>012003-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tlx3-cre transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>36547-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX #7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-01</td>
			<td>0.5 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-02</td>
			<td>1.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-05</td>
			<td>3.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C022241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 310</td>
			<td>Pons injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 100</td>
			<td>Superior colliculus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Toyo Associates</td>
			<td>HP-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene microfibrillar hemostat</td>
			<td>Davol Inc</td>
			<td>1010090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alonalfa</td>
			<td>Daiichi-Sankyo</td>
			<td>Alonalpha A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K881H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Liquid, light</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26132-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Otsuka</td>
			<td>1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26126-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td>Inter medical</td>
			<td>&#934;0.1 *L200 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL plastic tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-thioglycerol</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33709-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-) Fructose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>16315-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BluTack</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>CKBT-450000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>COMS</td>
			<td>PT100C-50XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-492/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-575/25-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-629/56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>D605/55m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic tube</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>VIO-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tube</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35905-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyserol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>191612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-)-sorbitol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-14735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo chemical industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Cyclodextrin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td>
			<td>Skin Essential Actives</td>
			<td>33996-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>13445-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35624-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTIP2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Statb2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GABA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Frontier Institute</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Somatostatin</td>
			<td>Peninsula Laboratories</td>
			<td>T-4103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fos</td>
			<td>CalbioChem</td>
			<td>PC38</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

La neocorteccia dei mammiferi è composta di molti tipi di neuroni eccitatori ed inibitori, ognuno con specifiche proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni, ma loro basic funzionale e anatomica organizzazione dal cellulare alla scala di rete è capita male. Qui descriviamo un metodo per l'imaging tridimensionale dei neuroni fluorescente etichettati attraverso grandi aree del cervello per l'indagine l'organizzazione corticale. Specifici tipi di neuroni sono contrassegnati tramite l'iniezione di traccianti fluorescenti di un neurone retrogradi o l'espressione di proteine fluorescenti in topi transgenici. Campioni di blocco del cervello, per esempio, un emisfero, sono preparati dopo la fissazione, reso trasparenti con tessuto metodi di compensazione e sottoposti a immunolabeling fluorescente dei tipi cellulari specifici. Grandi aree vengono scansionati usando microscopi confocale o due-fotone dotati di grande lavoro distanza obiettivi e fasi motore. Questo metodo può risolvere l'organizzazione periodica dei moduli funzionali di tipo-specific microcolonna di cella nella neocorteccia del mouse. La procedura può essere utile per lo studio di architettura cellulare tridimensionale in aree cerebrali diverse e altri tessuti complessi.

Abbiamo etichettato neuroni di proiezione corticale di espressione di tdTomato in Tlx3-cretopi transgenici /Ai9 e visualizzati i neuroni di proiezione Sub-cerebrale iniettando il tracciante retrogrado CTB488 nel ponte. L'emisfero sinistro del cervello è stato sottoposto al metodo SeeDB e scansionati usando un microscopio a due fotoni dotato di un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga (25 X, N.A. 1.1, distanza di lavoro 2 mm) e un tavolino motorizzato. Una pila di 401 immagini (512 x 512 pixel; pixel size = 0.99 µm) z-Step = 2.8 µm a ciascuno dei 30 posizioni di scansione è stato ottenuto. I corpi cellulari dei due tipi cellulari erano visibili sopra una vasta gamma di aree cerebrali (Figura 6) e le sezioni ottiche ha mostrate microcolonne periodico (figura 7A). Inoltre, i cervelli dei topi Crym-egfp (mantenuti come eterozigoti con uno sfondo di C57BL/6J) sono stati liquidati con il metodo SeeDB ed imaged come sopra. I corpi cellulari e apicale dendriti dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale che esprimono EGFP erano visibili nelle sezioni ottiche (figura 7B).
Abbiamo anche effettuato etichettatura retrograda dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale in topi C57BL/6J utilizzando CTB488. Il cervello fisso è stato tagliato a fette coronali con uno spessore di circa 500 µm e sottoposte al metodo dell'AbScale, per marcare le cellule che esprimono parvalbumina (Anti-parvalbumina, 1: 1000; Anti-mouse IgG-fluorescente etichettato,). Stack di immagini (512 x 512 pixel, dimensione del pixel = 1,24 µm; z-passo = 2.17 µm, 268 immagini/stack) sono stati ottenuti usando la microscopia confocal con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga (20 X, 1.0 N.A., distanza di lavoro 2 mm). Neuroni di proiezione Sub-cerebrale e cellule che esprimono parvalbumina erano entrambi visibili nelle fette (Figura 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig1.jpg"> Figura 1: Imaging chambers e distanziali. Parte superiore (A): fatto a mano con fondo di vetro della piastra di Petri (a destra) e una capsula di Petri senza un fondo di vetro (a sinistra). Fondo: Una camera (a destra) e le piastre del pavimento (a sinistra) in strati di silicone. (B) un emisfero del mouse sottoposta al metodo del SeeDB dopo iniezione di CTB555 nel collicolo superiore è impostato nella camera. Il campione è stato risolto con un pezzo di adesivo riutilizzabile. Vetrino (C), A (in alto) e un distanziatore in un foglio di silicone con uno spessore di 0,5 mm (in basso). (D) due fette della corona del cervello del mouse sono stati impostati nel distanziatore e coperto con un vetro di copertura. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig2.jpg"> Figura 2: iniezione dell'elemento tracciante. (A) A pipetta di vetro collegato ad una siringa Hamilton attraverso un tubo di plastica. (B), un mouse è posizionato su uno strumento stereotassica. La pipetta di vetro viene inclinata a 60° circa posteriormente rispetto all'asse verticale per iniezione nel collicolo superiore. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig3.jpg"> Figura 3: taglio di campioni del cervello. (A) campione intero cervello dopo l'iniezione di CTB555 nel collicolo superiore e fissazione. Il bregma e lambda sono stati contrassegnati con aghi di tungsteno (frecce). (B), lo stesso campione tagliato per ottenere un emisfero. Si noti che gli aghi di tungsteno rimangono (frecce). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig4.jpg"> Figura 4: Immersione di campioni di cervello in soluzioni per i metodi di elSeeDB e AbSca. (A) un campione di emisfero immerso in 0,5% α-thioglycerol e fruttosio 20% (p/v) per il metodo di SeeDB. (B) fette coronali immerse nella soluzione di Sca/eA2 per il metodo dil. e AbSca. (C) fette coronali immerse nella AbScale soluzione contenente anticorpi per il metodo dil. e AbSca. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig5.jpg"> Figura 5: determinazione delle posizioni cell. Neuroni di proiezione Sub-cerebrale sono stati etichettati, iniettando il tracciante retrogrado CTB488 in ponte a 5 settimane dell'età. L'emisfero sinistro è stato sottoposto al metodo SeeDB e scansionato con microscopia del due-fotone (512 x 512 pixel, dimensione del pixel = 0.99 µm; z-passo = 2,8 µm, 601 immagini/stack). (A), A immagine singola. (B) cinque immagini da una pila di singola immagine. (C) l'immagine filtro utilizzato per rilevare i neuroni di proiezione Sub-cerebrale con etichetta CTB. (D) i valori di correlazione calcolata per le cinque immagini in (B) utilizzando il filtro in (C). (E) esempi di neuroni di proiezione Sub-cerebrale rilevato. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig6.jpg"> Figura 6: risultati rappresentativi dell'imaging su larga scala. Neuroni di proiezione corticale (verdi) sono stati etichettati da tdTomato-espressione di Tlx3-cre/Ai9 topi transgenici, e neuroni di proiezione Sub-cerebrale (magenta) sono stati visualizzati iniettando il tracciante retrogrado CTB488 ponte a 7 settimane di età. L'emisfero sinistro è stato sottoposto al metodo SeeDB e la zona 1.250 µm a 2.690 µm laterale e-3,400 µm a 1.230 µm anteriormente il bregma è stati digitalizzati usando microscopia del due-fotone. Vista superiore (A). Posizione approssimative delle zone corticali sono stati indicati. (B–D) Vista obliqua della fluorescenza CTB 488 risultati neuroni di proiezione Sub-cerebrale (B), tdTomato fluorescenza mostrando neuroni di proiezione corticale (C) e l'immagine unita (D). R: anteriore; P: posteriore; M: mediale; D: dorsale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig7.jpg"> Figura 7: fotografie ad alto ingrandimento di risultati rappresentativi. (A) una sezione ottica dell'immagine nella Figura 6. Immagine di spessore = 20 µm. (B) neuroni di proiezione Sub-cerebrale EGFP-identificato in un topo eterozigote Crym-egfp a 6 settimane dell'età. Spessore di immagine = 30 µm. (C) proiezione Subcerebral neuroni (magenta) sono stati etichettati iniettando CTB488 nel ponte dei topi C57BL/6J al giorno postnatale 49 e che esprimono parvalbumina cellule (verde) sono state visualizzate dal metodo elAbSca. Spessore di immagine = 55 µm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Fluoroforo</td>
			<td>Es (nm)</td>
			<td>Filtro (nm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGFP</td>
			<td>910</td>
			<td>500-550 (FF03-525-25/50, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>tdTomato</td>
			<td>1.000</td>
			<td>578-633 (D605 / 55m, Chroma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>750</td>
			<td>500-550 (FF03-525-25/50, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 555</td>
			<td>750</td>
			<td>563-588 (FF03-575-25/25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>750</td>
			<td>601-657 (FF01-629/56, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>700</td>
			<td>400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Lunghezze d'onda di eccitazione e filtri per microscopia del due-fotone.
Tabella 2: reagenti per il metodo di e AbScal. <a href="/files/ftp_upload/58027/JoVE_Table2_AbScaleReagents0411_1829_RE0425_1806.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigene</td>
			<td>Animali immunizzati</td>
			<td>ID prodotto</td>
			<td>Concentrazione</td>
			<td>blocco di 3 mm</td>
			<td>Fetta di 500 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>CTIP2</td>
			<td>Ratto</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L6</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Statb2</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>ab51502</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAD67</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>1: 200</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>GABA</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>A2052</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumina</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>235</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumina</td>
			<td>Capra</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumina</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumina</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>ab11427</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Somatostatina</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>T-4103</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>c-Fos</td>
			<td>Coniglio</td>
			<td>PC38</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: penetrazione degli anticorpi testati. Risultati per blocchi di spessore mm 3 viene visualizzato come segue; L1-L6: penetrazione nello spessore dell'intero corticale; L1-L2/3: penetrazione fino a layer 2/3; -: nessuna etichettatura; ND: non determinato. Risultati per 500 µm di spessore fette viene visualizzato come segue; +: etichettatura uniforme; -: nessuna o limitata etichettatura.

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Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  RIKEN Brain Science Institute. Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

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Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Ricerca

Neuroscienze

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Registrazione Ensembles neuronali su larga scala con sonde di silicio sotto Rat anestetizzati

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

Generazione organoide nervosa motoria tridimensionale

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

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