KP e AS ha scritto e rivisto il manoscritto. KP eseguito gli esperimenti e l'analisi. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) carriera transizione premio (K22AI112816) per As

Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso la University of California, Irvine.
1. tamponi e soluzioni
<ol><li>Preparare Lisogenesi brodo (LB) in una bottiglia di vetro 1L aggiungendo 25 g di mix LB-Miller in 1 L di acqua bidistillata (ddH2O). Per piastre di Petri, aggiungere un ulteriore 20 g di agar. Autoclave per sterilizzare. Versare 25 mL di terreno agar fuso in 10 cm-Diametro piastre di Petri e lasciare solidificare a temperatura ambiente. Archivio media liquidi a temperatura ambiente e piastre di agar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare piatti di glucosio lievito Peptone (GYP) in una bottiglia di vetro 1L mescolando 1 g di D-glucosio, Estratto di 2 g di peptone, 0,25 g di lievito, 4,2 g di KH2PO4, 5,1 g di Na2HPO47 H2O e 25 g di agar-agar in 1 L di ddH2 O. Autoclave per sterilizzare. Versare 25 mL di agar fuso in 10 cm-Diametro piastre di Petri e lasciare solidificare a temperatura ambiente. Conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare il supporto di Peptone S (PS) in una bottiglia di vetro 1L mescolando 10 g di peptone, Estratto di 7 g di lievito, 15 g di D-glucosio, 0,12 g di Na2HPO47 H2O, 1,4 g di KH2PO4, 40 µ g di vitamina B12 , e 80 µ g di acido folico in 800 mL di ddH2O. calibrare un phmetro elettronico utilizzando pH 4 e pH 7 standard se il pH-metro non è stato utilizzato entro un giorno.<ol>
<li>Misurare il pH del mezzo PS utilizzando il pH-metro. Aggiungere 5 M KOH o 5m H3PO4 per regolare il pH a 6.5. Regolare il volume finale di 1L con ddH2filtro O. sterilizzare utilizzando filtro vuoto di 0,22 µm e conservare a 4 ° C. Nota: Procedere con cautela con le regolazioni di pH di indossare protezioni tra cui guanti, indumenti protettivi, occhiali di protezione e protezione viso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 10 x sviluppo Buffer Prime (DB') buffer in una bottiglia di vetro 1L aggiungendo 3,4 g di KH2PO4, 13,4 g di Na2HPO4 7 H2O e ddH2O ad un volume totale di 800 mL. Calibrare un phmetro elettronico utilizzando pH 4 e pH 7 standard se il pH-metro non è stato utilizzato entro un giorno.<ol>
<li>Misurare il pH del buffer utilizzando il phmetro elettronico. Aggiustare il pH a 6.5 aggiungendo delicatamente 5m KOH o 5m H3PO4 come necessario. Regolare il volume finale di 1L utilizzando ddH2O e sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente. Nota: Procedere con cautela con le regolazioni di pH di indossare protezioni tra cui guanti, indumenti protettivi, occhiali di protezione e protezione viso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare 1 x sviluppo tampone (DB) mescolando 100 mL di 10 x DB' buffer con 1 mL di sterilizzato 2 M MgCl2, e 1 mL di sterilizzato 1m CaCl2. Regolare il volume finale di 1 L in bottiglia di vetro 1L utilizzando un ddH sterilizzati in autoclave2O. Store a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare il supporto di PS:DB in bottiglia di vetro 1L mescolando 100 mL di terreno di PS sterilizzato, 100 mL di sterilizzato 10 x DB' buffer e sterilizzato ddH2O ad un volume totale di 1 L. supplemento con 1 mL di sterilizzato 2 M MgCl2 e 1 mL di sterilizzato 1 M CaCl 2. Conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare la soluzione di riserva di calceina-AM aggiungendo 50 µ l di DMSO a 50 µ g di calceina-AM in contenitore di plastica fornito dal produttore. Conservare a-20 ° C.</li>
</ol>2. crescita e il mantenimento delle amebe
<ol><li>Crescere e. coli ceppo b/r17 come una fonte di cibo per amebe durante il periodo iniziale di crescita. Striscia e. coli b/r da uno stock congelato conservati a-80 ° C su una piastra di agar LB e incubare a 37 ° C durante la notte per ottenere singole colonie.</li>
	<li>Inoculare una singola colonia di e. coli b/r in 2 mL di terreno LB e incubare in un tamburo di rullo o uno shaker a 37 ° C per una notte.</li>
	<li>Portare il pernottamento cultura di Escherichia coli alla temperatura ambiente. Utilizzando un bastone di legno, inoculare amebe da uno stock congelato conservati a-80 ° C in 750 µ l della coltura durante la notte. Nota: Uso d. discoideum lo sforzo AX3, che è capace di crescita axeniche18. Questo passaggio non richiede crescita axenica, ma i passaggi successivi avrà il suo requisito.</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 700 µ l della miscela die. coli amebe - su un piatto di glucosio lievito Peptone (GYP). Diffondere la cultura in modo uniforme sulla superficie della piastra di inclinarlo in avanti e indietro e side-to-side come necessario. Evitare l'uso di una spatola.</li>
	<li>Posizionare la piastra GYP con agar rivolto verso l'alto in una scatola che mantiene l'umidità alta. Utilizzare due contenitori di plastica usa e getta (183 x 183 cm x 91 cm) impilate sulla cima di ogni altro. Riempire il cestello inferiore con circa 25 mL di acqua e posizionare il recipiente superiore con diversi fori di diametro di cm 0,5 forati attraverso il pavimento del contenitore per permettere all'umidità di spostare dal serbatoio dell'acqua nel contenitore superiore.</li>
	<li>Incubare la piastra di GYP e casella a 22 ° C per 4-5 giorni fino a quando le spore ameba si osservano crescita vicino alla superficie della piastra (Figura 2). Utilizzare un incubatore refrigerato per incubare le piastre invece di incubazione a temperatura ambiente. Nota: Dopo che le spore sono cresciuti, rimangono valide sulle piastre per diverse settimane se conservato a 4 ° C. Conservare le lastre con il lato agar rivolto verso l'alto. Dopo 3-4 giorni di incubazione, zone di schiarimento entro il prato batterico possono essere osservati, che indicano l'inizio della sporulazione ameba.<ol>
<li>Osservare piccole amebe spore sopra la superficie della piastra dopo 4-5 giorni di incubazione (Figura 2). Nota: Non si sviluppano le amebe per più di una settimana, come la qualità delle spore diminuisce di là di questo periodo di tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere le spore di amebe a preparare per la crescita axenica delle amebe da spazzare la punta di una pipetta sterile da 1 mL parallela alla superficie della piastra. Raccogliere le spore da metà di una capsula di Petri di 10 cm. Nota: Evitare di toccare la punta alla superficie della piastra agar come questo movimento raccoglierà grandi numeri di e. coli.</li>
	<li>Risospendere le amebe sulla punta della pipetta immergendo la punta in 1 mL di terreno di PS e pipettare delicatamente su e giù.</li>
	<li>Trasferire il composto inoculato in una beuta da 250 mL contenente 25 mL di terreno PS completato con l'antibiotico antimicotico soluzione a concentrazione x 0,25. Nota: Conservare la soluzione di antibiotico antimicotico come 250 aliquote di µ l a-20 ° C. Evitare ripetuti cicli di scongelamento e congelamento di questa soluzione in quanto questo può ridurre la sua efficacia.</li>
	<li>Crescere amebe axenically a 22 ° C in un agitatore rotante a 100 giri/min. Per il dosaggio di virulenza nel passaggio 5, far crescere cellule ad una densità ottica misurata a 600 nm (OD600) di 0,2-0,5. Nota: Questo passaggio richiede 3-4 giorni di crescita dal momento dell'inoculazione (punto 2.7). Se le cellule sono cresciute a una maggiore densità, diluire la cultura torna in PS medium a un OD600 minore o uguale a 0,05 e crescere torna a un OD600 di 0,2-0,5.</li>
</ol>3. la crescita di p. aeruginosa
<ol><li>Scegliete una singola colonia di p. aeruginosa da una piastra LB, inoculare esso in un mL 2 PS:DB cultura e crescere durante la notte a 37 ° C per saturazione. Nota: Non aggiungere la soluzione di antibiotico antimicotico ai media PS:DB.</li>
	<li>Diluire il pernottamento cultura 1: 100 o 1:1,000 in una capsula Petri 6 cm di diametro utilizzando PS:DB. Se la virulenza delle cellule planctoniche è esclusivamente essere dosata, crescono le culture utilizzando provette di coltura convenzionale invece. Agitare la cultura in un rotatore di benchtop impostato a 100 giri/min a 37 ° C.</li>
	<li>Culture di raccolto a intervalli di tempo specifici per garantire la riproducibilità. A 30 min a 1 h prima di valutare la virulenza, preparare un tampone di agar come descritto nella sezione 4. Nota: La virulenza di p. aeruginosa è indotta da circa 8 h di crescita sulle superfici.</li>
	<li>Per isolare le cellule di superficie-collegata, rimuovere il mezzo liquido da di Petri, lavare immediatamente con 1 mL di tampone di DB per rimuovere le cellule planctoniche e passa direttamente al punto 5.1. Attenzione: Non lavare più di 30 s come questa volontà perturbare e staccare le cellule attaccate in superficie e possono influenzare la misurazione di virulenza.</li>
	<li>Per isolare le cellule planctoniche, trasferire 10 µ l della coltura da di Petri per un piatto di Petri pulito e passa direttamente al punto 5.1.</li>
</ol>4. microscopia - preparazione del Pad Agar
<ol><li>Preparare pastiglie agar circa 30 min a 1 h prima di amebe sono pronte essere miscelato con p. aeruginosa.</li>
	<li>Forno a microonde 50 mL di agar di 1% (p/v) in buffer di DB in un pallone da 250 mL. Mix ogni 20 s fino a ciuffi di agar scompaiono.</li>
	<li>Raffreddare l'agar fuso collocandolo in bagno d'acqua preriscaldata 55 ° C per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 15 µ l di soluzione madre calceina-AM a 15 mL di agar fuso in una provetta conica. Mescolare capovolgendo delicatamente la provetta 4 - 5 volte e procedere immediatamente al passaggio successivo. Nota: Eseguire questo passaggio in una provetta da centrifuga da 15 mL in polipropilene. Non utilizzare un contenitore di vetro di spessore come questo farà sì che l'agar solidificare troppo in fretta.</li>
	<li>Versare il composto di agar fuso sopra una lastra di vetro di 12 x 10 cm e consentire l'agar solidificare per 10 minuti a temperatura ambiente. Tagliare il pad di agar solidificato in sezioni più piccole di 1,5 x 1,5 cm posizionando la lastra di vetro sopra una griglia stampata e taglio lungo la griglia utilizzando un righello di metallo.</li>
	<li>Mantenere il gel idratato in una scatola di umida fino a quando è pronto per l'uso.</li>
</ol>5. microscopia - preparazione del campione da batteri-ameba per l'Imaging
<ol><li>Per analizzare la virulenza delle cellule batteriche collegata alla superficie, aggiungere 10 µ l di cellule ameba dal passaggio 2.10 ai batteri collegata alla superficie da punto 3.4. Nota: Questo passaggio descrive la miscelazione delle amebe con batteri.</li>
	<li>Per analizzare la virulenza delle cellule planctoniche, mescolare 10 µ l di cellule di ameba dal punto 2.10 con 10 µ l di batteri planctonici dal punto 3.5. Nota: Non lavare le cellule coltivate axenically ameba (presso un OD600 di 0,2-0,5) prima della miscelazione con i batteri. Nessuna crescita di e. coli sarà osservata nella cultura ameba a causa dell'utilizzo della soluzione antibiotico antimicotico.</li>
	<li>Immediatamente è possibile posizionare la piastra di agar di calceina-AM 1,5 x 1,5 cm dal passaggio 4.5 sopra la miscela di batteri-ameba sulla superficie di Petri. Nota: Inserire il cuscinetto di agar sopra il composto con un movimento rapido e regolare. Non abbassare il tampone lentamente sulla miscela come questo movimento tende a spingere le cellule verso la periferia e dalla parte inferiore del pad. Questa operazione garantirà che i batteri e le amebe sono uniformemente mescolato, immobilizzato e che entrambi tipi di cella sono circoscritti allo stesso piano.</li>
	<li>Rimuovere il liquido in eccesso pipettando delicatamente fuori qualsiasi liquido restante che circonda il pad di agar. Consentire di Petri ad asciugare per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coprire con la capsula di Petri con un coperchio e incubare la miscela immobilizzato ameba-batteri a temperatura ambiente per un ulteriore 40 min. procedi al punto 6.1. Nota: È importante incubare tutti i campioni per la stessa quantità di tempo, come la priorità bassa fluorescenza aumenta nel tempo. Si raccomanda un tempo di incubazione di 1 h. Le incubazioni per più di 1 h sono meno riproducibile come cellule di amebe possono cominciare a scoppiare.</li>
</ol>6. microscopia - acquisizione di immagini
<ol><li>Amebe di immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza in grado di acquisire immagini di fluorescenza campo chiaro e verde. Per fluorescenza verde, utilizzare filtri di fluorescenza verde protein (GFP) con 27/474 nm e 525/45 nm per l'eccitazione e di emissione, rispettivamente. Utilizzare un obiettivo 10x (apertura numerica ≥0.3) all'immagine le amebe. Nota: La calceina-AM nell'agar causerà morente amebe a fluorescenza nel canale di fluorescenza verde. Amebe sane altrimenti non sono fluorescenti.</li>
	<li>Regolare i tempi di acquisizione per il contrasto di fase, canali GFP per limitare la fototossicità e ottimizzare la gamma dinamica delle intensità immagine. Se necessario, sostituire il contrasto differenziale di interferenza (DIC) di fase. Nota: Utilizzare se possibile le esposizioni di 100-200 ms per contrasto di fase e la fluorescenza di GFP. Mantenere le impostazioni di esposizione e strumento invariate durante tutto l'intero esperimento. Questo è fondamentale per il calcolo dell'indice di uccisione di host.</li>
	<li>Acquisizione di immagini per almeno 100 cellule ameba al fine di ottenere buone statistiche per il calcolo dell'host indice di uccisione.</li>
</ol>7. analisi dell'immagine e Host uccisione indice
<ol><li>Effettuare l'analisi di immagine usando ImageJ.</li>
	<li>Aprire il file di immagine del contrasto di fase in ImageJ cliccando sul File | Aperto e selezionando l'immagine. Regolare la soglia cliccando su immagine | Analisi | Soglia. Regolare la soglia superiore e inferiore per selezionare solo il picco di intensità (Figura 3A).</li>
	<li>Convertire l'immagine in binario cliccando processo | Binario | Fare binario. Riempire i fori selezionando processo | Binario | Riempire i fori. Nota: Utilizzando l'immagine in Figura 1 come origine, punti 7.1-7.2 produrrà un'immagine in cui le amebe e batteri collegata alla superficie appaiono come regioni scure (Figura 3B).</li>
	<li>Assicurati che le caselle di zona e valore grigio medio sono selezionate nel Analyze | Impostare misure. Misurare le dimensioni approssimative delle amebe selezionando lo strumento ovale sulla barra degli strumenti principale. Fare clic su analisi | Misura e prendere nota della zona di amebe rappresentative.</li>
	<li>Creare maschere per le amebe cliccando Analyze | Analizzare le particelle. Nella casella dimensione, entrare nell'area che includono le amebe ma escludere i batteri. Selezionare maschere nella barra dei menu a discesa per l' opzione Visualizza. Accertarsi che sia selezionata la casella Aggiungi al Manager .</li>
	<li>Fare clic su OK e un'immagine che mostra solo le amebe e un Manager di ROI apparirà la finestra di dialogo (Figura 3C).</li>
	<li>Aprire l'immagine di fluorescenza usando File | Aperto e selezionando il file appropriato. Selezionare tutte le regioni nel ROI Manager tenendo premuto il tasto MAIUSC e cliccando su ogni regione nell'elenco (Figura 3D).</li>
	<li>Fare clic sul pulsante misura il ROI Manager. Verrà aperta una finestra di risultati visualizzazione del valore di intensità media di ogni ameba.</li>
	<li>Copiare i valori di fluorescenza per ogni ameba in un programma di foglio di calcolo e calcolare l'host uccidendo Indice considerando la media di tutti i valori di fluorescenza.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo veloce e quantitativo per analizzare la virulenza di p. aeruginosa. Questo protocollo può essere testato con altri batteri. Tuttavia, è importante tenere a mente che il mezzo di crescita dovrebbe essere compatibile con le condizioni di crescita di ameba. In particolare, abbiamo ottimizzato il protocollo usando PS:DB come mezzo di crescita batterica. Se vengono utilizzati altri supporti, può essere necessario eseguire un controllo di sola media di crescita in cui non sono p...

Infezione batterica è una delle principali cause di mortalità in umani e animali1,2. La capacità di misurare la virulenza dei batteri in culture o biofilm è importante nelle impostazioni di ricerca e assistenza sanitaria. Qui, descriviamo un metodo versatile, veloce e relativamente semplice per quantificare la virulenza batterica. L'organismo eucariote Dictyostelium discoideum (ameba) viene utilizzato come organismo modello ospite. D. discoideum è stato utilizzato come un host di identificare i fattori di virulenza di Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 e altri batteri6,7 ,8 ed è suscettibile in gran parte gli stessi fattori di virulenza che uccidono le cellule di mammiferi tra cui tipo III secrezione9,10. Le analisi precedenti di virulenza usando d. discoideum hanno coinvolto l'esposizione prolungata dei batteri con d. discoideum cellule nel corso di ore3,4,5. Il protocollo, qui, presenta un metodo rapido per determinare virulenza utilizzando questa ameba. Questo protocollo (Figura 1) descrive come: (1) crescere le amebe axenically (in assenza di batteri), (2) crescere batteri per il dosaggio, (3) preparare i batteri e cellule dell'ospite per la microscopia, (4) eseguire epifluorescenza e (5) analizzare l'ameba fluorescenza.
Amebe sono inizialmente striate fuori dalle scorte congelate e cresciute su un prato di Escherichia coli (Escherichia coli), dove le amebe producono spore. Queste spore sono raccolte e inoculate in un terreno arricchito per la crescita axenica. Le amebe sono mantenute attraverso axenica crescita in condizioni di sostanza-ricco finché non sono pronti per essere mescolato con i batteri per la valutazione della virulenza batterica. La sopravvivenza o la morte delle amebe è quantificata misurando la fluorescenza della calceina-acetossimetil (calceina-AM), che è spaccati dalle esterasi intracellulari e, quindi, attivato per fluorescenza11,12. Amebe Live presentano poca o nessuna fluorescenza considerando che ha sottolineato e le cellule morte reagiscono intensamente. Questo risultato è dovuto un piccolo o nessun incorporazione di calceina-AM nel sane amebe e incorporazione e scissione del substrato in amebe stressato13. Questo comportamento è in particolare distinto dalla fluorescenza di calceina-AM in cellule di mammifero11,14,15,16.
Batteri che saranno valutati per la virulenza sono coltivati separatamente. Qui, descriviamo come misurare la virulenza dell'agente patogeno opportunista p. aeruginosa e come quantificare la virulenza di planctonico (nuoto) e collegata alla superficie sotto-popolazioni di dettaglio. Questo protocollo può essere adattato per testare la virulenza di altri batteri. Nella sezione risultati rappresentante, indichiamo che la virulenza è attivato in cellule collegata alla superficie ed è basso in cellule planctoniche, che è stato segnalato precedentemente13. Virulenza-attivato collegata alla superficie p. aeruginosa uccide amebe mentre non virulento cellule planctoniche sono consumate da amebe. Se la virulenza dei batteri planctonici è esclusivamente essere dosata, i batteri possono essere coltivati in provette di coltura ordinaria anziché utilizzare capsule di Petri, come descritto nel protocollo.
La crescita di amebe e p. aeruginosa culture deve essere coordinata, tali che p. aeruginosa culture raggiungono la fase di crescita previsto mentre le amebe crescono allo stato stazionario in condizioni di ricco di sostanze nutritive. Questa condizione richiede in genere culture amebe da diluire con almeno 1 giorno prima di quando sono mescolati con i batteri. Amebe e batteri sono immobilizzati utilizzando pastiglie agar, sono co-incubati per 1 h e imaging utilizzando una risoluzione bassa (10 X, apertura numerica 0.3) proteina fluorescenza oggettiva, verde (GFP) filtri e una termocamera. Analisi possono essere eseguite utilizzando software liberamente disponibile di ImageJ o software di analisi di immagine personalizzato. La nostra analisi è stata effettuata usando il nostro software scritto utilizzando un pacchetto di analisi scientifica13. Il software dovrebbe creare una maschera utilizzando l'immagine di contrasto di fase ed estrarre valori di fluorescenza dalle aree mascherate nell'immagine di fluorescenza. Valori di fluorescenza sono media almeno 100 cellule, con conseguente un indice di uccisione di host numerici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:716px;" width="715">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Reagents</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:108px;">BD Difco</td>
			<td style="width:91px;">214010</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">15240062</td>
			<td style="width:297px;">Aliquot &#60; 1 mL and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">C34852</td>
			<td style="width:297px;">Calcein Acetoxymethyl (AM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">C1016</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:91px;">D16500</td>
			<td style="width:297px;">Dextrose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">D5879</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Folic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">F8758</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:108px;">BD Difco</td>
			<td style="width:91px;">244620</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">M8266</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:108px;">Oxoid</td>
			<td style="width:91px;">LP0021</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Special peptone</td>
			<td style="width:108px;">Oxoid</td>
			<td style="width:91px;">LP0072</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Potassium hyroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:91px;">P250</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">P0662</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:91px;">S373</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Vitamin B12</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">V2876</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Strains</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:220px;">Dictyostelium discoideum</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">Strain AX318</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:220px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">Strain B/r17</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:220px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">PA14</td>
			<td style="width:297px;">PA14 strain19</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Pseudomonas aeruginosa &#916;lasR</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">AFS20.1</td>
			<td style="width:297px;">PA14-derived strain20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Supplies</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">0.22 &#181;m filter&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:91px;">SCGPT01RE</td>
			<td style="width:297px;">For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:220px;">Conical tube, 15 mL</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">352097</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:108px;">Pyrex</td>
			<td style="width:91px;">13951L</td>
			<td style="width:297px;">250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Petri dish, 6 cm diameter</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">351007</td>
			<td style="width:297px;">60 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:220px;">Petri dish, 10 cm diameter</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">FB0875712</td>
			<td style="width:297px;">100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:220px;">Plastic containers with lid</td>
			<td style="width:108px;">Ziploc</td>
			<td style="width:91px;">2.57E+09</td>
			<td style="width:297px;">Square 3-cup containers</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:220px;">Glass plates</td>
			<td style="width:108px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:91px;">1653308</td>
			<td style="width:297px;">For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:220px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">23-400-102&#160;</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Eclipse Ti-E microscope&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Nikon</td>
			<td style="width:91px;">MEA53100</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">10X Plan Fluor Ph1 objective&#160; 0.3 NA</td>
			<td style="width:108px;">Nikon</td>
			<td style="width:91px;">MRH20101</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Fluorescence excitation source</td>
			<td style="width:108px;">Lumencor</td>
			<td style="width:91px;">Sola light engine</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:220px;">Fluorescence filter set</td>
			<td style="width:108px;">Semrock</td>
			<td style="width:91px;">LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Orca Flash 4.0 V2 Camera</td>
			<td style="width:108px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:91px;">77054098</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ImageJ</td>
			<td style="width:108px;">NIH</td>
			<td style="width:91px;">v. 1.49</td>
			<td style="width:297px;">Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">MATLAB</td>
			<td style="width:108px;">Mathworks</td>
			<td style="width:91px;">R2013</td>
			<td style="width:297px;">Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Orbital shaker incubator</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:91px;">89032-092</td>
			<td style="width:297px;">For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Platform shaker</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">13-687-700</td>
			<td style="width:297px;">For growth of amoebae at 22 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:108px;">Biochrom</td>
			<td style="width:91px;">Ultrospec 10</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Undercounter refrigerated incubator</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">97990E</td>
			<td style="width:297px;">For growth of amoebae at 22 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Isotemp waterbath&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">15-462-21Q</td>
			<td style="width:297px;">For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

Saggi di virulenza batterica tradizionale coinvolgono l'esposizione prolungata dei batteri nel corso di diverse ore per le celle. Durante questo periodo, i batteri possono subire cambiamenti nella fisiologia a causa dell'esposizione all'ambiente di crescita di host e la presenza di cellule dell'ospite. Abbiamo sviluppato un test per misurare rapidamente lo stato di virulenza dei batteri che riducono al minimo l'entità a cui i batteri crescono in presenza di cellule dell'ospite. Batteri e amebe sono mescolate insieme e immobilizzate su un unico piano di formazione immagine usando un tampone di agar. La procedura utilizza l'imaging di fluorescenza di cella singola con calceina-acetossimetil estere (calceina-AM) come indicatore di salute della cellula ospite. La fluorescenza delle cellule dell'ospite viene analizzata dopo 1 h di esposizione delle cellule dell'ospite ai batteri utilizzando epifluorescenza. Software di analisi di immagine viene utilizzato per calcolare un indice di abbattimento di host. Questo metodo è stato utilizzato per misurare la virulenza all'interno planctonici e collegata alla superficie Pseudomonas aeruginosa sottopopolazioni durante la fase iniziale di formazione del biofilm e può essere adattato ad altri batteri e altre fasi di crescita di biofilm. Questo protocollo fornisce un metodo rapido e robusto di virulenza di misura ed evita molte delle complessità associati alla crescita e la manutenzione di linee cellulari di mammifero. Fenotipi di virulenza qui misurati utilizzando le amebe sono stati convalidati anche utilizzando i macrofagi del topo. In particolare, questa analisi è stata usata per stabilire tale virulenza sopraregola collegamento di superficie in p. aeruginosa.

Siamo cresciuti selvaggio-tipo p. aeruginosa ceppo PA1419 o un Δieri ceppo20 allo stesso sfondo PA14 in capsule di 6 Petri cm di diametro e analizzato la virulenza delle cellule planctoniche e collegata alla superficie. Culture sono stati inoculati da single-colonie nel PS:DB culture, cresciute durante la notte in provette di coltura in un rullo di tamburo a 37 ° C alla saturazione, diluito 1: 100 in PS:DB, coltivate per ...

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A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba

Qui, presentiamo un protocollo per misurare la virulenza dei batteri planctonici o collegata alla superficie mediante d. discoideum (ameba) come un ospite. Virulenza viene misurato su un periodo di 1 h e host uccidendo è quantificata mediante analisi di immagine e microscopia di fluorescenza. Dimostriamo questo protocollo utilizzando il batterio p. aeruginosa.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

a-rapid-image-based-bacterial-virulence-assay-using-amoeba

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K Views.  University of California. Qui, presentiamo un protocollo per misurare la virulenza dei batteri planctonici o collegata alla superficie mediante d. discoideum (ameba) come un ospite. Virulenza viene misurato su un periodo di 1 h e host uccidendo è quantificata mediante analisi di immagine e microscopia di fluorescenza. Dimostriamo questo protocollo utilizzando il batterio p. aeruginosa.

Video: A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for sample pretreatment. The method was first described by Fenn and colleagues1 and has been applied to the detection of illicit drugs2 and explosives3-4, the characterization of skin volatiles5, and the analysis of breath6-7.
SESI ionization occurs by proton transfer reactions between the electrospray solution and the volatile analyte, and is therefore suitable for the analysis of hetero-organic molecules, just as in traditional electrospray ionization (ESI). However, unlike standard ESI, the proton transfer process of SESI occurs in the vapor phase rather than in solution (Fig. 1), and therefore SESI is best suited for detecting organic volatiles and aerosols.
We are expanding the use of SESI-MS to the detection of bacterial volatiles as a method for bacterial identification and characterization8. We have demonstrated that SESI-MS volatile fingerprinting, combined with a statistical analysis method, can be used to differentiate bacterial genera, species, and mixed cultures in a variety of growth media.8 Here we provide the steps for obtaining bacterial volatile fingerprints using SESI-MS, including the instrumental parameters that should be optimized to ensure robust bacterial identification and characterization.

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) enables the detection of volatile organic compounds (VOCs) without the need for any sample pretreatment. This protocol provides instructions for the rapid (within minutes) characterization of bacterial VOCs using SESI-MS.

Volatili che caratterizzano batterica secondaria utilizzando Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Ricerca

Bioingegneria

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Rapida e basso costo Prototipazione di dispositivi medici che usano 3D Stampo Stampato per stampaggio ad iniezione Liquid

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis of the intrinsic photothermal response of hemoglobin molecules, the sensor enables high-sensitivity, chemical-free measurement of [Hb]. [Hb] detection capability with a limit of 0.12 g/dl over the range of 0.35 - 17.9 g/dl has been demonstrated previously. The method can be readily implemented using inexpensive consumer electronic devices such as a laser pointer and a webcam. The use of a micro-capillary tube as a blood container also enables the hemoglobin assay with a nanoliter-scale blood volume and a low operating cost. Here, detailed instructions for the PT-AS optical setup and signal processing procedures are presented. Experimental protocols and representative results for blood samples in anemic conditions ([Hb] = 5.3, 7.5, and 9.9 g/dl) are also provided, and the measurements are compared with those from a hematology analyzer. Its simplicity in implementation and operation should enable its wide adoption in clinical laboratories and resource-limited settings.

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Una rapida e chimico-libera emoglobina Assay con Photothermal angolare Light Scattering

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest regarding the use of bioinspired nanoscale hydroxyapatite (nHA). However, biological apatite is known to be calcium-deficient and carbonate-substituted with a nanoscale platelet-like morphology. Bioinspired nHA has the potential to stimulate optimal bone tissue regeneration due to its similarity to bone and tooth enamel mineral. Many of the methods currently used to fabricate nHA both in the laboratory and commercially, involve lengthy processes and complex equipment. Therefore, the aim of this study was to develop a rapid and reliable method to prepare high quality bioinspired nHA. The rapid mixing method developed was based upon an acid-base reaction involving calcium hydroxide and phosphoric acid. Briefly, a phosphoric acid solution was poured into a calcium hydroxide solution followed by stirring, washing and drying stages. Part of the batch was sintered at 1,000 &#176;C for 2 h in order to investigate the products&#39; high temperature stability. X-ray diffraction analysis showed the successful formation of HA, which showed thermal decomposition to &#946;-tricalcium phosphate after high temperature processing, which is typical for calcium-deficient HA. Fourier transform infrared spectroscopy showed the presence of carbonate groups in the precipitated product. The nHA particles had a low aspect ratio with approximate dimensions of 50 x 30 nm, close to the dimensions of biological apatite. The material was also calcium deficient with a Ca:P molar ratio of 1.63, which like biological apatite is lower than the stoichiometric HA ratio of 1.67. This new method is therefore a reliable and far more convenient process for the manufacture of bioinspired nHA, overcoming the need for lengthy titrations and complex equipment. The resulting bioinspired HA product is suitable for use in a wide variety of medical and consumer health applications.

This paper describes a novel method for the rapid manufacture of high quality bioinspired nanoscale hydroxyapatite. This biomaterial is of great significance in the manufacture of a wide range of innovative medical devices for clinical applications in orthopedics, craniofacial surgery and dentistry.

Rapid Mix Preparazione di bioispirati Nanoscale idrossiapatite per applicazioni biomediche

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identificazione ad alto contenuto di velocità effettiva della resistenza a Pseudomonas syringae pv. Pomodoro nel pomodoro utilizzando Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell cultures. Microcarrier culture technology has become one of the main techniques in cytological research and is commonly used in the field of large-scale cell expansion. Microcarriers have also been shown to play an increasingly important role in in vitro tissue engineering construction and clinical drug screening. Current methods for preparing microcarriers include microfluidic chips and inkjet printing, which often rely on complex flow channel design, an incompatible two-phase interface, and a fixed nozzle shape. These methods face the challenges of complex nozzle processing, inconvenient nozzle changes, and excessive extrusion forces when applied to multiple bioink. In this study, a 3D printing technique, called alternating viscous-inertial force jetting, was applied to enable the construction of hydrogel microcarriers with a diameter of 100-300 &#181;m. Cells were subsequently seeded on microcarriers to form tissue engineering modules. Compared to existing methods, this method offers a free nozzle tip diameter, flexible nozzle switching, free control of printing parameters, and mild printing conditions for a wide range of bioactive materials.

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Presented here is a mild 3D printing technique driven by alternating viscous-inertial forces to enable the construction of hydrogel microcarriers. Homemade nozzles offer flexibility, allowing easy replacement for different materials and diameters. Cell binding microcarriers with a diameter of 50-500 &#181;m can be obtained and collected for further culturing.

Stampa 3D di microcarrier idrogel in vitro mediante getto alternato di forza viscosa-inerziale

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...