KP und AS schrieb und das Manuskript überarbeitet. KP durchgeführt die Experimente und die Analyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Career Transition Award (K22AI112816), as unterstützt.

Alle experimentelle Verfahren erfolgten an der University of California, Irvine.
1. Puffer und Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie Lysogeny Brühe (LB) in einer 1 L Glasflasche durch Zugabe von LB-Miller-Mischung 25 g in 1 L bidestilliertem Wasser (DdH2O vor). Fügen Sie für Petrischalen eine zusätzliche 20 g Agar. Autoklav zu sterilisieren. Gießen Sie 25 mL des flüssigen Agar Medium in 10 cm-Durchmesser-Petrischalen und bei Zimmertemperatur erstarren lassen. Speichern von flüssigen Medien bei Raumtemperatur und Agarplatten bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Glukose Hefe Pepton (Gips) Platten in eine 1 L-Glas-Flasche durch das Mischen von 1 g D-Glucose, 2 g Pepton, 0,25 g Hefe-Extrakt, 4,2 g KH2PO4, 5,1 g Na2HPO47 H2O und 25 g Agar in 1 L DdH2 O. Autoklav zu sterilisieren. Gießen Sie 25 mL des geschmolzenen Nährbodens in 10 cm-Durchmesser-Petrischalen und bei Zimmertemperatur erstarren lassen. Shop bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Pepton S (PS) Medium in eine 1 L-Glas-Flasche durch das Mischen von 10 g Pepton, 7 g Hefe-Extrakt, 15 g D-Glucose, 0,12 g Na2HPO47 H2O, 1,4 g KH2PO4, 40 µg Vitamin B12 , und 80 µg Folsäure in 800 mL DdH2O. kalibrieren eine elektronischen pH-Meter pH 4 und pH 7 Standards verwenden, wenn der pH-Meter nicht innerhalb eines Tages verwendet worden ist.<ol>
<li>Messen Sie den pH-Wert des Mediums PS mit dem pH-Meter. Fügen Sie entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 zur Einstellung des pH-Wertes auf 6,5. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O. Filter sterilisieren mit 0,22 µm Vakuumfilter und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Gehen Sie vorsichtig mit den pH-Wert Anpassungen durch das Tragen von Schutzausrüstung einschließlich Schutzkleidung, Handschuhe, Augenschutz und stellen Sie Schutz zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 x Entwicklung Puffer Prime vorzubereiten (DB ") Puffer in einer 1 L Glasflasche durch Zugabe von 3,4 g KH2PO4, 13,4 g Na2HPO4 7 H2O und DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 800 mL. Kalibrieren einer elektronischen pH-Meter pH 4 und pH 7 Standards verwenden, wenn der pH-Meter nicht innerhalb eines Tages verwendet worden ist.<ol>
<li>Messen Sie den pH-Wert des Puffers mit dem elektronischen pH-Meter. Passen Sie den pH-Wert 6,5 indem sanft entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 nach Bedarf an. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O und durch Autoklavieren zu sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern. Hinweis: Gehen Sie vorsichtig mit den pH-Wert Anpassungen durch das Tragen von Schutzausrüstung einschließlich Schutzkleidung, Handschuhe, Augenschutz und stellen Sie Schutz zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 x Entwicklung Puffer (DB) zu machen, durch Mischen 100 mL 10 x DB "Puffer mit 1 mL sterilisiert 2 M MgCl2und 1 mL 1 M CaCl2sterilisiert. Die letzte Lautstärke zu 1 L in einer 1 L Glasflasche mit einem Autoklaven sterilisiert DdH2O. Store bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie PS:DB Medium in einer 1 L Glasflasche durch Mischen 100 mL sterilisiert PS Medium, 100 mL sterilisiert 10 x DB "Puffer und sterilisierte DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 1 L. Ergänzung mit 1 mL sterilisiert 2 M MgCl2 und 1 mL sterilisiert 1 M CaCl 2. Store bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Calcein-AM Lager Lösung durch Zugabe von 50 µL von DMSO auf 50 µg von Calcein-AM in der vom Hersteller gelieferten Kunststoffbehälter. Shop bei-20 ° C.</li>
</ol>(2) Wachstum und Erhaltung der Amöben
<ol><li>Wachsen Sie E. Coli -Stamm B/r17 als Nahrungsquelle für die Amöben in der ersten Wachstumsphase. Streak E. Coli B/r aus einem gefrorenen bestand bei-80 ° C auf eine LB-Agar-Platte gespeichert und Inkubation bei 37 ° C über Nacht um einzelne Kolonien zu erhalten.</li>
	<li>Eine einzige Kolonie von E. Coli B/r in 2 mL LB-Medium zu impfen und über Nacht in einer Bandage oder einem Shaker bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Bringen Sie die Übernachtung E. Coli Kultur auf die Raumtemperatur. Mit einem Holzstab, impfen Sie Amöben aus einem gefrorenen bestand in 750 µL der Übernacht-Kultur bei-80 ° C gehalten. Hinweis: Verwendung D. Discoideum Stamm AX3, axenic Wachstum18dar. Dieser Schritt erfordert keine axenic Wachstum, aber nachfolgende Schritte habe seine Verpflichtung.</li>
	<li>Fügen Sie sofort 700 µL der Amöben -E. Coli -Mischung auf einen Teller Glukose Hefe Pepton (Gips). Verbreitung der Kultur gleichmäßig auf der Oberfläche der Platte durch Kippen es hin und her und Seite-an-Seite nach Bedarf. Vermeiden Sie die Verwendung von einem Spreader.</li>
	<li>Platzieren Sie die GYP-Platte mit Agar nach oben in eine Box, die hohen Luftfeuchtigkeit führt. Verwenden Sie zwei Einweg-Kunststoff-Behälter (183 x 183 cm x 91 cm) oben auf einander gestapelt. Füllen Sie den unteren Behälter mit ca. 25 mL Wasser und stellen Sie den oberen Behälter mit mehreren 0,5 cm Durchmesser Löcher gebohrt, durch den Boden des Behälters, um Feuchtigkeit aus dem Wasserreservoir in den oberen Behälter verschieben kann.</li>
	<li>4-5 Tage bis Amöbe Sporen beobachtet sind nahe der Oberfläche der Platte (Abbildung 2) wächst inkubieren Sie die GYP Platte und Box bei 22 ° C. Verwenden Sie einen gekühlten Inkubator, um Platten anstatt Inkubation bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Nachdem Sporen gewachsen sind, bleiben sie auf Platten für mehrere Wochen lebensfähig, wenn bei 4 ° c gelagert Speichern Sie die Platten mit Agar Seite nach oben. Nach 3-4 Tagen Inkubation können Zonen Clearing innerhalb des bakteriellen Rasens beobachtet werden, die zeigen des Beginn der Amöbe Sporenbildung.<ol>
<li>Beobachten Sie kleine Amöben Sporen über die Plattenoberfläche nach 4-5 Tagen Inkubationszeit (Abbildung 2). Hinweis: Wachsen Sie nicht die Amöben für länger als eine Woche, da die Qualität der Sporen nach Ablaufen dieser Frist abnimmt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie Amöben Sporen vorzubereiten für das axenic Wachstum der Amöben durch eine sterile 1 mL PIPETTENSPITZE parallel zur Oberfläche der Platte zu fegen. Sporen aus der Hälfte einer 10 cm Petrischale zu sammeln. Hinweis: Berühren Sie die Spitze an die Oberfläche der Agar-Platte wie diese Bewegung große Zahlen von E. Colisammeln wird.</li>
	<li>Aufschwemmen der Amöben an der Spitze der Pipette durch Eintauchen der Spitze in 1 mL PS Medium und sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die beimpfte Mischung in einen 250-mL-Flasche mit 25 mL des Mediums PS ergänzt mit der Antibiotikum-antimykotische Lösung bei 0,25 X Konzentration. Hinweis: Bewahren Sie die Antibiotikum-antimykotische Lösung als 250 µL-Aliquots bei-20 ° C. Vermeiden Sie wiederholte Zyklen der Auftauen und Einfrieren dieser Lösung, da dadurch seine Wirksamkeit verringern kann.</li>
	<li>Amöben axenically bei 22 ° C in einem rotierenden Shaker bei 100 u/min zu wachsen. Für die Virulenz-Assay in Schritt 5 Zellen wachsen zu einer optischen Dichte, gemessen bei 600 nm (OD600) von 0,2 bis 0,5. Hinweis: Dieser Schritt erfordert ca. 3-4 Tage Wachstum ab dem Zeitpunkt der Impfung (Schritt 2.7). Wenn Zellen zu einer höheren Dichte gewachsen sind, verdünnen die Kultur zurück in PS Medium zu einem OD-600 von 0,05 oder niedriger und wachsen wieder zu einem OD-600 von 0,2 bis 0,5.</li>
</ol>(3) das Wachstum von p. aeruginosa
<ol><li>Wählen Sie eine einzelne Kolonie von p. Aeruginosa von eine LB-Platte, in ein 2 mL PS:DB Kultur zu impfen und wachsen über Nacht bei 37 ° C, Sättigung. Hinweis: Fügen Sie die Antibiotikum antimykotische Lösung nicht zu den PS:DB Medien.</li>
	<li>Verdünnen Sie Nacht Kultur 1: 100 oder 1:1,000 in eine 6 cm-Durchmesser Petrischale mit PS:DB. Wenn die Virulenz von planktonischen Zellen ausschließlich untersucht wird ist, wachsen Sie die Kulturen mit herkömmlichen Kultur Röhren statt. Schütteln Sie die Kultur auf ein Benchtop-Rotator bei 100 u/min bei 37 ° c eingestellt</li>
	<li>Ernte-Kulturen zu bestimmten Zeitpunkten auf Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Bereiten Sie bei 30 min bis 1 h vor der Beurteilung der Virulenz eine Agar-Pad, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Hinweis: Virulenz in p. Aeruginosa wird durch ca. 8 h des Wachstums auf Oberflächen induziert.</li>
	<li>Um die Oberfläche angebracht Zellen zu isolieren, entfernen Sie das flüssige Medium aus der Petrischale, waschen Sie sofort mit 1 mL der DB-Puffer, planktonischen Zellen zu entfernen und gehen Sie sofort zum Schritt 5.1. Achtung: Waschen Sie nicht länger als 30 s da dies durcheinanderbringen und Oberfläche angebracht Zellen zu lösen und die Virulenz Messung beeinträchtigen.</li>
	<li>Um planktonischen Zellen zu isolieren, übertragen Sie 10 µL der Kultur von der Petrischale auf einer sauberen Petrischale und gehen Sie sofort zu Schritt 5.1.</li>
</ol>(4) Mikroskopie - Vorbereitung der Agar-Pad
<ol><li>Bereiten Sie Agar Pads ca. 30 min bis 1 h bis Amöben mit p. Aeruginosamischbar sind.</li>
	<li>Mikrowelle 50 mL von 1 % (w/V) Agar in DB-Puffer in einem 250 mL-Kolben. Mix alle 20 s bis Klumpen von Agar verschwinden.</li>
	<li>Kühlen Sie die geschmolzene Agar indem man sie in vorgeheizten 55 ° C Wasserbad für 15 min.</li>
	<li>15 mL des geschmolzenen Nährbodens in einem konischen Rohr 15 µL der Stammlösung Calcein-AM hinzufügen. Mischen Sie durch sanft das Rohr 4 - 5 mal umdrehen und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren. Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Polypropylen 15 mL Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen dickes Glas-Container nicht, als dadurch der Agar, vorschnell zu festigen.</li>
	<li>Gießen Sie die flüssigen Agar Mischung auf einer 12 cm x 10 cm Glasplatte und erlauben Sie den Nährboden für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu festigen. Schneiden Sie indem du die Glasplatte über einem gedruckten Raster und schneiden entlang des Rasters ein Metall-Lineal mit erstarrtem Agar-Pad in kleinere Abschnitte von 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Halten Sie das Gel in einer feuchten Box hydratisiert, bis es betriebsbereit ist.</li>
</ol>(5) Mikroskopie - Vorbereitung der Bakterien-Amöbe Probe für die Bildgebung
<ol><li>Um die Virulenz der Oberfläche befestigt Bakterienzellen assay, fügen Sie 10 µL der Amöbe Zellen aus Schritt 2.10 Oberfläche befestigt Bakterien aus Schritt 3.4 hinzu. Hinweis: Diese Schritt beschreibt das Mischen von Amöben mit Bakterien.</li>
	<li>Um die Virulenz von planktonischen Zellen assay, mischen Sie 10 µL der Amöbe Zellen aus Schritt 2.10 mit 10 µL der planktonischen Bakterien aus Schritt 3.5. Hinweis: Waschen Sie die axenically gewachsen Amöbe Zellen (bei einer OD600 von 0,2 bis 0,5) vor dem Mischen mit den Bakterien nicht. Kein Wachstum von E. Coli wird in die Amöbe Kultur durch den Einsatz von Antibiotika-antimykotische Lösung beobachtet werden.</li>
	<li>Legen Sie sofort das 1,5 x 1,5 cm Calcein-AM Agar Pad ab Schritt 4.5 auf die Bakterien-Amöben-Mischung auf der Petrischale Oberfläche. Hinweis: Legen Sie das Agar-Pad auf der Mischung mit einer schnellen reibungslosen Bewegung. Senken Sie das Pad langsam auf die Mischung nicht, da diese Bewegung dazu neigt, Zellen in Richtung der Peripherie und Weg von der Unterseite des Pads schieben. Diese Schritt wird sichergestellt, dass Bakterien und Amöben gleichmäßig sind gemischt, immobilisiert und, dass beide Arten Zelle sind auf der gleichen Ebene beschränkt.</li>
	<li>Sanft pipettieren Sie alle verbleibenden Flüssigkeit umgibt das Agar-Pad, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lassen Sie die Petrischale für 20 min bei Raumtemperatur trocknen.</li>
	<li>Mit der Petrischale mit einem Deckel decken Sie ab und inkubieren Sie die immobilisierten Amöben-Bakterien-Mischung bei Raumtemperatur für eine zusätzliche 40 min. gehen Sie zu Schritt 6.1. Hinweis: Es ist wichtig, alle Proben für die gleiche Menge an Zeit, wenn der Hintergrund Fluoreszenz erhöht im Laufe der Zeit zu inkubieren. Es empfiehlt sich eine Inkubationszeit von 1 h. Inkubationen länger als 1 h sind weniger reproduzierbar wie Amöben Zellen zu platzen beginnen können.</li>
</ol>(6) Mikroskopie - Bilderfassung
<ol><li>Bild Amöben mit einem Fluoreszenzmikroskop Hellfeld und grün Fluoreszenzbilder erwerben. Verwenden Sie für grüne Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz Protein (GFP) Filter mit 474/27 nm und 525/45 nm für Anregung und Emission, beziehungsweise. Verwenden Sie ein 10 X (≥0.3 numerische Apertur) Ziel der Amöben Image. Hinweis: Die Calcein-AM im Agar bewirkt sterbende Amöben, Fluoreszenz in den grünen Fluoreszenz-Kanal. Gesunde Amöben sind sonst nicht fluoreszierend.</li>
	<li>Einstellen Sie Erfassungszeiten für Phasenkontrast, GFP-Kanäle zu begrenzen Phototoxizität und optimiert den Dynamikumfang des Bildes Intensitäten. Das differential Interferenz Kontrast (DIC) Phasenkontrast zu ersetzen, wenn nötig. Hinweis: Verwenden Sie wenn möglich 100-200 ms Belichtungen für Phasenkontrast und GFP Fluoreszenz. Halten Sie die Einstellungen für Belichtung und Instrument unverändert während des gesamten Experiments. Dies ist entscheidend für die Berechnung des Host-Tötung-Indexes.</li>
	<li>Bilder für mindestens 100 Amöbe Zellen zu erwerben, um gute Statistiken zur Berechnung des Hosts Tötung Index zu erhalten.</li>
</ol>7. Bild-Analyse und Host-Tötung-Index
<ol><li>Durchführen Sie Bildanalyse mit ImageJ.</li>
	<li>Die Phase Kontrast-Image-Datei in ImageJ durch Anklicken Datei öffnen | Offene und das Bild auswählen. Passen Sie den Schwellenwert durch Bild anklicken | Analyse | Schwelle. Passen Sie den unteren und oberen Schwellenwert wählen Sie nur die Intensität Peak(Abbildung 3).</li>
	<li>Konvertieren Sie das Bild in Binary, indem Sie auf Prozess | Binäre | Stellen binäre. Löcher füllen, indem Sie Prozess auswählen | Binäre | Löcher füllen. Hinweis: Mit dem Bild in Abbildung 1 als Quelle, werden Schritte 7.1-7.2 ein Bild erzeugen, in denen die Amöben und Bakterien Oberfläche angebracht als dunkle Bereiche (Abbildung 3B) vorkommen.</li>
	<li>Sicherzustellen, dass die Felder Bereich und bedeutet Grauwert in Analyze geprüft werden | Legen Sie Messungen. Messen Sie die ungefähre Größe der Amöben durch Auswahl des ovalen Tools auf der Hauptsymbolleiste. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme und beachten Sie den Bereich der repräsentativen Amöben.</li>
	<li>Erstellen von Masken für die Amöben durch Klicken auf analysieren | Analysieren Sie Partikel. Geben Sie im Größenfeld des Bereichs, der wird die Amöben unter anderem die Bakterien ausschließen. Wählen Sie Masken im Dropdown-Menü die Option "anzeigen". Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Manager hinzufügen aktiviert ist.</li>
	<li>Klicken Sie auf "OK" und ein Bild zeigt nur die Amöben und ein ROI-Manager Dialogfeld wird angezeigt (Abbildung 3C).</li>
	<li>Die fluoreszenzbild mit Datei öffnen | Offene und die entsprechende Datei auswählen. Wählen Sie alle Regionen im ROI Manager durch Gedrückthalten der Shift-Taste und einem Klick auf jede Region in der Liste (Abbildung 3D).</li>
	<li>Klicken Sie auf Messen , im ROI-Manager. Dadurch öffnet sich ein Ergebnisfenster zeigt den mittleren Intensitätswert jede Amöbe.</li>
	<li>Die Fluoreszenz-Werte für jede Amöbe in einem Tabellenkalkulations-Programm kopieren und die Host Index zu töten, indem man den Durchschnitt aller Fluoreszenz-Werte zu berechnen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine rasche und quantitative Methode zur Virulenz in p. Aeruginosaassay. Dieses Protokoll kann mit anderen Bakterien getestet werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Wachstumsmedium mit der Amöbe Wachstumsbedingungen kompatibel sein sollten. Insbesondere haben wir das Protokoll mit PS:DB als das Bakterienwachstum Medium optimiert. Wenn andere Medien verwendet werden, ist es möglicherweise erforderlich, Wachstumskontrolle Medien nur durchzuführen, bei denen gibt es keine bakterielle Zellen anwesend, um sicherzustellen, dass das Medium mit der Amöben kompatibel ist.
Diese Methode kann erweitert werden, um die Wachstums-Phase-Abhängigkeit der Virulenz assay. Insbesondere können Bakterienkulturen für ein breites Spektrum von Zeiten statt einen festen Zeitpunkt angebaut werden. Nach unserer Erfahrung ist es wichtig, Bakterienkulturen zu bestimmten Zeitpunkten zu ernten, wie Virulenz in p. Aeruginosa zu abhängig von der Wachstumsphase zu sein scheint. Wir beobachteten, dass Virulenz in p. Aeruginosa zwischen 6-8 h des Wachstums in Petrischalen induziert wurde.
Viele Variablen im Zusammenhang mit dem Wachstum Umfeld beeinflussen Host Gesundheit und bakteriellen Virulenz. Daher ist es wichtig, die richtige positive und negative Kontrollen für jedes Experiment zu verwenden. Wir haben als eine positive Kontrolle und ΔLasR als Negativkontrolle Wildtyp Oberfläche angebracht p. Aeruginosa verwendet. Wir empfehlen die Durchführung dieser Kontrollen jedes Mal, wenn der Virulenz-Test durchgeführt wird. Diese Kontrollen sind wichtig für die Überprüfung, dass Host Zelle Tod nicht durch externe Faktoren wie das Alter der Amöben, Schwankungen der Temperatur usw. alle experimentieren in biologischen Wiederholung zu schaffen darüber hinaus empfehlen wir die Reproduzierbarkeit der Virulenz Phänotypen.
Wir haben unsere Experimente mit Amöben bei einer optischen Dichte von 0,2 bis 0,5 nach einer Verwässerung des am wenigsten 01:10 durchgeführt und haben reguliert die Temperatur der Amöben Kultur genau auf 22 ° C. Außerhalb dieser Wachstumsbedingungen haben wir festgestellt, dass die Anfälligkeit der Amöben zu virulenten Bakterien und die Reproduzierbarkeit der Virulenz Assay verändert. Amöbe Zellen pellet relativ schnell. Stellen Sie sicher, dass Kulturen Nukleinsäuretablette sind, von oben und unten pipettieren, unmittelbar vor der Messung der optischen Dichte erfolgt. Wachsen Sie die Amöbe Kulturen höher als eine OD600 Dichte von 1 nicht, wie Wachstum, hohe dichten die Reproduzierbarkeit des Experiments beeinflusst. Axenic Kulturen nicht länger als 1 Woche zu propagieren. Darüber hinaus ist es wichtig sicherzustellen, dass die Amöben axenically angebaut werden (ab Schritt 2.7) durch 20 X oder hoher Vergrößerung Mikroskopieren so, dass andere Mikroben sind nicht in der Kultur. Wenn Kulturen nach 2 Tagen des Wachstums nach der ersten Impfung im Schritt 2.10 trübe sind, würde dies wahrscheinlich die Anwesenheit von mikrobiellen Verunreinigung hinweisen. Bei auf bakterielle Kontamination Verdacht empfiehlt es sich, immer 1 mL der Amöben-Kultur bei 37 ° C für 4-8 h. Die Beobachtung einer trüben Kultur unter diesen Bedingungen würde vorschlagen, dass bakterielle Kontamination. Wenn wiederholte bakterielle Kontamination beobachtet wird, sollte die Antibiotikum antimykotische Lösung ersetzt werden.
Der Host-Tötung-Index ist ein zuverlässiger Indikator für eine Bakterienpopulation virulent oder avirulent sei. Dieser Test ist nicht für Vergleiche zwischen verschiedenen Zwischenstufen der Virulenz (d.h. geringer Virulenz verglichen mit geringer bis mittlerer Virulenz) optimiert und Überinterpretation der Ergebnisse sollte vermieden werden. Mögliche Methoden zur Behebung dieses Problems sind die Wiederholung des Virulenz Tests über mehrere Tage mit verschiedenen Chargen von Wirtszellen herzustellen das Vertrauen in die Ergebnisse, weitere wiederholte Experimente durchführen und Durchführung geeigneter statistische Analysen.
Die Multiplizität der Infektion (MOI) von planktonischen Zellen kann durch die Normalisierung der optischen Dichte der Bakterienkultur gesteuert werden. Dieser Assay steuert jedoch nicht die MOI Oberfläche befestigt Bakterienzellen. Wir haben beobachtet, dass bakterielle Oberflächendichte mit der Zeit zunimmt. So kann Anpassung Wachstumszeit in der Petrischale in eine entsprechende Änderung Oberflächendichte führen. Darüber hinaus hängt die Oberflächendichte vom Material der Oberfläche. P. Aeruginosa Zellen legen auf Polystyrol Oberflächen in der hier beschriebenen Test. Jedoch möglicherweise andere Oberflächen wie Glas, Agar und Polyacrylamid auch vermutlich13. Die Flächendichte einschichtig Bakterienpopulationen kann mit 100 X Vergrößerung Phase Mikroskopie gemessen werden. Wenn Oberfläche dichten vielschichtig sind, möglicherweise konfokalen Mikroskopie geeignet.
Hier haben wir eine schnelle und robuste Methode zur Messung der bakteriellen Virulenz beschrieben. Durch Änderung einzelner Parameter wie Inkubationszeiten, fluoreszierender Farbstoff, der Bakterienstamm, der Host Zelltyp oder Wachstumsmedien, kann diese Methode zur Quantifizierung der Virulenz in einer Vielzahl von Organismen und Wachstumsbedingungen verlängert werden.

Bakterielle Infektion gehört zu den führenden Todesursachen in Mensch und Tier1,2. Die Fähigkeit, Virulenz der Bakterien in Kulturen oder Biofilme zu messen ist wichtig in Medizin und Forschung Einstellungen. Hier beschreiben wir eine vielseitige, schnelle und relativ einfache Methode, um bakterielle Virulenz zu quantifizieren. Die Eukaryotische Organismus Dictyostelium Discoideum (Amöben) dient als Modell Wirtsorganismus. D. Discoideum wurde als Host verwendet, um Virulenzfaktoren in Pseudomonas Aeruginosa (p. Aeruginosa)3,4,5 und andere Bakterien6,7 identifizieren ,8 und ist anfällig für weitgehend die gleichen Virulenzfaktoren, die Säugerzellen einschließlich Typ III-Sekretion9,10zu töten. Vorherigen Virulenz-Assays mit D. Discoideum haben im Laufe der Stunden3,4,5über längere Zeit von Bakterien mit D. Discoideum Zellen beteiligt. Hier das Protokoll stellt eine schnelle Methode zur Bestimmung der Virulenz verwenden diese Amöbe. Dieses Protokoll (Abbildung 1) beschreibt wie man: (1) wachsen die Amöben axenically (in Abwesenheit von Bakterien), (2) wachsen Bakterien für den Assay, (3) bereiten Bakterien und Wirtszellen für Mikroskopie, (4) Epifluoreszenz mikroskopie durchzuführen, und (5) analysieren Sie Amöbe Fluoreszenz.
Amöben sind zunächst gestreift von gefrorenen Vorräte und auf eine Rasenfläche von Escherichia coli (E. Coli), angebaut, wo die Amöben Sporen produzieren. Diese Sporen sind abgeholt und in eine angereicherte Medium für axenic Wachstum geimpft. Die Amöben sind durch axenic Wachstum in nährstoffreichen Bedingungen beibehalten, bis sie bereit sind, mit Bakterien für die Beurteilung der bakteriellen Virulenz gemischt werden. Das Überleben oder den Tod der Amöben wird durch die Messung der Fluoreszenz von Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM), die durch intrazelluläre Esterasen abgespalten und, dadurch aktiviert für Fluoreszenz11,12quantifiziert. Live Amöben zeigen wenig oder gar keine Fluoreszenz betont, und sterbende Zellen intensiv fluoreszieren. Dieses Ergebnis ist durch eine kleine oder gar keine Einarbeitung von Calcein-AM gesunden Amöben und Einbeziehung und Spaltung des Substrats im gestressten Amöben13. Dieses Verhalten unterscheidet sich vor allem von Calcein-AM Fluoreszenz in Säugerzellen11,14,15,16.
Bakterien, die für die Virulenz beurteilt werden separat angebaut. Hier beschreiben wir wie Sie messen die Virulenz von opportunistischen Erreger p. Aeruginosa und ausführlich, wie man die Virulenz von planktonischen (Schwimmen) und Oberfläche befestigt Sub-Populationen zu quantifizieren. Dieses Protokoll möglicherweise angepasst, die Virulenz von anderen Bakterien zu testen. Im Abschnitt Vertreter Ergebnisse wir zeigen, dass die Virulenz in Oberfläche angebracht Zellen aktiviert und ist niedrig im planktonischen Zellen, die hieß zuvor13. Virulenz-aktivierte Oberfläche angebracht p. Aeruginosa tötet Amöben, während nicht virulente planktonischen Zellen von den Amöben konsumiert werden. Wenn die Virulenz von planktonischen Bakterien ausschließlich untersucht wird ist, können Bakterien in gewöhnlichen Kultur Röhren anstatt Petrischalen zu verwenden, wie im Protokoll beschrieben kultiviert werden.
Das Wachstum der Amöben und p. Aeruginosa Kulturen muss koordiniert werden, so dass p. Aeruginosa Kulturen die beabsichtigten Wachstumsphase erreichen, während die Amöben im Steady-State in nährstoffreichen Bedingungen wachsen. Dieser Zustand erfordert in der Regel Amöben Kulturen mindestens 1 Tag vor dem verdünnt werden, wenn sie mit Bakterien vermischt werden. Amöben und Bakterien sind immobilisiert mit Agar-Pads sind für 1 h Co inkubierten und abgebildet, mit einer niedrigen Auflösung (10 X, numerische Apertur 0,3) Objektive, grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) filtert und eine Wärmebildkamera. Analyse mit frei verfügbare ImageJ-Software ausgeführt werden kann oder Bildanalyse-Software angepasst. Unsere Analyse erfolgte mittels eigener Software mit einer wissenschaftlichen Analyse Paket13geschrieben. Die Software sollte erstellen Sie eine Maske mit dem Phase Kontrast Bild und die maskierten Bereiche in der fluoreszenzbild Fluoreszenz Werte extrahieren. Fluoreszenz-Werte sind über mindestens 100 Zellen, was zu einer numerischen Host Tötung Index gemittelt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:716px;" width="715">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Reagents</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:108px;">BD Difco</td>
			<td style="width:91px;">214010</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">15240062</td>
			<td style="width:297px;">Aliquot &#60; 1 mL and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">C34852</td>
			<td style="width:297px;">Calcein Acetoxymethyl (AM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">C1016</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:91px;">D16500</td>
			<td style="width:297px;">Dextrose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">D5879</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Folic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">F8758</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:108px;">BD Difco</td>
			<td style="width:91px;">244620</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">M8266</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:108px;">Oxoid</td>
			<td style="width:91px;">LP0021</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Special peptone</td>
			<td style="width:108px;">Oxoid</td>
			<td style="width:91px;">LP0072</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Potassium hyroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:91px;">P250</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">P0662</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:91px;">S373</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Vitamin B12</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">V2876</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Strains</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:220px;">Dictyostelium discoideum</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">Strain AX318</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:220px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">Strain B/r17</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:220px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">PA14</td>
			<td style="width:297px;">PA14 strain19</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Pseudomonas aeruginosa &#916;lasR</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">AFS20.1</td>
			<td style="width:297px;">PA14-derived strain20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Supplies</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">0.22 &#181;m filter&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:91px;">SCGPT01RE</td>
			<td style="width:297px;">For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:220px;">Conical tube, 15 mL</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">352097</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:108px;">Pyrex</td>
			<td style="width:91px;">13951L</td>
			<td style="width:297px;">250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Petri dish, 6 cm diameter</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">351007</td>
			<td style="width:297px;">60 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:220px;">Petri dish, 10 cm diameter</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">FB0875712</td>
			<td style="width:297px;">100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:220px;">Plastic containers with lid</td>
			<td style="width:108px;">Ziploc</td>
			<td style="width:91px;">2.57E+09</td>
			<td style="width:297px;">Square 3-cup containers</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:220px;">Glass plates</td>
			<td style="width:108px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:91px;">1653308</td>
			<td style="width:297px;">For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:220px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">23-400-102&#160;</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Eclipse Ti-E microscope&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Nikon</td>
			<td style="width:91px;">MEA53100</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">10X Plan Fluor Ph1 objective&#160; 0.3 NA</td>
			<td style="width:108px;">Nikon</td>
			<td style="width:91px;">MRH20101</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Fluorescence excitation source</td>
			<td style="width:108px;">Lumencor</td>
			<td style="width:91px;">Sola light engine</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:220px;">Fluorescence filter set</td>
			<td style="width:108px;">Semrock</td>
			<td style="width:91px;">LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Orca Flash 4.0 V2 Camera</td>
			<td style="width:108px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:91px;">77054098</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ImageJ</td>
			<td style="width:108px;">NIH</td>
			<td style="width:91px;">v. 1.49</td>
			<td style="width:297px;">Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">MATLAB</td>
			<td style="width:108px;">Mathworks</td>
			<td style="width:91px;">R2013</td>
			<td style="width:297px;">Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Orbital shaker incubator</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:91px;">89032-092</td>
			<td style="width:297px;">For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Platform shaker</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">13-687-700</td>
			<td style="width:297px;">For growth of amoebae at 22 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:108px;">Biochrom</td>
			<td style="width:91px;">Ultrospec 10</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Undercounter refrigerated incubator</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">97990E</td>
			<td style="width:297px;">For growth of amoebae at 22 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Isotemp waterbath&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">15-462-21Q</td>
			<td style="width:297px;">For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

Traditionelle bakteriellen Virulenz Tests beinhalten über längere Zeit Bakterien im Laufe von mehreren Stunden auf Wirtszellen. Während dieser Zeit können Bakterien in der Physiologie aufgrund der Exposition gegenüber Hostumgebung Wachstum und das Vorhandensein von Wirtszellen verändern. Wir entwickelten einen Test um den Zustand der Virulenz der Bakterien schnell zu messen, die das Ausmaß zu minimieren, um das Bakterien in Gegenwart von Wirtszellen wachsen. Bakterien und Amöben sind miteinander vermischt und auf einen einzigen Abbildungsebene mit einer Agar-Pad immobilisiert. Das Verfahren nutzt einzellige Fluoreszenz-Bildgebung mit Calcein-Acetoxymethyl Ester (Calcein-AM) als Indikator für Host Zellgesundheit. Die Fluoreszenz von Wirtszellen ist nach 1 h von Wirtszellen Bakterien ausgesetzt zu sein mit Epifluoreszenz mikroskopie analysiert. Bildanalyse-Software wird verwendet, um einen Host-Tötung-Index zu berechnen. Diese Methode wurde verwendet, um die Virulenz innerhalb von planktonischen und Oberfläche befestigt Pseudomonas Aeruginosa Messen Sub-Populationen in der Anfangsphase der Biofilmbildung und andere Bakterien und andere Wachstumsstadien Biofilm angepasst werden kann. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und robuste Methode zur Messung der Virulenz und vermeidet viele der komplexen Zusammenhang mit Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien. Virulenz Phänotypen mit Amöben hier gemessen wurden auch mit Maus Makrophagen validiert. Insbesondere wurde dieser Assay verwendet, um die Oberfläche Anlage reguliert Virulenz in p. Aeruginosazu etablieren.

Wir wuchsen Wild-Art p. Aeruginosa Belastung PA1419 oder eine ΔLasR 20 im gleichen PA14 Hintergrund in 6 cm Durchmesser-Petrischalen belasten und die Virulenz von planktonischen und Oberfläche angebracht Zellen untersucht. Kulturen wurden aus einzelnen Kolonien in PS:DB Kulturen, gewachsen über Nacht in Kultur Röhren in eine Bandage bei 37 ° C, Sättigung geimpft, verdünnt 1: 100 in PS:DB, für 8 h in 6 cm Durchmesser Petrischalen schütteln bei 100 u/min, angebaut und planktischen und Oberfläche angebracht P. Aeruginosa Sub-Populationen wurden isoliert, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
Oberfläche-attached Wildtyp p. Aeruginosa getötet Amöben, gekennzeichnet durch eine Runde Amöbe Zellform und die Beobachtung von Calcein Fluoreszenz (Abbildung 4A, oben links). Dies führte zu einer hohen Host Tötung Index (Abbildung 4B). Planktonischen Zellen verbraucht wurden, von den Amöben, die durch amorphe Amöbe Zelle Formen und die Beobachtung von wenig oder gar keine Calcein Fluoreszenz über Hintergrund (Abbildung 4A, oben rechts Panel) angegeben wurde. Dies führte zu einer relativ geringen Host Tötung Index (Abbildung 4B). Sowohl Oberfläche befestigt und planktischen Zellen der ΔLasR Belastung durch Amöben, gekennzeichnet durch niedrige Host töten Indizes (Abbildung 4B, Bodenplatte) verbraucht wurden. Die Ergebnisse damit zeigen, dass Virulenz hochreguliert in Populationen Oberfläche befestigt und die LasR erforderlich für die Virulenz Oberfläche aktiviert ist, die zuvor beschriebenen13. Diese Experimente etablieren so robuste positive und negative Kontrollen für zukünftige Experimente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig1.jpg"> Abbildung 1 : Schaltplan beschreibt einen Überblick über die Virulenz Assay. (1) Amöbe Wirtszellen sind gewachsen, (2) bakterielle Kulturen angebaut werden, und (3) planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterienzellen sind gemischt mit Amöben und unbeweglich auf dem gleichen Abbildungsebene mit einer Agar-Pad. Wirtszellen sind für die Gesundheit, die Verwendung von Calcein-AM, Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse quantifiziert. Maßstabsleisten repräsentieren 50 µm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57844/57844fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig2.jpg"> Abbildung 2 : Amoeba Sporen auf einem GYP 10 cm-Durchmesser Petrischale Platte nach 5 Tagen des Wachstums. Sporen-Form über die Petrischale Oberfläche. Der Inset zeigt eine vergrößerte Ansicht eines einzelnen Abschnitts der Schüssel Oberfläche. Die Oberfläche kann Bakterien enthalten, die bei dieser Auflösung erkannt werden können. Maßstabsbalken in Haupt- und Nebenkarten Bilder repräsentieren 1 cm und 2 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57844/57844fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig3.jpg"> Abbildung 3 : Bildanalyse Mikroskopie-Daten mithilfe von ImageJ. (A) Auswahl an der Peak-Intensität mit dem Schwellenwert-Tool. (B) resultierende Bild nach der Phase Kontrast Quellbild aus Abbildung 1 in ein binäres Bild umgewandelt wird. (C) resultierende Bild, nachdem das Bild anschließend in eine Maske umgewandelt wird. (D) -Screenshots von der Auswahl der Regionen von Interesse, die mit dem ROI-Manager. Maßstabsleisten repräsentieren 50 µm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57844/57844fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57844/57844fig4.jpg"> Abbildung 4 : Repräsentative Ergebnisse der Amöbe durch p. Aeruginosa Zellen zu töten. (A) Calcein-AM-Fluoreszenz-Mikroskopie Phasenbilder und (B) Host töten Indizes der Oberfläche befestigt oder planktonischen Wildtyp oder ΔLasR p. Aeruginosaüberlagert. Wildtyp Oberfläche angebracht p. Aeruginosa tötet Amöben, die erhebliche Calcein Fluoreszenz aufweisen und somit ein erheblicher Host töten Index. Planktonischen Zellen sind durch Amöben, verbraucht, was wenig Calcein Fluoreszenz ausstellen und produzieren einen niedrigen Host Tötung Index. Sowohl Oberfläche befestigt und planktonischen ΔLasR durch Amöben und führen zu einer niedrigen Host Tötung Index verbraucht werden. Skala Bars stellen 50 µm. Balken zeigen den Durchschnitt der drei unabhängigen Experimenten und Fehler Balken zeigen die Standardabweichung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57844/57844fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Virulenz von planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterien mit D. Discoideum (Amöben) als Host zu messen. Virulenz wird gemessen über einen Zeitraum von 1 h und Host töten wird quantifiziert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse. Wir zeigen dieses Protokoll mit dem Bakterium p. Aeruginosa.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K Aufrufe.  University of California. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Virulenz von planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterien mit D. Discoideum (Amöben) als Host zu messen. Virulenz wird gemessen über einen Zeitraum von 1 h und Host töten wird quantifiziert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse. Wir zeigen dieses Protokoll mit dem Bakterium p. Aeruginosa.

Serie: A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for sample pretreatment. The method was first described by Fenn and colleagues1 and has been applied to the detection of illicit drugs2 and explosives3-4, the characterization of skin volatiles5, and the analysis of breath6-7.
SESI ionization occurs by proton transfer reactions between the electrospray solution and the volatile analyte, and is therefore suitable for the analysis of hetero-organic molecules, just as in traditional electrospray ionization (ESI). However, unlike standard ESI, the proton transfer process of SESI occurs in the vapor phase rather than in solution (Fig. 1), and therefore SESI is best suited for detecting organic volatiles and aerosols.
We are expanding the use of SESI-MS to the detection of bacterial volatiles as a method for bacterial identification and characterization8. We have demonstrated that SESI-MS volatile fingerprinting, combined with a statistical analysis method, can be used to differentiate bacterial genera, species, and mixed cultures in a variety of growth media.8 Here we provide the steps for obtaining bacterial volatile fingerprints using SESI-MS, including the instrumental parameters that should be optimized to ensure robust bacterial identification and characterization.

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) enables the detection of volatile organic compounds (VOCs) without the need for any sample pretreatment. This protocol provides instructions for the rapid (within minutes) characterization of bacterial VOCs using SESI-MS.

Charakterisierung Bakterielle Flüchtige mit Secondary Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Forschung

Biotechnik

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Schnelle und Low-Cost-Prototyping für Medizinische Geräte mit 3D Printed Formen für Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis of the intrinsic photothermal response of hemoglobin molecules, the sensor enables high-sensitivity, chemical-free measurement of [Hb]. [Hb] detection capability with a limit of 0.12 g/dl over the range of 0.35 - 17.9 g/dl has been demonstrated previously. The method can be readily implemented using inexpensive consumer electronic devices such as a laser pointer and a webcam. The use of a micro-capillary tube as a blood container also enables the hemoglobin assay with a nanoliter-scale blood volume and a low operating cost. Here, detailed instructions for the PT-AS optical setup and signal processing procedures are presented. Experimental protocols and representative results for blood samples in anemic conditions ([Hb] = 5.3, 7.5, and 9.9 g/dl) are also provided, and the measurements are compared with those from a hematology analyzer. Its simplicity in implementation and operation should enable its wide adoption in clinical laboratories and resource-limited settings.

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Eine schnelle und Chemiefreie Hämoglobin-Assay mit Photothermische Winkellichtstreuung

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest regarding the use of bioinspired nanoscale hydroxyapatite (nHA). However, biological apatite is known to be calcium-deficient and carbonate-substituted with a nanoscale platelet-like morphology. Bioinspired nHA has the potential to stimulate optimal bone tissue regeneration due to its similarity to bone and tooth enamel mineral. Many of the methods currently used to fabricate nHA both in the laboratory and commercially, involve lengthy processes and complex equipment. Therefore, the aim of this study was to develop a rapid and reliable method to prepare high quality bioinspired nHA. The rapid mixing method developed was based upon an acid-base reaction involving calcium hydroxide and phosphoric acid. Briefly, a phosphoric acid solution was poured into a calcium hydroxide solution followed by stirring, washing and drying stages. Part of the batch was sintered at 1,000 &#176;C for 2 h in order to investigate the products&#39; high temperature stability. X-ray diffraction analysis showed the successful formation of HA, which showed thermal decomposition to &#946;-tricalcium phosphate after high temperature processing, which is typical for calcium-deficient HA. Fourier transform infrared spectroscopy showed the presence of carbonate groups in the precipitated product. The nHA particles had a low aspect ratio with approximate dimensions of 50 x 30 nm, close to the dimensions of biological apatite. The material was also calcium deficient with a Ca:P molar ratio of 1.63, which like biological apatite is lower than the stoichiometric HA ratio of 1.67. This new method is therefore a reliable and far more convenient process for the manufacture of bioinspired nHA, overcoming the need for lengthy titrations and complex equipment. The resulting bioinspired HA product is suitable for use in a wide variety of medical and consumer health applications.

This paper describes a novel method for the rapid manufacture of high quality bioinspired nanoscale hydroxyapatite. This biomaterial is of great significance in the manufacture of a wide range of innovative medical devices for clinical applications in orthopedics, craniofacial surgery and dentistry.

Rapid-Mix Herstellung von Bioinspirierte Nanoskalige Hydroxyapatit für biomedizinische Anwendungen

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Schnelle Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit modularem Golden Gate Klonen

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell cultures. Microcarrier culture technology has become one of the main techniques in cytological research and is commonly used in the field of large-scale cell expansion. Microcarriers have also been shown to play an increasingly important role in in vitro tissue engineering construction and clinical drug screening. Current methods for preparing microcarriers include microfluidic chips and inkjet printing, which often rely on complex flow channel design, an incompatible two-phase interface, and a fixed nozzle shape. These methods face the challenges of complex nozzle processing, inconvenient nozzle changes, and excessive extrusion forces when applied to multiple bioink. In this study, a 3D printing technique, called alternating viscous-inertial force jetting, was applied to enable the construction of hydrogel microcarriers with a diameter of 100-300 &#181;m. Cells were subsequently seeded on microcarriers to form tissue engineering modules. Compared to existing methods, this method offers a free nozzle tip diameter, flexible nozzle switching, free control of printing parameters, and mild printing conditions for a wide range of bioactive materials.

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Presented here is a mild 3D printing technique driven by alternating viscous-inertial forces to enable the construction of hydrogel microcarriers. Homemade nozzles offer flexibility, allowing easy replacement for different materials and diameters. Cell binding microcarriers with a diameter of 50-500 &#181;m can be obtained and collected for further culturing.

3D-Druck von In-vitro-Hydrogel-Mikroträgern durch abwechselnd viskos-inertiales Kraft-Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...