Ringraziamo tutti i membri attuali ed ex Kunkel Lab per il loro lavoro e discussioni relative al protocollo e riutilizzare i dati presentati qui. Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Z01 ES065070 a T.A.K. dalla divisione di ricerca intramurale degli istituti nazionali di salute (NIH), National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS).

1. alcalino idrolisi e Strand-specifico del sud della macchia (Figura 1)
<ol><li>Crescita delle cellule e isolamento di DNA genomic<ol>
<li>Isolare il DNA genomico utilizzando un kit di purificazione di DNA seguendo le istruzioni del produttore del lievito lievito. Utilizzare le culture che sono in fase esponenziale di crescita tra (una densità ottica pari a 0,5) e 1. Risospendere il pellet di DNA finale in 35 mL di 1x buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)).</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di 5 mg/mL RNasi al DNA ed incubare per 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Precipitare il DNA utilizzando 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M (pH 5.2) e 2,5 volumi di etanolo al 100% per 20 min su ghiaccio.</li>
		<li>Centrifuga a 16.000 x g per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Lavare la pallina due volte con 500 mL di etanolo al 70%. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Asciugare il pellet sul banco e risospendere in 35 ml di 1x buffer di TE.</li>
		<li>Quantificare il DNA utilizzando un fluorimetro (Tabella materiali) con il dsDNA BR Assay kit.</li>
		<li>Precipitare 5 mg di DNA da ogni campione utilizzando 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M, volumi di pH 5.2 e 2.5 di 100% EtOH per un volume totale di 200 mL (aggiungere H2O, se necessario, ulteriori 5 mg di DNA è necessario se il controllo di gel neutro è necessario). Incubare in ghiaccio per 20 min.</li>
		<li>Centrifuga a 16.000 x g per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Asciugare il pellet sul banco. Risospendere il DNA in 14 mL di H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Elettroforesi del gel e idrolisi alcalina<ol>
<li>Aggiungere 6 mL di 1 M di KOH e incubare a 55 ° C per 2 h.</li>
		<li>Incubare i campioni su ghiaccio per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 4 mL di buffer di caricamento DNA alcalino 6x: 300mm KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, polysucrose 18% (Tabella materiali), 0,15% di verde di bromocresolo e 0,25% xilene cianolo FF.</li>
		<li>Eseguire il cast un gel alcalino che si compone di agarosio all'1%, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Utilizzare un pettine che permette di 24 mL di campione di DNA per essere caricato per corsia.</li>
		<li>Esegua il gel a temperatura ambiente in tampone di elettroforesi alcalina 1x: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Includere un marcatore DNA appropriato.</li>
		<li>Rotazione verso il basso i tubi brevemente e caricare l'intero 24 mL di campione in gel dell'agarosi alcalina. Elettroforesi per 30 min a 30 V, seguita da 18-20 h a 10 V.</li>
		<li>Neutralizzare il gel per 2 incubazioni di 45 minuti ciascuno, a temperatura ambiente con agitazione delicata in tampone di neutralizzazione i: 1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl.</li>
		<li>Macchia di DNA immergendo il gel neutralizzato in 200 mL di acqua contenente una diluizione di 1/10.000 di macchia SYBR Gold per 2 h a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
		<li>Visualizzare il DNA utilizzando un transilluminatore UV. Alcali-sensibilità aumentata provoca la comparsa di piccoli frammenti di DNA, che indica una maggiore densità di ribonucleotidi non riparati in DNA5.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferimento del sud<ol>
<li>Trasferimento del DNA dal gel alcalino alla membrana di nylon caricato positivamente in azione capillare10. Un esempio di come questo trasferimento può essere impostato è fornito in Sambrook e di Russell manuale di10.</li>
		<li>Immergere il gel alcalino per 15 min a temperatura ambiente in tampone di trasferimento alcalino: 0,4 M NaOH, NaCl di 1m.</li>
		<li>Bagnare la membrana di nylon (tagliata alla dimensione del gel) brevemente con acqua e poi in ammollo per 5 min in tampone di trasferimento alcalino.</li>
		<li>Impostare la piattaforma di trasferimento capovolgendo 3 bicchieri in vetro (100 mL) in un pirofila di vetro. Questo piatto deve essere leggermente più grande rispetto alla dimensione del gel dell'agarosi. Impostare una lastra di vetro sopra di loro.</li>
		<li>Drappo 2 grandi pezzi di 3mm CHR cromatografia su carta (tagliare alla misura della larghezza del gel più lati più lunghi che possono drappo sopra i bordi nel serbatoio tampone) sopra la lastra di vetro.</li>
		<li>Versare tampone alcalino trasferire sopra il libro di cromatografia e riempire a metà il piatto di vetro. Appianare le bolle usando una pipetta di vetro da 5 mL.</li>
		<li>Adagiarvi il gel dell'agarosi, ancora appianare le bolle. Circondata da tutti i bordi del gel con parafilm. Versare una piccola quantità di tampone alcalino di trasferire sul gel.</li>
		<li>Posizionare la membrana pre-impregnati in nylon sulla superficie del gel. Appianare le bolle.</li>
		<li>Bagnato 2 pezzi di carta tagliato nella misura del gel dell'agarosi. Sopra la membrana e appianare eventuali bolle.</li>
		<li>Collocare una grande pila di tovaglioli di carta (tagliati a dimensioni leggermente superiori rispetto il gel di agarosio) sulla parte superiore del panino di trasferimento. Posizionare con attenzione una lastra di vetro sopra gli asciugamani di carta. Aggiungere un oggetto ponderato verso l'alto (un libro con una massa di 400 g funziona bene).</li>
		<li>Lasciare che il trasferimento procedere durante la notte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Attentamente smontare lo stack di trasferimento e immergere la membrana per 15 min a temperatura ambiente in tampone di neutralizzazione II: 0.5 M Tris-HCl, pH 7,2, NaCl di 1m.</li>
		<li>Crosslink il DNA per la membrana di nylon caricato utilizzando un reticolante UV. Posizionare la membrana nel reticolante e utilizzare l'impostazione di autocrosslink.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della sonda del sud Nota: L'approccio descritto qui per rilevare siti alcali-sensibile nella nascente leader-contro in ritardo-filo del filo del DNA si basa su un protocollo precedentemente pubblicato11. Per il nostro esperimento, il rilevamento viene eseguita presso il gene reporter URA3 che è stato inserito in uno dei due orientamenti (OR1 o OR2) adiacenti l'origine di replicazione di ARS306 sul cromosoma III (Figura 3A). La presenza di siti alcali-sensibile in DNA genomic di lievito è un indicatore di incorporazione ribonucleotide, permettendo l'uso di ribonucleotidi come biomarcatori del DNA polimerasi attività12,13,14. Questo approccio, utilizzando una sequenza di DNA adiacente per l'efficiente ARS306 origine di replicazione, destinazione dovrebbe essere suscettibile di altre posizioni genomiche e geni bersaglio pure.<ol>
<li>PCR-amplificare una 520-base di segmento di coppia del gene del reporter URA3 utilizzando la seguente coppia di primer: URA3-F1 (a 5 minuti-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) e URA3-R1 (a 5 minuti-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>Eseguire la reazione di PCR utilizzando 10-20 ng di DNA genomico di lievito come un modello, 4 μL di ogni primer (10 stock μM), 10 μL di 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 8 μL di miscela di dNTP (2,5 mM), 0,5 μL di Ex Taq DNA polimerasi (5 U / µ l) e regolare il volume finale di 100 μL con H2O.</li>
		<li>Eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 5 min; 30 cicli di 95 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 min, 72 ° C per 2 min; 72 ° C per 10 min e permanenza a 4 ° C.</li>
		<li>Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione di PCR ed eluire il DNA con 50 mL di H2O. Ciò può ora essere utilizzato come modello nella reazione radiolabeling.</li>
		<li>Utilizzare i seguenti primer per radiomarcatura strand-specifiche: uso URA3-A (a 5 minuti-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) per la visualizzazione di DNA che si accoppia alla sonda A. Ciò corrisponde al DNA nascente leader filo quando URA3 è in OR2 e tnascent lagging strand DNA quando URA3 è in OR1. Utilizzare URA3-B (a 5 minuti-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) per la visualizzazione di DNA nascente che accoppia alla sonda B. Ciò corrisponde al DNA nascente leader filo quando URA3 è in OR1 e nascente lagging strand DNA quando URA3 è in OR2 (Figura 3).<ol>
<li>Eseguire la reazione radiolabeling con 10-20 ng amplificato URA3 frammento come modello del DNA, 2 µ l di primer (stock 10 μM), 5 μL di 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 4 μL di dNTPs 2,5 mM (meno dCTP), 5 μL (50 μCi) di un -32P-dCTP , 0,5 μL di ExTaq DNA polimerasi (5 U / µ l) e regolare il volume finale di 50 μL con H2O. Esegui il seguente programma per radiomarcatura: 94 ° C per 5 min; 25 cicli di 94 ° C per 1 min, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min; 72 ° C per 5 min e permanenza a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare una colonna di spin G-25 per rimuovere etichetta radioattivo non incorporata. Prima dell'aggiunta del campione radiomarcato, centrifugare la colonna per 1 min a 720 x g e togliele tampone pipettando. Caricare il prodotto di reazione radiomarcato e centrifugare per 2 min a 720 x g per eluire il probe marcato.</li>
		<li>Incubare a 95 ° C per 5 min denaturare la sonda immediatamente prima dell'ibridazione. Raffreddare brevemente su ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Ibridazione del sud<ol>
<li>Rotoli la membrana a contatto col prodotto in una provetta di ibridazione e aggiungere 25 mL di tampone di ibridazione preparata al momento: tampone fosfato di sodio 0,5 M, pH 7.2, 7% sodio dodecil solfato (SDS), 1% albumina di siero bovino (BSA). Incubare a 65 ° C per 1-2 h con rotazione in un forno di ibridazione.</li>
		<li>Attentamente versare la soluzione e aggiungere 25 mL di tampone di ibridazione più la sonda radiomarcata. Incubare a 65 ° C per 16-18 h con rotazione.</li>
		<li>Versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivo. Eseguire 5 lavaggi di 5 minuti ciascuno, a temperatura ambiente con tampone fosfato di sodio di fosfato-SDS lavaggio soluzione i: 40 mM, pH 7,2, pH di 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 8.0.</li>
		<li>Eseguire 2 lavaggi di 15 minuti ciascuno, a 65 ° C con fosfato-SDS II di soluzione di lavaggio: tampone fosfato di sodio 40 mM, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Rimuovere la membrana dal tubo dell'ibridazione con pinzette e posto in un protettore manicotto di plastica aperto. Coprire ed esporre a una piastra di imaging. Provare un numero di tempi che vanno da 4 h a 4D di esposizione differente.</li>
		<li>Se necessario, striscia e ri-sonda la macchia usando una sonda diversa circa 3 - 4 volte. Per mettere a nudo, incubare la membrana per 2 h a 65 ° C in 25 mL di una 50% formammide, 2 x SSPE soluzione. Nota: soluzione di riserva x SSPE 20: 3 M di NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7,4.</li>
		<li>Versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivo. Eseguire 2 lavaggi di 15 minuti ciascuno, a 65 ° C in fosfato-SDS II di soluzione di lavaggio.</li>
		<li>Controllare la membrana con un contatore Geiger e ripetere il protocollo "stripping" Se il segnale rimane.</li>
		<li>Eseguire la pre-ibridazione e ibridazione come descritto sopra.</li>
	</ol></li>
</ol>2. misurare il tasso di mutazione e specificità nei ceppi di S. cerevisiae
<ol><li>Preparare la coltura delle cellule<ol>
<li>Inoculare una colonia singola (colonie di 2-3 giorni a 30 ° C alla forma corretta dimensioni del prende di cellule di lievito sano) coltivata su agar YPD supplementato con adenina 100 mg/mL 5 mL di brodo YPDA completato con adenina di 250 mg/mL (il completamento di adenina è necessaria solo se il ceppo utilizzato è un auxotroph di adenina). Crescere in un incubatore shaker o in un rotatore a 30 ° C fino a quando la cultura raggiunge la saturazione (36-48 h per un ceppo senza un difetto di sviluppo severo).</li>
		<li>Rotazione verso il basso le cellule a ~ 2000 x g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante e lavare le cellule con 5 mL di acqua sterile.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 500 mL di acqua sterile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluizione della coltura delle cellule e placcatura<ol>
<li>Per i controlli non-selezione, diluire le cellule in una piastra a 96 pozzetti da un fattore di 1.600.000 e piastra 100 mL di ogni cultura in un piatto completo di (COM).</li>
		<li>Per selezionare per ura3 mutanti, piastra 100 mL di cellule non diluite su un piatto di 5-FOA per un ceppo di wild type (WT). Diluire le cellule di conseguenza se il tasso di mutazione del ceppo di interesse dovrebbe essere superiore a in un ceppo WT.</li>
		<li>Per selezionare per can1 mutanti, diluire 5 volte le cellule e piastra 100 mL su un piatto contenente canavanina (CAN) per un ceppo WT. Il fattore di diluizione è 0,5.</li>
		<li>Incubare le piastre a 30 ° C fino a forma di colonie del lievito. Per i ceppi senza un difetto di crescita, 2-3 giorni è di solito sufficiente per COM e può piastre e 3-5 giorni per piastre 5-FOA. Per confrontare i tassi di mutazione tra diversi ceppi, si consiglia di scegliere il giorno stesso della crescita per contare le colonie. Conservare le piastre pronte essere contato in camera fredda (~ 4 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolo del tasso di mutazione spontanea<ol>
<li>Contare le colonie visibili su ogni piatto e prendere nota dei numeri di Colonia</li>
		<li>Calcolare il tasso di mutazione usando la formula di Drake: μ = f ÷ ln (μNt). f è la frequenza di mutazione calcolata secondo il numero di mutanti diviso numero di cellule nella coltura finale. NT è il numero di cellule nella coltura finale e μ è il tasso di mutazione. Questa equazione può essere risolta con un metodo iterativo, ad esempio il metodo di Newton-Raphson. Ci sono altri metodi per la stima, compresa la prova di Lea e Coulson, per calcolare il tasso di mutazione15.</li>
		<li>Calcolare l'intervallo di confidenza assumendo registro distribuzione normale delle tariffe reputazione dei singoli isolati. L'intervallo di confidenza del 95% è più spesso utilizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi dello spettro di mutazione<ol>
<li>Scegliere una singola Colonia da ogni 5-FOA o può placcare e aggiornare su un piatto YPDA.</li>
		<li>Eseguire la PCR per amplificare il gene URA3 o CAN1 e la sequenza al fine di rilevare le mutazioni utilizzando i seguenti primer della Colonia: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') e URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') per entrambi l'amplificazione di PCR e sequenziamento del gene URA3 bp 800; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') e CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') per l'amplificazione e CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') e (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') per il sequenziamento del gene reporter CAN1 bp 1800.</li>
		<li>Per eseguire la PCR della Colonia, risospendere una singola Colonia in 5 μL di H2O e 1 μL di utilizzare come modello. Aggiungere 1 μL di ciascuno dei primer (5 stock μM), 2 μL di tampone di x KAPA2G 5 (Mg2 + plus), 0,5 μL di dNTP (2,5 mM), 0,5 μL di KAPA2G veloce DNA polimerasi, 12 μL di H2O.</li>
		<li>Per l'amplificazione del gene URA3 , eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 5 min; 5 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 30 s; 35 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 30 s; 72 ° C per 2 min e permanenza a 4 ° C. Per l'amplificazione del gene CAN1 , eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 5 min; 5 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 45 s; 35 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 45 s; 72 ° C per 2 min e permanenza a 4 ° C.</li>
		<li>Allineare i risultati del sequenziamento di una sequenza di riferimento utilizzando un programma come DNASTAR Seqman Pro o Sequencher per identificare mutazioni.</li>
		<li>Compilare i dati di mutazioni di tipo di mutazione (Figura 4) o mutazione posizione (Figura 5). Calcolare le tariffe di mutazione specifica per la frequenza di mutazione (il numero degli eventi osservati diviso per numero di mutanti sequenziati) moltiplicano per il tasso di mutazione globale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+sugar:+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate.">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li><li>Sparks, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha,+epsilon,+delta,+and+zeta.">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li><li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+{alpha}+and+{delta}.">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li><li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon.">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity.">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).</li><li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development.">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition.">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, descriviamo i protocolli per due serie di esperimenti che vengono spesso utilizzati per analizzare semi-quantitativamente ribonucleotidi incorporati durante la replicazione del DNA e gli effetti mutageni di ribonucleotidi non riparati. Sebbene questi approcci comportano eucariote il modello S. cerevisiae, queste tecniche possono essere facilmente adattate ad altri microbi e persino più alti eucarioti.
Sondaggio per ribonucleotidi non riparati nel DNA usando l'elettroforesi alcalina-agarosio accoppiato con Southern blotting fornisce informazioni importanti per quanto riguarda il numero di ribonucleotidi presenti e lo strand in cui essi sono stati incorporati. Tuttavia, è importante notare che alcali-la sensibilità può essere causata anche da altre lesioni del DNA, ad esempio un sito abasic. Un altro mezzo di rilevazione ribonucleotidi in DNA è dal trattamento con enzima RNasi H2 purificato, come è stato fatto in cellule di mammifero21. Anche se il nostro approccio è sondare per siti alcali sensibili nella nascente protagonista contro fili presso il gene reporter URA3 utilizzato nei nostri esperimenti di analisi mutational in ritardo di sviluppo, è possibile progettare le sonde che temprano presso altre sedi in ordine per ottenere informazioni importanti per quanto riguarda ribonucleotide densità presso altri siti genomici. La parte del sud della macchia della procedura utilizzabile anche come riferimento per altri esperimenti di tastatura DNA generici.
Misurazione dei tassi di mutazione usando una prova di fluttuazione è stato ampiamente utilizzato per l'analisi di vari eventi mutageni nei microrganismi e così non si limita all'analisi delle conseguenze mutagene di ribonucleotidi nel DNA. Per questo esperimento, aumentando il numero delle culture indipendenti possa migliorare notevolmente la precisione di misura. Colonie indipendenti possono essere ottenuti da striature un ceppo di interesse sul supporto YPDA o dall'analisi delle colonie indipendenti spora ottenute tramite la dissezione tetrade di una macchia di lievito diploide. Idealmente, l'uso di più ceppi di lievito aploidi indipendente (ad es., da dissezione tetrade) è incoraggiato a minimizzare l'impatto della variazione di ceppo a ceppo. Ciò è particolarmente importante quando il tasso di mutazione spontanea è alto o quando il ceppo ha un difetto di crescita. Un metodo aggiuntivo che può essere impiegato per misurare spontaneo il tasso di mutazione è un accumulo di mutazione sperimentare22. In questa analisi, frequenza di mutazione per le celle è determinato dopo vasto sviluppo e può essere utilizzato per calcolare il tasso di mutazione. Accoppiamento di un esperimento di accumulo di mutazione con tecnologia di sequenziamento profondo ha dimostrato di essere un potente strumento per analizzare il tasso di mutazione e la specificità in tutto il genoma.

Durante la replicazione nucleare eucariotiche, ribonucleotidi sono incorporati nel genoma di tutti i tre principali replicases di DNA, DNA polimerasi (Pols) α, ε e δ1,2. Riparazione per escissione RNasi H2-dipendente ribonucleotide (RER3) rimuove la maggior parte di questi ribonucleotidi incorporati.
Un ribonucleotide nel DNA è suscettibile di idrolisi, come il gruppo dell'idrossile 2' della parte dello zucchero in grado di attaccare il legame fosfodiesterico adiacente, rilasciando un'estremità con un 2' - 3' fosfato ciclico e l'altra con un 5'-OH4. Condizioni alcaline possono notevolmente accelerare questa reazione. Così, l'idrolisi di ribonucleotidi incorporati durante l'incubazione in una soluzione di base provoca la frammentazione del DNA genomico, che possa essere visualizzata da alcalino-agarosio elettroforesi5. Questo DNA può essere trasferito ad una membrana e sondato dall'analisi del sud della macchia usando sonde di strand-specific che permettono l'identificazione dei siti alcali-sensibile causato da ribonucleotidi incorporati nel nascente leader - o in ritardo-filo del DNA, rispettivamente.
In cellule di lievito che difetta dell'attività RNasi H2, rimozione di ribonucleotidi può essere avviato quando topoisomerasi io (Top1) Nick il DNA al incorporato ribonucleotide6,7. Tuttavia, quando Top1 si unirà sul lato 3' della ribonucleotide, questo genera 5'-OH e 2' - 3' fosfato ciclico DNA finisce che sono refrattari alla religation. La mancata riparazione o l'elaborazione aberrante di questi 'estremità sporca' può portare a instabilità genomica. Inoltre, se l'incisione avviene all'interno di una sequenza ripetuta di DNA, il processo di ripristino può portare a mutazioni di omissione. Ciò è particolarmente problematico per ripetizioni in tandem, dove breve eliminazioni (di tra due e cinque coppie di basi) sono comunemente osservati in cellule RNasi H2-carenti. Gli effetti deleteri di Top1-dipendente in assenza di lievito RNasi H2 attività sono aggravate in un mutante ε di DNA polimerasi (pol2-M644G) promiscuo per incorporazione ribonucleotide durante la sintesi di filo leader nascente.
Elaborazione di ribonucleotidi in DNA conduce a mutazioni spontanee e la mutagenesi può essere rilevata utilizzando geni reporter appropriato e selezionando per il cambiamento fenotipico accompagnamento. Un test di fluttuazione o esperimento Luria e Delbrück è uno dei metodi più comunemente usati per misurare i tassi di mutazione spontanea utilizzando geni reporter selezionabile8,9. In lievito, i geni URA3 e CAN1 possono essere utilizzati come reporter nel test di mutazione in avanti, che consente il rilevamento di tutti i tipi di mutazione che provocano la perdita della funzione del gene. Il tasso di mutazione spontanea è stimato come la mediana di quello osservato per più culture parallele iniziate dalle singole colonie senza mutazioni del gene del reporter di destinazione. Un lievito ceppo RNasi H2-carente come rnh201Δ ha un tasso di mutazione spontanea nel complesso moderatamente elevato che è in gran parte causato da un'elevata incidenza di 2-5 eliminazioni di bp in tandem ripetere sequenze. Così, per caratterizzare completamente gli effetti mutageni di ribonucleotidi nel genoma, tassi di mutazione specifico necessario determinare. In questo caso, i geni reporter URA3 o CAN1 possono essere amplificati ed ordinati per determinare i tipi e le posizioni delle mutazioni, e tassi di mutazione specifica possono essere calcolati. Compilazione di mutazioni identificate in mutanti URA3 o CAN1 indipendenti multipli quindi può essere utilizzata per generare uno spettro di mutazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 &#8211; 35 ml per plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAN plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 56 &#176;C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 60 &#176;C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Canavanine sulfate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>F5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass culture tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture rotator in 30 &#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shaker incubator can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm glass beads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312A</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq DNA Polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>MPY80200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Newer model available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Dot Scientific Inc.</td>
			<td>DSF10400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromocresol green</td>
			<td>Eastman</td>
			<td>6356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>International Technologies Inc.</td>
			<td>72120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Nylon membrane Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 MM CHR Chromotography paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7560-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-25 spin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-5325-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NaH2PO4 (S9638); 
			Na2HPO4 (S9390)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis

La presenza di ribonucleotidi in DNA nucleare ha dimostrata di essere una fonte di instabilità genomica. La misura dell'incorporazione del ribonucleotide può essere valutata da idrolisi alcalina ed elettroforesi su gel come RNA è altamente suscettibile di idrolisi in condizioni alcaline. Questo, in combinazione con l'analisi del sud della macchia può essere utilizzato per determinare la posizione e filo in cui sono stati incorporati i ribonucleotidi. Tuttavia, questa procedura è solo semi-quantitativa e potrebbe non essere abbastanza sensibile da rilevare piccole variazioni nel contenuto ribonucleotide, sebbene filo specifico del sud della macchia di sondaggio migliora la sensibilità. Come misura di uno delle conseguenze biologiche più eclatante di ribonucleotidi nel DNA, mutagenesi spontanea possono essere analizzata usando un'analisi di mutazione in avanti. Utilizzando i geni reporter appropriato, mutazioni rare che comporta la perdita della funzione possono essere selezionata e nel complesso e tassi di mutazione specifica possono essere misurati mediante la combinazione di dati provenienti da esperimenti di fluttuazione con sequenziamento del DNA del gene del reporter. Il test di fluttuazione è applicabile per esaminare un'ampia varietà di processi mutageni in background genetico specifico o le condizioni di crescita.

Trattamento del DNA genomico con alcali seguita da elettroforesi alcalina permette di rilevazione semi-quantitativa della frammentazione del DNA a causa dell'abbondanza di ribonucleotidi stabilmente incorporati. La figura 2 Mostra le immagini di gel di lievito DNA genomic trattato con o senza KOH5. La variante M644L del Pol2, la subunità catalitica della Polε, ha ridotto la capacità di incorporare ribonucleotidi, mentre il mutante M644G incorpora più ribonucleotidi rispetto la polimerasi WT. Come descritto nel protocollo, il gel alcalino può essere ulteriormente sondato mediante filo specifico Southern blot. Con la conoscenza della posizione del sito genomico sondato rispetto le sue origini adiacenti, noi possiamo selettivamente sonda ribonucleotidi incorporati nel nascente iniziali o in ritardo di fili. La figura 3 Mostra i risultati del sud della macchia sondando il gene reporter URA3 inserito in due opposti orientamenti nei pressi di un'origine di replicazione precoce-infornamento, ARS30616. Utilizzando leader filo-specifiche sonde, osserviamo che il modello di frammentazione del DNA causata da alcali-fenditura a ribonucleotidi nel nascente leader strand DNA in un ceppo WT e negli sforzi che esprimono le varianti della polimerasi α, δ e ε promiscue per incorporazione del ribonucleotide.
Utilizzando un esperimento di fluttuazione, possiamo misurare i tassi di mutazione di ceppi di lievito contenente geni reporter. La figura 4 Mostra i tassi di mutazione URA3 e CAN1 loci dei ceppi esprimendo la polimerasi WT o il mutante pol2-M644G con o senza funzionale RNasi H2. La mancanza di RNasi H2 provoca un aumento moderato in generale tassi di mutazione in entrambi gli ambiti di provenienza. Tuttavia, un esame più attento della specificità di mutazione rivela che in ceppi carente RNasi H2 (Figura 5), c'è un forte aumento del tasso di mutazione per breve delezioni, particolarmente nel ripetere sequenze tandem. Figura 5A confronta la specificità di mutazione in WT e rnh201Δ ceppi e figura 5B Visualizza l'effetto mutational di ulteriore ribonucleotide elevata incorporazione filo leader del nascente di DNA da Pol ε.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig1.jpg"> Figura 1: protocollo passaggi coinvolti nella rilevazione strand-specifica del siti alcali-sensibile causato da incorporazione ribonucleotide DNA genomic lievito. Una panoramica dei vari passaggi principali coinvolti in questa procedura, cominciando con isolamento di DNA genomic di lievito e procedendo attraverso l'analisi finale del sud della macchia. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig2.jpg"> Figura 2: un'immagine rappresentativa di risultati ottenuti tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi alcalina. Questa figura è stata adattata da Nick McElhinny, S. A. et al. 5. il DNA genomic lievito da ceppi di genotipi differenti è stato trattato con KCl (neutro) o KOH (alcalino) e poi separati su gel di agarosio neutri o alcalini. "WT" e "M644G" indicano lo stato del Pol ε. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig3.jpg"> Figura 3: Strand-specifico sondaggio di un gel di agarosio alcalini dalla macchia del sud. Questa figura è stata adattata da Williams, J. S. et al. 13. (A) le sonde radiomarcate temprano il filamento di DNA nascente leader all'interno del gene del reporter di URA3 che è stato inserito nei pressi di ARS306 in due orientamenti opposti (OR1 e OR2). (B) risultati rappresentativi di Southern blotting usando sonde nascente leader filo-specifici. Vengono visualizzate i risultati di sondaggio per il nascente strand leader in un ceppo con polimerasi del DNA di WT, o il pol1-L868M, pol2-M644G o pol3-L612M ceppi varianti con o senza RNasi H2. I POL1, POL2 e POL3 geni codificano per subunità catalitiche di Pols α, ε e δ, rispettivamente. Le varianti sono più promiscue per ribonucleotide incorporazione5,12,17. (C) quantificazione del segnale radioattivo dalla frazione del totale in ogni corsia da (B). I valori sono espressi come percentuale del totale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig4.jpg"> Figura 4: tassi di mutazione spontanea in ceppi di lievito. Questa figura è stata adattata da Nick McElhinny, S. A. et al. 5. la URA3 e CAN1 geni reporter sono stati utilizzati nell'analisi della mutazione in avanti per misurare i tassi di mutazione dei ceppi indicati. URA3 reporter è in "orientamento 2" (OR2, Figura 3A). L'intervallo di confidenza 95% (CI) è incluso per ogni misurazione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig5.jpg"> Figura 5: spettri di mutazione per il gene reporter URA3-OR2. Questa figura è stata adattata da precedenti pubblicazioni5,18,19,20. Il tipo di posizione e mutazione osservato in ogni Colonia 5-FOA-resistente indipendente selezionato nell'analisi della mutazione in avanti sono raffigurati nell'804 bp URA3 sequenza di codificazione. Le lettere indicano base sostituzioni, aperti triangoli indicano le eliminazioni di base singole, chiuso i triangoli indicano inserimenti base singoli e linee continue indicano le eliminazioni breve. (A) spettri di mutazione in ceppi WT e rnh201Δ . Contrassegni di colore rosso sopra la sequenza sono mutazioni osservate in WT, mentre le etichette blue sotto la sequenza sono quelle osservate in un ceppo di rnh201Δ . (B) gli spettri di mutazione in ceppi pol2-M644G e pol2-M644G rnh201Δ . Contrassegni di colore rosso sopra la sequenza sono mutazioni osservate in pol2-M644G mentre blu sotto la sequenza per ceppi pol2-M644G rnh201Δ . <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58020/58020fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Ribonucleotidi sono tra i più abbondanti nucleotidi non canonico incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA nucleare negli eucarioti. Se non correttamente rimosso, ribonucleotidi possono causare mutagenesi e danno del DNA. Qui, presentiamo due approcci sperimentali che sono utilizzati per valutare l'abbondanza di incorporazione ribonucleotide del DNA e dei suoi effetti mutageni.

Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K Views.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS. Ribonucleotidi sono tra i più abbondanti nucleotidi non canonico incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA nucleare negli eucarioti. Se non correttamente rimosso, ribonucleotidi possono causare mutagenesi e danno del DNA. Qui, presentiamo due approcci sperimentali che sono utilizzati per valutare l'abbondanza di incorporazione ribonucleotide del DNA e dei suoi effetti mutageni.

Video: Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Durata pannello misura replicazione in lievito

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Espressione di proteine ​​ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Singolo ovociti Mutagenesi bisolfito

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...