우리 감사 미 야와 키 아츠 시와 히로시 하 마 원고, 편집에 대 한 찰스 요코야마 AbScale 실험에 그들의 조언을 에리코 Ohshima 및 그들의 기술 지원에 대 한 미유키 Kishino. 이 작품은 과학적 연구에서 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의 남에 대 한 남 및 연구비 RIKEN에서 연구 자금에 의해 지원 되었다 (혁신적인 지역 "생체 Neurocircuitry"; 22115004)와 S.S. (25890023)입니다.

모든 실험 절차 RIKEN와 코 동물 실험 위원회 RIKEN 유전자 재조합 실험 안전 위원회에 의해 승인 되었고 RIKEN 뇌 과학의 동물 시설 기관 지침에 따라 수행 연구소입니다.
1입니다. 이미징 챔버의 준비
<ol><li>
영상 실19
	<ol>
<li>실리콘 고무 시트를 사용 하 여 다양 한 두께의 약 5 m m와 바닥 플레이트의 두께 챔버를 준비 합니다. 또한, 접시와 유리 하단 (그림 1A) 없이 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스페이서를 슬라이스
	<ol>
<li>스페이서 두께 0.5 m m (그림 1C)의 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 샘플을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 추적 프로그램 삽입
참고: 폰 (2.1) 또는 우량한 colliculus (2.2)에 주사를 합니다. 우량한 colliculus에 주입 하는 동안 시각 및 모터 지역 등 다양 한 뇌 영역에 폰 레이블 하위 대뇌 프로젝션 뉴런에 주입 시각적 영역에 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 라벨. 붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B. 대신 식 염 수 주입 제어 실험에 대 한 멸 균 상태 유지에 대 한 소독된 장비 및 에탄올으로 청소 플라스틱 장갑을 사용 합니다.
<ol><li>
성인 쥐의 주사는 폰으로 확인 합니다.
	<ol>
<li>붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B의 1 µ L를 그리기 (25 µ g / µ L PBS에) 26 G 해밀턴 주사기로.</li>
		<li>주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.</li>
		<li>Stereotaxic 악기에 퓰 레이 터의 도구 홀더에 주사기와 펌프를 배치 합니다. 조작자 12 ° 수직 축에서 뒤로 기울입니다.</li>
		<li>Intraperitoneally 나트륨 pentobarbital을 주입 하 여 남성 또는 여성 성인 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9) anesthetize (60 밀리 그램/kg 체중) 또는 isoflurane (2-3%)을 투여 하 여. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>Stereotaxic 악기에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>감염 방지 및 bregma 및 람다 표시 되도록 두 피의 10 m m를 잘라 면도날을 사용 하 여 머리를 조심 스럽게 제거. 1 %lidocaine 피 펫을 사용 하 여 0.1 mL를 관리 합니다. 있도록 bregma 및 람다 동일한 z 레벨 stereotaxic 악기에 떠 벌이의 수직 위치를 조정 하 여 머리의 각도 설정 합니다.</li>
		<li>주사기의 팁은 bregma 가까이 stereotaxic 악기에 슬라이딩 하 여 조작자의 위치를 조정 하 고 조작자의 위치를 기록 합니다. 조작자에 도구 홀더를 이동 하 여 주사기를 철회.</li>
		<li>조작자 이동 5.4 m m 뒤로 및 0.4 m m 옆. 팁은 두개골에 진입점 가까이 있도록 주사기를 사전. 주사기를 철회 하 고 진입점을 표시 합니다.</li>
		<li>표시 된 위치에서 약 1 m m의 직경을 가진 구멍을 드릴 합니다.</li>
		<li>팁 깊이 6.9 m m 보다는 bregma에 측정 하는 구멍을 통해 주사기 끝을 삽입.</li>
		<li>추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 1 µ L을 주입.</li>
		<li>두뇌에서 주사기를 제거 합니다.</li>
		<li>필요한 경우 microfibrillar hemostat 및 인스턴트 접착제의 작은 파편으로 노출 된 뇌를 커버.</li>
		<li>감염을 방지 하 고 두 피를 봉합 하는 피 펫 제공 하는 염 분을 사용 하 여 노출 된 뇌를 씻어.</li>
		<li>Stereotaxic 악기에서 마우스를 제거 합니다. 일반적으로 1 시간에 30 ˚C에 인큐베이터에 마 취에서 회복 하기 위해 마우스를 허용 합니다. 두지 마십시오 마우스 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 완전히 복구 되었습니다 후에 다른 동물의 회사를 마우스를 반환 합니다.</li>
		<li>3-7 일에 대 한 마우스를 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
성인 쥐의 우량한 colliculus에 주사를 확인 합니다.
	<ol>
<li>팁 직경 30-50 µ m의 유리 피 펫을 준비 합니다.</li>
		<li>플라스틱 튜브 (그림 2A)를 통해 해밀턴 주사기를 유리 피 펫을 연결 합니다.</li>
		<li>파라핀 액체 유리 피 펫, 플라스틱 튜브, 그리고 해밀턴 주사기를 채우십시오.</li>
		<li>주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.</li>
		<li>조작자에 유리 피 펫을 놓고 조작 수직 축 (그림 2B)에서 뒤로 60 ° 기울기.</li>
		<li>2.1.4–2.1.9을 수행 합니다. 조작자의 위치는 1.4 m m 후부, 람다를 0.5 m m 옆.</li>
		<li>두개골에 작은 플라스틱 파라핀 영화 장소 다음 그것에 추적 솔루션의 약 1 µ L를 넣어. 신속 하 게 사전 유리 피 펫 및 추적 솔루션의 적어도 0.5 µ L로 그것을 채우십시오.</li>
		<li>팁 깊이 뇌 표면에서 3.0 m m 유리 피 펫을 삽입 합니다.</li>
		<li>추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 0.5 µ L을 주입.</li>
		<li>두뇌에서 유리 피 펫을 제거 합니다.</li>
		<li>2.1.13–2.1.16을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 고정 및 트리밍
<ol><li>Sodium pentobarbital (60 밀리 그램/kg 체중) 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9, 또는 2 단계에서 설명한 대로 추적 프로그램 주입 없이 intraperitoneally 주입. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>0.9% 식 염 수와 마우스 transcardially20 perfusing에 의해 마우스를 고통 없이 안락사.</li>
	<li>Perfusing 여 마우스20 수정 4 %paraformaldehyde (PFA) 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.5).</li>
	<li>
설명된20으로 두개골 폭로 위를 사용 하 여 두 피를 잘라.
	<ol>
<li>가 위를 사용 하 여 노출 된 두개골의 중간을 잘라. 집게를 사용 하 여 두개골을 제거 합니다.</li>
		<li>람다와 bregma의 위치를 표시 하는 것이 필요한 경우 먼저 두개골의 한 반구를 제거 합니다. 뇌에 남아 있는 두개골에 람다와 bregma의 위치에 두뇌에 얇은 텅스텐 바늘을 삽입 한 다음 나머지 해골을 제거. 참고: 뇌 수에 저장 PBS 4 ˚C에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 체 억제 뉴런의 얼룩을 수행 하려면 두뇌 샘플 조각으로 잘라.
	<ol>
<li>장소는 vibratome에 뇌 샘플입니다.</li>
		<li>실 온에서 PBS에 두께가 500 µ m까지 조각을 삭감 하 고 단계 5 (AbScale 방법)를 진행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>항 체 얼룩이 필요 하지 않은 경우, 트림 뇌 샘플을 차단 (최대 3 밀리미터 두꺼운) 면도날 (그림 3)를 사용 하 여 및 단계 4 (SeeDB 메서드)를 수행 하십시오. 참고: 두뇌 저장할 수 있습니다 PBS에 4 ° C에서 절단 또는 트리밍 후. SeeDB 메서드를 사용 하면 항 체 염색 법은 불필요 한 때 AbScale 방법 보다 적은 시간을 요구 하기 때문에 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 항 체 (SeeDB 메서드)를 얼룩 없이 지우기
<ol><li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 20% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 40% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 60% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 100% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.</li>
	<li>포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80.2% (w/w)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 그것을 품 어. 참고: 샘플 변형 가능한 작게 유지을 신중 하 게 처리 합니다. 샘플 신속 하 게 불투명 될 수 있는 이상, 샘플을 품 어 하지 마십시오.</li>
	<li>80.2%과 당 솔루션 (그림 1B)으로 가득 이미징 약 실에 샘플을 포함 합니다. 필요한 경우 주변 고무 접착제의 작은 조각을 넣어 샘플을 수정. 챔버 너무 깊은 경우 샘플을 배치 하기 전에 챔버에는 바닥에 접시를 넣어.</li>
	<li>이미징 챔버에 유리 커버와 함께 페 트리 접시를 놓고 접시, 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 여기 파장 및 방출 필터 표 1에서 설명 합니다. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다.</li>
</ol>5. 항 체 (AbScale 방법) 얼룩을 지우기
<ol><li>표 2에 설명 된 대로 시 약을 준비 합니다.</li>
	<li>Sca/eS0 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 전송 하 고 37 ° C (그림 4B)에서 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 그들을 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 36 h에 대 한 슬라이스를 품 어</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 및 Sca/eB4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 슬라이스를 품 어</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.</li>
	<li>AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C (그림 4C)에서 48-72 시간의 1 mL에 1 차 항 체 (표 3)와 품 어.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 5 mL 플라스틱 튜브에 조각.</li>
	<li>AbScale 솔루션 2 번 부드러운 진동으로 실 온에서 2 h 4 mL에 품 어.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.</li>
	<li>붙일 표시 2 차 항 체 (테이블의 자료, 1: 100) AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C에서 48 h의 1 mL에 함께 품 어.</li>
	<li>조심 스럽게 AbScale 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 제거 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 AbScale 솔루션의 4 개 mL를 추가 2 h 2 시간 실 온에서 부드러운 흔들어 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 4%의 4 개 mL를 추가 PFA 고 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/e s 4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어</li>
	<li>유리 슬라이드에는 스페이서를 배치 하 고 슬라이스는 공백에 놓고 Sca/e s 4 솔루션 분할 영역을 담가. 커버 유리 (그림 1D)와 공백 인감.</li>
	<li>커버 글라스와 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다. 참고: 중요 한 라벨 바이어스의 부재를 확인 표면 부분에는 샘플의 깊은 부분 마찬가지로 표시 여부를 확인 하십시오. 참고: 테스트 항 체의 침투는 표 3에 설명 되어 있습니다.</li>
</ol>6. 셀 위치 결정
<ol><li>스캔된 된 이미지에서 각 위치에 대 한 3 차원 이미지 필터14 (그림 5A-5D)를 사용 하 여 상관 관계 값을 계산 합니다.</li>
	<li>상관 관계 값 (그림 5D)의 봉우리의 위치를 결정 합니다.</li>
	<li>찾을 셀 (그림 5E) 봉우리 이미지 조사.</li>
</ol>

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex,+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+(Ce3D).">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

우리는 마우스 neocortical 레이어 5에에서 주요 세포 유형의 셀 형식 관련 조직의 대규모 3 차원 이미지를 얻기 위해 절차를 제시. 기존의 조각 얼룩에 비해, 메서드는 결정 하는 피 질의 3 차원 조직에 더 유용 합니다. 메서드를 사용 하는 더 넓은에서 이미지 수집 그리고 깊은 두뇌 지구 2 광자 현미경 전형적인 vivo에서 또는 전통적인 confocal 현미경 검사 법에 비해, 따라서 neocortical 휴대의 포괄적인 분석을 허용할 수 있다 조직입니다.
방법의 중요 한 단계는 항 체 침투 이다. 항 체의 하위 집합으로 두꺼운 표본 (표 3), 불 쌍 한 침투를 보여줍니다 그리고, 따라서, AbScale 방법에 사용할 수 없습니다. 이 연구에 사용 된 항 체와 균일 한 라벨을 얻기 위해 500 µ m 조각으로 두뇌를 잘라 하는 데 필요한 했다. 작은 항 체 파편, 예를 들어, 팹 F(ab') 2 조각, 또는 다른 방법21,22,23,,2425,26, 비운의 사용 , 2728 결과 향상 시킬 수 있습니다.
항 체 항 원 묶는 특이성은 일반적으로 얇은 조직 조각에서 특징만 처리 될 수 있습니다 다른 두꺼운 조직에서 지우기에 대 한. 항 체 특이성에 대 한 제어, 공동 조직 추적 프로그램 주입 및 마커 유전자 발현 유전자 변형 동물에서을 표시 하 고 또한 항 원 단백질 및 펩 티 드14를 사용 하 여 차단 실험을 수행. 이러한 절차와 제어 실험 대상 항 부족 돌연변이 동물을 사용 하는 항 체의 특이성을 확인 하는 데 유용 해야 합니다.
방법의 한계는 시료의 일부 변형 부드러운 대량 샘플의 처리 때문에 불가피 하다입니다. Vivo에서 고정 및 참조 수정 같은 개 악 하는 데 도움이 됩니다 이러한 이미지를 사용 하 여 이전 이미지를 얻는.
현재 절차 neocortical 레이어 5의 분석을 위해 설계 되었습니다. 최근 분석 많은 분자 마커 다른 레이어4,5,,67, 그 레이블 신경 세포 유형 식별 및 현재 메서드에 이러한 제조 업체의 응용 프로그램 사용 다른 계층에 중요 한 세포 조직의 식별입니다. 또한, 그것은 정확한 세포 조직 microcolumns와 유사한 존재 인지를 조사 하는 뇌 이외의 장기에는 피 질 외 뇌 지역에 유사한 분석을 수행 가능 해야 합니다.

포유류 피 질 세포 유형, 각각 특정 유전자 표현 패턴, electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 수의 구성 및 기능을 vivo에서 1,2 3,,45,,67. 이러한 세포 유형 반복 구조로 구성 됩니다 여부 되었습니다 분명. 시각적인 방향 열과 somatosensory 배럴을 포함 하 여 대뇌 피 질의 열 구조, 반복 하지만 그들의 세포 조직 남아 불분명8,9. 이들은 특정 대뇌 피 질의 영역에 존재 하 고 뇌 전체 시스템을 않습니다.
Neocortical 계층 5, 뉴런의 대다수는 4 개의 주요 유형으로 분류 됩니다. 주요 유형의 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 흥분 성의 뉴런 프로젝트 폰, 척수, 및 우량한 colliculus 바꾸어 대상에 축 삭 그리고, 따라서,10주요 외피 출력 경로 나타냅니다. 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런 흥분 성의 뉴런의 다른 주요 유형10피 질 자극. 금지 신경 또한 두 개의 주요 클래스를 포함: parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 세포11.
최근 분석 나타냅니다 4 셀 유형 반복된 구조12,,1314로 구성 됩니다. 하위 대뇌 프로젝션 뉴런12,,1314 및 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14 직경 1-2 셀의 셀 타입 특정 microcolumns로 구성. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 정렬 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 microcolumns로 아니라 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14microcolumns. Microcolumns 스스로 형태는 6 각형 격자 배열14 와 마우스 뇌12,14 와 언어 somatosensory, 시각과 모터 분야를 포함 한 여러 피 질 지역에 있는지를 주기적으로 정렬 인간의 뇌는13의 지역입니다. 개별 microcolumn에 신경 동기화 된 활동을 전시 하 고 비슷한 감각 반응이14. 이러한 관측 레이어 5 셀 유형 반복 기능 모듈의 첫 번째 알려진된 뇌 전체 조직을 나타내는 microcolumn 격자 구조로 구성 나타냅니다.
Microcolumns 약 10 µ m의 반지름을가지고 있고 약 40 µ m의 공간 주기. 또한, microcolumns의 방향을 피14에서 그들의 위치에 따라 그들의 변화와 꼭대기 dendrites 평행 하다. 따라서, microcolumn 시스템은 마이크로 미터의 몇 수만의 전형적인 두께가 기존의 대뇌 피 질의 조각을 사용 하 여 분석 하기가 어렵습니다. 또한, 주기 분석 3 차원 데이터는 다양 한 뇌 영역, 그리고, 그러므로, confocal 현미경 검사 법의 일반적인 이미징 영역에서에서 또는 vivo에서 2 광자 영상 너무 좁고입니다.
최근, 기술 두꺼운 조직15,16를 개발 되었습니다. 여기는 microcolumn 시스템을 구성 하는 주요 셀 형식 마우스 neocortical 레이어 5에서에서의 대규모, 3 차원 이미지를 얻기 위해 이러한 방법을 응용 프로그램에 설명 합니다. Subcerebral 프로젝션 뉴런 역행 표시 또는 Crym egfp 유전자 변형 쥐12, 그리고 대뇌 피 질의 프로젝션 뉴런에는 레이블로 역행에 향상 된 녹색 형광 단백질의 식으로 표시 됩니다. 라벨 또는 Tlx3-cre/Ai9 마우스17에 tdTomato 식으로. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 immunohistochemistry에 의해 표시 됩니다. (깊은 뇌 참조) SeeDB 방법19 다른 실험 사용 된다 실험, 얼룩이 지는 항 체 (항 체 규모 S) AbScale 방법18 사용 됩니다. 이러한 방법은 기존의 이미징 방법의 위에서 언급 한 어려움을 극복 하 고 레이어 514의 정확한 세포 조직 공개.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Crym-egfp transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>012003-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tlx3-cre transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>36547-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX #7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-01</td>
			<td>0.5 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-02</td>
			<td>1.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-05</td>
			<td>3.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C022241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 310</td>
			<td>Pons injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 100</td>
			<td>Superior colliculus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Toyo Associates</td>
			<td>HP-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene microfibrillar hemostat</td>
			<td>Davol Inc</td>
			<td>1010090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alonalfa</td>
			<td>Daiichi-Sankyo</td>
			<td>Alonalpha A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K881H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Liquid, light</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26132-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Otsuka</td>
			<td>1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26126-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td>Inter medical</td>
			<td>&#934;0.1 *L200 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL plastic tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-thioglycerol</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33709-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-) Fructose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>16315-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BluTack</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>CKBT-450000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>COMS</td>
			<td>PT100C-50XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-492/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-575/25-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-629/56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>D605/55m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic tube</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>VIO-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tube</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35905-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyserol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>191612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-)-sorbitol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-14735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo chemical industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Cyclodextrin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td>
			<td>Skin Essential Actives</td>
			<td>33996-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>13445-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35624-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTIP2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Statb2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GABA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Frontier Institute</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Somatostatin</td>
			<td>Peninsula Laboratories</td>
			<td>T-4103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fos</td>
			<td>CalbioChem</td>
			<td>PC38</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

포유류 피 질 흥분 성의 억제 신경, 각각 특정 electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 종류의 구성 그리고 vivo에서 기능, 하지만 그들의 기본 기능과 해 부 조직 세포에서 네트워크 규모를 제대로 이해 하 고 있습니다. 여기 우리는 대뇌 피 질의 세포 조직의 조사에 대 한 두뇌의 큰 영역에 걸쳐 붙일 표시 된 신경 세포의 3 차원 영상에 대 한 메서드를 설명합니다. 특정 유형의 신경 형광 퇴행 성 신경 추적기의 주입 또는 유전자 변형 쥐에 형광 단백질의 식에 의해 표시 됩니다. 블록 뇌 샘플, 예, 반구, 고정 후 준비, 청소 방법, 조직으로 투명 하 게 만들 있으며 형광 immunolabeling는 특정 종류의 세포를 받게. 큰 지역 대형 작업 거리 목표 및 자동화 한 단계 또는 두 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 검색 합니다. 이 메서드는 마우스 피 질에는 셀 형식 관련 microcolumn 기능 모듈의 주기적인 조직을 해결할 수 있습니다. 절차는 다른 복잡 한 조직과 다양 한 뇌 영역에 3 차원 세포 구조의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.

우리 /Ai9 유전자 변형 마우스 Tlx3-cre에 tdTomato의 식으로 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런을 표시 하 고 하위 대뇌 프로젝션 뉴런은 폰으로 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 시각. 두뇌의 왼쪽된 반구 SeeDB 메서드를 복종 되었다 및 물 침수 긴 작동 거리 목표를 갖춘 2 광자 현미경을 사용 하 여 스캔 (25 X, N.A. 1.1 작동 거리 2 m m)와 전동된 스테이지. 401 이미지의 스택 (512 x 512 픽셀; 픽셀 크기 = 0.99 µ m) z-단계 = 2.8 µ m 각 30 검색 위치에서 얻은. 두 종류의 세포 세포 시체 뇌 영역 (그림 6), 그리고 정기 microcolumns (그림 7A)를 보여 광학 섹션의 넓은 범위에 보였다. 또한, Crym egfp 마우스 (C57BL/6J 배경 heterozygotes 유지)의 두뇌는 SeeDB 방법에 의해 삭제 되었고 위에서 몇 군데. 셀 바디와 EGFP 표현 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 꼭대기 dendrites 광학 섹션 (그림 7B)에 볼 수 있었다.
우리는 또한 역행 C57BL/6J 쥐 CTB488를 사용 하 여 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 라벨을 수행 합니다. 고정된 뇌 약 500 µ m의 두께와 코로나 조각으로 잘라 되었고 AbScale 메서드 parvalbumin 표현 셀 (안티-parvalbumin, 1:1000;을 대상 반대로 마우스 IgG 붙일 레이블이)입니다. 이미지 스택 (512 x 512 픽셀, 픽셀 크기 = 1.24 µ m; z 단계 = 2.17 µ m, 268 이미지/스택) 물 침수 긴 작동 거리 목표와 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 가져온 (20 X, N.A. 1.0, 작동 거리 2 m m). 하위 대뇌 프로젝션 뉴런을 표현 하는 parvalbumin 세포 둘 다 조각 (그림 ℃)에 표시 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig1.jpg"> 그림 1: 챔버와 스페이서 이미지. (A) 가기: 수 제 유리 바닥 페 트리 접시 (오른쪽)와 페 트리 접시 유리 하단 (왼쪽) 없이. 하단: 챔버 (오른쪽)와 바닥 플레이트 (왼쪽) 실리콘 시트 했다. (B) 마우스 반구 우량한 colliculus CTB555 주입 챔버로 설정 후 SeeDB 메서드를 받게. 샘플 재사용 접착제의 조각으로 고정 됩니다. (C) 유리 슬라이드 (위)와 두께 0.5 m m (아래)와 실리콘 시트를 만든다. (D) 두 코로나 조각 마우스 뇌의 공백 요소에 설정 하 고 커버 유리로 덮여 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig2.jpg"> 그림 2: 추적 프로그램 삽입. (A) A 유리 피 펫 플라스틱 튜브를 통해 해밀턴 주사기에 연결 (B) 마우스 stereotaxic 악기에 배치 됩니다. 유리 피 펫을 기울이면 우량한 colliculus 주입에 대 한 수직 축에서 뒤로 약 60 °. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig3.jpg"> 그림 3: 뇌 샘플의 트리밍. (A) 우량한 colliculus 고정으로 CTB555의 주입 후 뇌 샘플. Bregma와 람다 텅스텐 바늘 (화살촉)로 표시 했다. (B) 같은 샘플 반구를 손질 합니다. 텅스텐 바늘 (화살촉) 유지 하는 참고. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig4.jpg"> 그림 4: SeeDB 및 AbScale 메서드에 대 한 솔루션에서 뇌 샘플의 침수. (A) A 반구 샘플에 0.5% α-thioglycerol 및 SeeDB 메서드에 대 한과 당 20% (w/v). (B) 코로나 조각 AbScale 메서드에 대 한 Sca/eA2 솔루션에. (C) 코로나 조각 AbScale 방법에 대 한 항 체를 포함 하는 AbScale 솔루션에. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig5.jpg"> 그림 5: 셀 위치의 결정. 하위 대뇌 프로젝션 뉴런은 나이의 5 주에는 폰에 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 분류 했다. 왼쪽된 반구 SeeDB 메서드를 받게 되었고 두 광자 현미경으로 검사 (512 x 512 픽셀, 픽셀 크기 = 0.99 µ m; z 단계 = 2.8 µ m, 601 이미지/스택). (A)는 단일 이미지입니다. 단일 이미지 스택에서 이미지를 (B) 5. (C) 이미지 필터 CTB 표시 된 하위 대뇌 프로젝션 뉴런을 감지 하는 데 사용. (D) (C)에서 필터를 사용 하 여 5 개의 이미지 (B)에 대 한 상관 관계 값 계산. 검색 된 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 (E) 예. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig6.jpg"> 그림 6: 대규모 화상의 대표적인 결과. 대뇌 피 질의 프로젝션 뉴런 (녹색) tdTomato- Tlx3-cre/Ai9 유전자 변형 마우스에 있는 식으로 표시 했다 그리고 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 (마젠타)의 7 주에는 폰에 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 구상 했다 나 이입니다. 좌 반구는 SeeDB 메서드를 복종 되었다 그리고 2,690 µ m 옆에 지역 1, 250 µ m 및-3,400 µ m 1230 µ m는 bregma에 앞쪽에 두 광자 현미경을 사용 하 여 스캔 했다. (A) 최고 볼 수 있습니다. 대뇌 피 질의 영역의 대략적인 위치를 표시 했다. (DB-) CTB 488 형광 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 (B), 보여주는 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런 (C), (D) 병합 된 이미지를 보여주는 tdTomato 형광의 간접 보기. A: 앞쪽; P: 후부; M: 중간; D: 등입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig7.jpg"> 그림 7: 대표 결과의 높은 확대 사진. (A) 그림 6D에 이미지의 광학 섹션. 이미지 두께 = 20 µ m. (B) 나이의 6 주에 heterozygous Crym egfp 마우스에서 EGFP 표시 된 하위 대뇌 프로젝션 뉴런. 두께 이미지 = 30 µ m. (C) Subcerebral 프로젝션 뉴런 (마젠타) 49, 및 parvalbumin 표현 셀 (녹색) AbScale 방법으로 시각화 했다 출생 후 하루에서 C57BL/6J 쥐의 폰으로 CTB488를 주입 하 여 분류 했다. 두께 이미지 = 55 µ m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Fluorophore</td>
			<td>예 (nm).</td>
			<td>필터 (nm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGFP</td>
			<td>910</td>
			<td>500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>tdTomato</td>
			<td>1000</td>
			<td>578-633 (D605/55 m, 크로마)</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 렉 사 Fluor 488</td>
			<td>750</td>
			<td>500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 렉 사 Fluor 555</td>
			<td>750</td>
			<td>563-588 (FF03-575/25-25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 렉 사 Fluor 594</td>
			<td>750</td>
			<td>601-657 (FF01-629/56, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>700</td>
			<td>400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 여기 파장 고 두 광자 현미경 검사 법에 대 한 필터.
표 2: AbScale 방법에 대 한 시 약. <a href="/files/ftp_upload/58027/JoVE_Table2_AbScaleReagents0411_1829_RE0425_1806.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항 원</td>
			<td>예방 접종된 동물</td>
			<td>제품 ID</td>
			<td>농도</td>
			<td>3 m m 블록</td>
			<td>500 μ m 조각</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>마우스</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>토끼</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>CTIP2</td>
			<td>쥐</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L6</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Statb2</td>
			<td>마우스</td>
			<td>ab51502</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAD67</td>
			<td>마우스</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>1: 200</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>GABA</td>
			<td>토끼</td>
			<td>A2052</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>마우스</td>
			<td>235</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>염소</td>
			<td>PV-가 서-Af460</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>마우스</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>토끼</td>
			<td>ab11427</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Somatostatin</td>
			<td>토끼</td>
			<td>T-4103</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>c-Fos</td>
			<td>토끼</td>
			<td>PC38</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 테스트 항 체의 침투. 3 m m 두꺼운 블록에 대 한 결과 표시 다음과 같습니다. 전체 피 질 두께;으로 L1-L6: 침투 계층 2/3;까지 L1-L2/3: 침투 -: 라벨; ND: 결정 되지. 500 µ m 두께 조각에 대 한 결과 표시 다음과 같습니다. +: 균일 한 라벨; -: 없음 또는 라벨.

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Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K 조회수.  RIKEN Brain Science Institute. 여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

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Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

연구

신경과학

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Anesthetized 쥐의 실리콘 프로브와 함께 대규모의 연결 Ensembles 녹음하기

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

3차원 모터 신경 오르간성 생성

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...