La Novo Nordisk Fondazione Centro per la ricerca di base metabolica è un centro indipendente di ricerca presso l'Università di Copenaghen, parzialmente finanziato da una donazione senza restrizione della Fondazione di Novo Nordisk.

1. trattamento degli enzimi di limitazione
<ol><li>Linearizzare mtDNA trattando totale DNA umano con l'enzima di restrizione BamHI, che taglia in posizione 14258 nel DNA mitocondriale umano. Nota: Per mouse DNA, utilizzare l'enzima di restrizione BglII in condizioni identiche come di seguito.</li>
	<li>Per ogni campione dove la metilazione del DNA mitocondriale è di essere valutati, preparare una provetta di reazione di 0,2 mL e aggiungere il seguente miscela: 3 μg DNA genomico (quantificato dalla fluorometria), 15 µ l tampone 3, 3 μL BamHI e acqua fino a di 150 μL</li>
	<li>Inserire le provette in un termociclatore per 4 h a 37 ° C.</li>
</ol>2. bisolfito conversione
<ol><li>Convertire DNA BamHI-trattato con bisolfito di sodio come descritto altrove29.</li>
	<li>Utilizzare 200-500 ng DNA BamHI-trattato per ogni reazione di conversione a un volume totale di 20 μL. Il recupero di DNA è 50-70%.</li>
	<li>Eluire il DNA bisolfuro-convertito in tampone di eluizione 10 μL.</li>
	<li>Quantificare il DNA single-stranded dalla fluorometria.</li>
	<li>Optional: Memorizzare bisolfito-convertito DNA a-20 ° C prima di procedere il restante del protocollo. Per l'archiviazione a lungo termine, archiviare DNA bisolfuro-convertito a-80 ° C</li>
</ol>3. design di bisolfito primer di sequenziamento
<ol><li>Disegnare primers per bisolfuro utilizzando gli strumenti online Methprimer30 e BiSearch31,32. Nota: Methprimer e BiSearch consentono di cercare sequenze dell'associazione iniettore su sequenze genomiche dove cytosines vengono convertiti in thymines, similmente al post-bisolfito di trattamento.</li>
	<li>Per l'amplificazione ottima e imparziale, evitare i dinucleotidi CpG in primers e progettare la dimensione amplicone tra 100-300 bp.</li>
	<li>Garantire che gli iniettori progettati sono specifici per il DNA mitocondriale utilizzando la funzione di BiSearch Ricerca di Primer. Inserire i primers già progettato bisolfito convertito, barrare la casella di bisolfito e includono un genoma di riferimento e parametri PCR. Nota: Verrà visualizzato un elenco di possibili prodotti di PCR.</li>
	<li>Copiare la parte superiore 1-5 sequenze dell'iniettore e incollarli in un modulo d'ordine per la sintesi del oligonucleotide. Nota: Un elenco di umani e sequenze dell'iniettore del mtDNA del mouse che è stato convalidato in laboratorio viene visualizzata nella tabella 1.</li>
	<li>Primer di test utilizzando bisolfito convertito PCR dopo l'elettroforesi del gel dell'agarosi, come descritto nel passaggio 4. Testare e ottimizzare tutte le coppie di primer separatamente e garantire che la dimensione corretta amplicone appare sul gel dell'agarosi. Nota: Se gli iniettori multiplexing sono necessari, aggiungere primer multiple ad una singola reazione di PCR e visualizzare i prodotti di PCR su elettroforesi del gel dell'agarosi o, un metodo più risolutivo come elettroforesi del gel di poliacrilammide, per distinguere i prodotti di simile dimensione.</li>
</ol>4. bisolfito convertito PCR ed estrazione del Gel
<ol><li>Per amplificare le regioni di interesse, eseguire PCR utilizzando un'avvio a caldo Taq polimerasi. Brevemente, mix 100 ng convertito DNA, 500 µ m di primer senso e antisenso, 1 µ l dei dNTP mix (10 µ m di ciascun dNTP) e della polimerasi a 7,5 U/reazione in un volume totale di 50 µ l. PCR eseguita con le seguenti condizioni: 5 min a 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 cicli; 10 min 72 ° C. Uso il primer o separatamente o multiplex.</li>
	<li>Opzionale: Quando multiplazione primer, convertito uso 200 ng DNA e le seguenti condizioni in bicicletta: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 cicli; 10 min 72 ° C. Nota: La temperatura può variare a seconda della temperatura di fusione degli iniettori.</li>
	<li>Prodotti di PCR soggetti al gel elettroforesi su agarosio al 2% a 100 volt.</li>
	<li>Dolce luce UV, estrarre i prodotti PCR con un bisturi e aggiungere microprovette. Non esporre i prodotti di PCR a luce UV eccessiva per evitare danni al DNA. Evitare il tempo di esposizione più di 30 s.</li>
	<li>Purificare i prodotti PCR con purificazione del gel come descritto in precedenza3.</li>
	<li>Quantificare il DNA purificato dal passaggio 4.5 utilizzando fluorometria. Procedere al passaggio 5 o archivio campioni a-20 ° C.</li>
</ol>5. bisolfito di sequenziamento libreria preparazione
<ol><li>Eseguire la libreria preparazione dei prodotti PCR del bisolfuro-convertito. Optional: multisala prodotti di PCR in questa fase.</li>
	<li>Eseguire fine-riparazione utilizzando fino a 100 ng di prodotto di PCR. Aggiungere 3 µ l fine preparazione enzima e tampone di reazione (10x) di 6,5 µ l fine riparazione al prodotto di PCR 55,5 µ l in un tubo di 0,2 mL. Posizionare e incubare la provetta in un termociclatore per 30 min a 20 ° C, seguita da 30 min a 65 ° C.</li>
	<li>Legare gli adattatori sequenziamento mescolando il DNA fine-riparato con 15 µ l Blunt/TA ligasi, 2,5 µ l adattatore e 1 µ l legatura enhancer. Se si utilizza < 100 prodotto di PCR di ng come input, diluire adattatore 10 volte.</li>
	<li>Mettere il mix (punto 5.3) in un termociclatore e incubare per 15 min a 20 ° C. Mettere in pausa il termociclatore e aggiungere 3 µ l utente enzima al tubo. Mescolare e collocare la provetta nel termociclatore e incubare per 15 minuti a 37 ° C.</li>
	<li>Dimensioni selezionare il DNA adattatore-legati utilizzando perline solido fase reversibile immobilizzazione (SPRI) con diversi rapporti di perline al DNA a seconda delle dimensioni del prodotto PCR.</li>
	<li>Aggiungere 13,5 µ l H2O al DNA adattatore-legati da passo 5.4 e 55 µ l risospese SPRI perline. Incubare a temperatura ambiente per tubo 5 min e posto su un supporto magnetico. Quando la soluzione è limpida, trasferire il surnatante in una provetta nuova e gettare il tubo contenente le perle. Nota: Il surnatante contiene il DNA adattatore-legati e grandi frammenti indesiderati sono vincolati ai talloni scartati.</li>
	<li>Aggiungere 25 µ l risospese SPRI perline al supernatante dal punto 5.6, miscelare e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e scartare il surnatante quando la soluzione è limpida. Nota: Il supernatante scartato contiene DNA indesiderato, mentre il DNA adattatore-legati è associato a perline.</li>
	<li>Mentre il tubo è su supporto magnetico, aggiungere 200 µ l 80% etanolo (preparata) per lavare le perle. Incubare 30 s e rimuovere e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio per un totale di 2 lavaggi.</li>
	<li>Branelli dell'aria secche per 5 min mentre il tubo è su supporto magnetico con un coperchio aperto.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal magnete, eluire il DNA in 23 µ l di tampone di eluizione e mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 2 min.</li>
	<li>Mettete il tubo su un supporto magnetico e quando la soluzione è limpida, trasferire 2 µ l in una piastra a 96 pozzetti PCR per l'amplificazione di pre-PCR (passo 5.14).</li>
	<li>Trasferire il resto circa 21 µ l ad un nuovo tubo di 0,2 mL per l'amplificazione di PCR (passo 5,17). Nota: Assicurarsi di non trasferire tutti i branelli come perle in grado di inibire le reazioni enzimatiche di passaggi successivi.</li>
	<li>Procedere al passo 5.14 o archivio campioni a-20 ° C.</li>
	<li>Eseguire l'amplificazione di pre-PCR di RT-qPCR per stimare il numero di cicli necessari per amplificare il DNA adattatore-legati. Per reazione, aggiungere quanto segue nella PCR 96 pozzetti piastra contenente 2 µ l DNA (passo 5.11): 0,4 µ l indice primer, primer PCR universale di 0,4 µ l, 7,2 µ l H2O, mix master RT-qPCR di 10 µ l.</li>
	<li>Posizionare la piastra in una macchina PCR in tempo reale e la piastra di soggetto alle seguenti condizioni: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 cicli; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Stimare il numero di cicli di amplificazione necessari per ciascun campione sottraendo un Ct-valore per il valore Ct della pre-amplificazione RT-qPCR corrispondente alla fine della fase lineare della reazione PCR.</li>
	<li>Amplificare il DNA adattatore-legati dal passaggio 5.12 mescolando: 21 µ l DNA, 25 mix master di µ l PCR, primer di indice 1 µ l, primer di PCR universale 1 µ l e 2 µ l H2O. In un termociclatore, soggetto ogni campione alle seguenti condizioni: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [Ct calcolato dal passaggio 5.16] cicli; 5 min 65 ° C. Nota: Ricordarsi di utilizzare solo un iniettore di indice per campione per consentire per multiplexing. L'indice viene inserito durante la PCR.</li>
	<li>Purificare le perline SPRI DNA amplificate ed eluire in 22 µ l di tampone di eluizione.</li>
	<li>Controllo di qualità di biblioteca di metodo gel elettroforesi o alternativa. Guardare per le dimensioni di picco libreria corretta (dimensione del prodotto PCR più adattatore).</li>
	<li>Stimare le dimensioni medie di base-accoppiamenti dei prodotti libreria di analisi di striscio: In avanzate impostazioni globali, fare doppio clic su "tabella" sotto analisi di striscio. Definire l'area da 100-1000 bp e fare clic su OK. Sotto Tabella Region, viene visualizzata l'area definita e libreria media dimensione (bp) è calcolata.</li>
	<li>Quantificare le librerie dalla fluorometria. Procedere al passaggio 6 o archivio librerie a-20 ° C.</li>
</ol>6. sequenziamento di nuova generazione
<ol><li>Calcolare la concentrazione di nM di librerie utilizzando la formula: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Diluire le librerie per la stessa concentrazione ad esempio 2 nanometro (Scegli 4 nM, 2 nM, 1 nM, o 0.5 nM a seconda delle concentrazioni di biblioteca). Piscina tutte le librerie per ottenere un pool di 2 librerie di nM.</li>
	<li>Denaturare e diluire le librerie seguendo la Guida di strumento di sequenziamento. In breve: denaturare la piscina nM 2 aggiungendo 0,2 N NaOH e incubare a temperatura ambiente per 5 min, diluire la piscina denaturata a una diluizione finale del 22. Denaturare e diluire una libreria di controlli disponibile in commercio a una diluizione finale di 12:05. Ad un nuovo tubo, mescolare la piscina di 22 con libreria di controllo di 20% 12:05. Nota: Conversione di bisolfito introduce complessità molto basso. Spike-in libreria di controllo 20% si tradurrà in una migliore qualità di sequenziamento.</li>
	<li>Eseguire una sequenza di accoppiato-fine bp 150 utilizzando uno strumento di sequenziamento profondo.</li>
</ol>7. calcolo analisi - i livelli di metilazione di stima
<ol><li>Generazione di file. fastq (qui chiamati sample1_R1.fastq.gz e sample1_R2.fastq.gz), un indice di bismark dell'intero genoma di interesse (qui in una cartella denominata bismarkIndex) e assicurarsi che la sequenza genomic di chrM è disponibile in fasta formato (qui in una cartella denominata chrM).</li>
	<li>Pre-elaborare letture per rimuovere schede e bias introdotto dai primer: utilizzare lo strumento Trim_galore33. Rimuovere due nucleotidi dall'estremità 5' di entrambe le letture avanti e indietro. trim_galore - clip_R1 2--clip_R2 2 -o. / --accoppiato di trim1..--sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Allineare le letture pre-elaborate per l'intero genoma utilizzando Bismark34 Bismark - a coda di rondine - bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz Nota: Se viene utilizzato un altro assetto, assicurarsi che le letture che non possono essere allineate in modo univoco vengono scartate.</li>
	<li>Estratto di legge mappatura sul cromosoma M, qui usando Samtools35 samtools ordinare -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM samtools Indice sample1_sorted.bam Mostra samtools -u sample1_sorted.bam chrM | samtools ordinare - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Estrarre le informazioni di metilazione bismark_methylation_extractor -p - CX - cytosine_report..--completa..--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>Utilizzare il .bedGraph, il COV o i file di CX_report.txt per un'ulteriore analisi. Utilizzare il file di sample1_chrM.CX_report.txt per la visualizzazione e il test.</li>
	<li>Eseguire ulteriori ritaglio nella fase pre-elaborazione, se più aree vengono interrogati e una polarizzazione di primer può essere visibile nelle trame M-bias generate durante il mapping. Fare riferimento alla documentazione di Bismark per ulteriori informazioni.</li>
</ol>8. computational Analysis - Test delle differenze
<ol><li>Assicurarsi che il file CX_report.txt contiene 7 colonne, cromosoma (qui chrM), posizione, strand, numero di letture metilate, numero di letture non metilate, contesto C e sequenza circostante, per ogni C sul cromosoma M.</li>
	<li>Come il CX_report copre chrM nella sua interezza, controllare il sottoinsieme per le regioni che viene amplificate.</li>
	<li>Utilizzare test non parametrici per le differenze tra i campioni, come il test esatto di un pescatori per singoli di C o un segno-test per un'intera regione. Nota: Quantificazione sarà spesso vicino metilazione 0%, che è il motivo per cui assumendo normalità non è appropriato.</li>
	<li>Allo stesso modo, per la visualizzazione, o visualizzare quantili o calcolare intervalli di confidenza della proporzione binomiale.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari di dichiarare.

Qui, forniamo un protocollo del bisolfuro che è specificamente progettato per interrogare la metilazione del DNA mitocondriale. Le differenze con del bisolfuro protocolli utilizzati per DNA genomico si trova nell'utilizzazione di una fase di digestione degli enzimi di limitazione preventiva e un'analisi bioinformatica sentenza fuori falsi positivi derivanti da sequenze di NUMT.
Forniamo un protocollo per evitare artefatti del bisolfuro durante l'analisi di metilazione del DNA mitocondriale. Manufatti di sequenziamento di bisolfito portando a falsi positivi erano precedentemente segnalati37. Rimozione insufficiente di proteine accessorie del DNA di proteinasi che k è stata descritta37. La denaturazione incompleta o parziale reannealing può portare a distese di conversione incompleta, possibilmente abbassando accesso di bisolfito a singolo filamento del DNA37. Il manufatto più tardi potrebbe essere in gioco nel mtDNA dove una struttura secondaria altererebbero accesso ai cytosines. Al meglio della nostra conoscenza, l'aggiunta di una fase di digestione degli enzimi di limitazione prima della conversione di bisolfito nel contesto di stimare la metilazione del DNA mitocondriale è stato segnalato in primo luogo nel 20163,28. Nelle nostre mani troppo, previa digestione con un enzima di restrizione di singolo-taglierina abbassato drammaticamente rilevamento di cytosines non convertito3,28.
Qui, forniamo una pipeline di bioinformatic analizzare i risultati del sequenziamento di bisolfito e per rilevare gli artefatti di sequenziamento di bisolfito nel contesto del bisolfuro di genoma intero mitocondriale. Questo metodo proviene dalla nostra osservazione che il mtDNA non-tasso di conversione è stato correlato inversamente con sequenziamento profondità3,28. Questa osservazione suggerisce che la struttura secondaria e terziaria anche di mtDNA altera la frammentazione del DNA mitocondriale a regioni specifiche durante la costruzione di librerie di sequenziamento e potrebbe anche compromettere l'accesso completo di bisolfito di sodio al mtDNA. Poiché la digestione con un enzima di uno-taglierina rilascia strutture secondarie e terziarie, i nostri risultati indicano che la struttura di mtDNA è una fonte di artefatto di bisolfito e convalidare i metodi descritti nel presente documento per la quantificazione della metilazione della citosina nel mtDNA.
L'inevitabile contaminazione del DNA nucleare in preparazione mitocondriale costituisce una sfida. Questo porta a contaminazione in sequenze NUMT in letture di sequenziamento, che può polarizzare stima di metilazione della citosina nel mtDNA, anche quando l'esecuzione di mirati e bisolfuro di genoma non complesso mitocondriale. Per evitare tale distorsione, il disegno di primer di sequenziamento di bisolfito unico permette di escludere la contaminazione con metilazione a NUMTs. NUMTs abbracciano determinate regioni dell'essere umano e il genoma mitocondriale del mouse con 100% di identità, e, di conseguenza, è Impossibile disegnare primers unico a determinate regioni di mtDNA. Durante l'esecuzione di bisolfuro di genoma intero mitocondriale, sequenziamento lungo letture possono facilitare la discriminazione tra mtDNA e NUMTs. Letture d'allineamento per l'intero genoma e utilizzare solo letture in modo univoco mappate il genoma mitocondriale possono ulteriormente garantiscono l'individuazione di metilazione del DNA mitocondriale.
Infine, questo protocollo può essere usato di là di genomi mitocondriali, ad esempio, in altre istanze di bisolfuro dove la struttura secondaria del DNA rappresenta una potenziale fonte di artefatto. L'associazione fra i livelli di metilazione e la profondità di sequenziamento possa essere studiato per valutare la necessità di una digestione con un enzima di restrizione prima del bisolfuro di complesse sequenze di DNA.

Il genoma mitocondriale è una struttura circolare, doppio filamento di circa 16,5 kg base (kb), che costituiscono un pesante e un filo di luce. Il genoma mitocondriale è presente in più copie all'interno di ogni cella, maternamente ereditata e codifica componenti essenziali della catena respiratoria complessi1. Simili ai genomi batterici e a differenza di genoma nucleare, il genoma mitocondriale è organizzato in numerose strutture secondarie e terziarie, come strutture a spirale e supercoiled2, che può rendere difficile l'accesso durante la sequenza esperimenti3.
Nel nucleo, metilazione del DNA è un contrassegno epigenetico estesamente studiato che svolge un ruolo in numerosi processi, in particolare nella regolazione dell'espressione genica. Nel genoma di mammiferi, metilazione del DNA avviene principalmente sulla posizione 5 dell'anello pirimidinico di deoxycytidines, per lo più su dinucleotidi CG (o CpG). Metilazione della citosina è trovata al 70% di tutti i CpG nel genoma di cellule somatiche e conti per ~ 1% del totaleche 4basi di DNA. Iperomocisteinemici del DNA è stata descritta anche in contesti non-CpG, come CpA, CpT e CpC ed esiste in varie quantità nel DNA nucleare, con valori fino al 25% di tutti i cytosines metilati in cellule staminali embrionali5,6,7.
Mentre la metilazione della citosina del genoma nucleare è ampiamente accettata, l'esistenza di metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale è ancora discutibile. Il primo studio investigativo del mtDNA metilazione è stata eseguita in cellule coltivate dove la metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata prontamente, anche se a livelli inferiori rispetto al nucleare DNA8. Nelle cellule umane e murine, metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata anche a livelli bassi (2-5%). Usando le analisi basandosi su 5 metilcitosina cattura quali immunoprecipitazione di DNA metilato (MeDIP) seguita da PCR quantitativa, metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata anche in vari mouse e umani e cellule linee9,10, 11,12. Usando gli anticorpi contro la 5-metilcitosina in un test ELISA o spettrometria di massa, notevoli livelli di metilazione del DNA sono stati rilevati dalle frazioni mitocondriali purificate13,14,15, 16. Tuttavia, la maggior parte dei saggi negli studi suddetti usato tecniche che non sono stati progettati per fornire una quantificazione assoluta di metilazione del DNA a singola base-risoluzione.
Analisi di metilazione del DNA quantitativa e risolutiva può avvenire mediante una tecnica denominata "bisolfito di sequenziamento", che si avvale della proprietà di bisolfito di sodio per convertire unmethylated citosina in uracile nel DNA single-stranded contesto17 . Utilizzo del bisolfuro, una costellazione di studi ha rilevato la presenza di metilazione della citosina a vari livelli. MtDNA di metilazione della regione D-loop, il 12S o della regione 16S è stato rilevato prontamente in umano18,19,20,21,22,mouse e23 24 tessuti e cellule, tuttavia, con una variabilità intrigante, 1-20% del totale cytosines attraverso gli studi.
In confronto a questi numerosi studi, solo pochi studi, tra cui dal nostro gruppo, hanno contestato la presenza del mtDNA metilazione3,25,26,27 o messo in discussione la rilevanza biologica di livelli molto bassi di mtDNA livelli (inferiore al 2%)28. Recentemente, abbiamo segnalato l'osservazione di un artefatto del bisolfuro potenziale nel complesso mitocondriale bisolfito sequenziamento3. Abbiamo fornito la prova che la struttura secondaria del DNA mitocondriale potrebbe portare a falsi positivi in bisolfuro, sopravvalutando quindi i livelli di metilazione. Qui forniamo un protocollo per prevenire un artefatto del bisolfito-conversione del mtDNA. Questo protocollo utilizza una semplice digestione enzimatica del DNA di distruggere strutture secondarie del mtDNA e consentire l'accesso completo al bisolfito seguendo un protocollo di sequenziamento di bisolfito. Inoltre, forniamo un'accompagnamento pipeline di bioinformatica per l'analisi di bisolfuro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BamHI</td>
			<td style="width:164px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:113px;"># R0136</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ DNA methylation-lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td># D5030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit ssDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 203603&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7370S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td># A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Sensitivity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit high sensitivity dsDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhiX control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td># 1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>#1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq instrument</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

Quantificazione di metilazione del DNA può essere ottenuto utilizzando del bisolfuro, che sfrutta la proprietà di bisolfito di sodio per convertire unmethylated citosina in uracile, in un contesto di DNA single-stranded. Del bisolfuro può essere mirato (mediante PCR) o eseguite sul genoma intero e fornisce quantificazione assoluta di metilazione della citosina alla singola base-risoluzione. Data la natura distinta del DNA nucleare e mitocondriale, in particolare nella struttura secondaria, adattamenti di metodi di sequenziamento di bisolfito per indagare la metilazione della citosina nel mtDNA dovrebbero essere fatto. Struttura secondaria e terziaria di mtDNA può effettivamente portare ad bisolfito sequenziamento artefatti che conduce a falsi positivi a causa di scarso accesso denaturazione incompleta di bisolfito a DNA single-stranded. Qui, descriviamo un protocollo con una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con pipeline di analisi bioinformatica per consentire la quantificazione accurata della citosina i livelli di metilazione nel mtDNA. Inoltre, forniamo le linee guida per la progettazione il primer di sequenziamento di bisolfito specifici di mtDNA, al fine di evitare indesiderabili segmenti nucleare mitocondriale di targeting (NUMTs) inserito nel genoma nucleare.

Due punti in questo protocollo sono cruciali durante l'analisi di metilazione del DNA mitocondriale. 1) l'apertura della struttura secondaria e 2) il disegno di primer specifici del DNA mitocondriale.
Digerendo il DNA genomico umano con l'enzima di restrizione BamHI (Figura 1), la struttura di DNA mitocondriale sarà tagliata alla posizione del nucleotide 14.258 e la struttura secondaria sarà aperto.
Le eventuali alterazioni della conversione di bisolfito con una struttura secondaria del mtDNA intatto sono molto probabile a sovrastimare il tasso di unconversion di mtDNA. Del bisolfuro, il tasso di unconversion del mtDNA è stato studiato, in non digerito e digerito il DNA totale dalle cellule di muscolo scheletrico umano, alle 5 diverse regioni del genoma mitocondriale: il Loop dislocamento (D-Loop), il ribosoma di tRNA fenilalanina e 12S (tRNA - F + 12S), 16S ribosoma (16S), NADH deidrogenasi 5 (ND5) e gene di mRNA codificante di citocromo b (CYTB) (Figura 2). Tasso di unconversion ha variato da 0 - 15,1% in tutte le regioni indagate per mtDNA non digerito. Tuttavia, quando il DNA è stato digerito prima della conversione di bisolfito, il tasso di unconversion è sceso ad un massimo di 1% di tutte le regioni (Figura 3). Così, illustrando l'importanza della digestione BamHI prima della conversione di bisolfito per evitare sopravvalutazione dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale.
Contaminazione del DNA nucleare è inevitabile quando isolando il genoma mitocondriale e dal momento che quasi l'intero genoma mitocondriale è stata replicata nel genoma nucleare, ha dato origine a inserimenti nucleari del genoma mitocondriale chiamato nucleare Segmenti mitocondriale (NUMTs)36. Per garantire che i livelli di metilazione del DNA analizzati corrispondono al DNA mitocondriale e non NUMTs, è di importanza più esterno per disegnare primers specifici per il genoma mitocondriale. Nella figura 4 viene illustrato come controllare la specificità del primer e display tabella 1 umano e sequenze dell'iniettore del mtDNA del mouse.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td colspan="3">Sequenza</td>
			<td>Posizione</td>
			<td>Dimensione amplicone</td>
			<td>Temperatura di annealing</td>
			<td>Strand</td>
		</tr>
<tr>
<td>Umano</td>
			<td colspan="3"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Loop</td>
			<td colspan="3">F: AAATCTATCACCCTATTAAC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT</td>
			<td>6-298</td>
			<td>292</td>
			<td>55° C</td>
			<td>Antisenso</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Loop</td>
			<td colspan="3">F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT</td>
			<td>279-458</td>
			<td>179</td>
			<td>55° C</td>
			<td>Antisenso</td>
		</tr>
<tr>
<td>12S + TF</td>
			<td colspan="3">F: TTTATATAACTTACCTCCTC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG</td>
			<td>577-765</td>
			<td>188</td>
			<td>55° C</td>
			<td>Antisenso</td>
		</tr>
<tr>
<td>260</td>
			<td colspan="3">F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC</td>
			<td>2763-2873</td>
			<td>110</td>
			<td>53° C</td>
			<td>Senso</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYTB</td>
			<td colspan="3">F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC</td>
			<td>15091-15243</td>
			<td>152</td>
			<td>55° C</td>
			<td>Senso</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mouse</td>
			<td colspan="3"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>220</td>
			<td colspan="3">F: ACACATACAAACCTCCATAAAC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT</td>
			<td>111-287</td>
			<td>176</td>
			<td>53° C</td>
			<td>Antisenso</td>
		</tr>
<tr>
<td>260</td>
			<td colspan="3">F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT</td>
			<td>1749-1896</td>
			<td>147</td>
			<td>53° C</td>
			<td>Antisenso</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYTB</td>
			<td colspan="3">F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA</td>
			<td>14129-14307</td>
			<td>178</td>
			<td>55° C</td>
			<td>Antisenso</td>
		</tr>
<tr>
<td>260</td>
			<td colspan="3">F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC</td>
			<td>2576-2727</td>
			<td>151</td>
			<td>55° C</td>
			<td>Senso</td>
		</tr>
<tr>
<td>ND5</td>
			<td colspan="3">F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA</td>
			<td>12659-12910</td>
			<td>251</td>
			<td>55° C</td>
			<td>Senso</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYTB</td>
			<td colspan="3">F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC</td>
			<td>14242-14504</td>
			<td>262</td>
			<td>55° C</td>
			<td>Senso</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: sequenze Primer per l'essere umano e del mouse mtDNA. Si noti che ricottura temperature di PCR primer variare a causa delle differenze nella temperatura di fusione degli iniettori.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57772/57772fig1.jpg"> Figura 1 : Gel elettroforesi di DNA digerito BamHI, o non digerito. Il DNA di Genomic dal muscolo scheletrico umano era non trattato o trattato con BamHI per 4h a 37° C e l'elettroforesi del gel è stato eseguito su un gel di agarosio 1.5%. <a href="/files/ftp_upload/57772/57772fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57772/57772fig2.jpg"> Figura 2 : Mappa del genoma mitocondriale umano. Regioni del genoma mitocondriale, studiato da bisolfuro e il sito di enzima di restrizione BamHI vengono visualizzate. Il DNA mitocondriale contiene 13 mRNAs, 2 RNA ribosomiale (rRNA) e 22 RNA di trasferimento. Abbreviazioni: PH1: pesante-strand promotore 1; PH2: pesante-strand promuovere 2; PL: promotore di luce-filo; OH: Origine di replicazione da pesanti-strand; OL: origine di replicazione da luce-strand. <a href="/files/ftp_upload/57772/57772fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57772/57772fig3v2.jpg"> Figura 3 : BamHI digestione prima della conversione di bisolfito riduce il tasso di unconversion di mtDNA nelle cellule di muscolo scheletrico umano. Del bisolfuro, non digerita e digerita percentuale di unconversion di DNA mitocondriale sono stati interrogati in cinque diverse regioni del genoma mitocondriale in cellule di muscolo scheletrico umano (N= 3). La piazza piena rappresenta siti CpG e la piazza aperta rappresenta siti non-CpG. I risultati sono presentati con un intervallo di min-max e un test di segno è stato utilizzato per verificare le differenze significative unconversion. D-Loop (6-298) P= 1.83E-42; D-Loop (279-458): P= 4.55E-13; tRNA - F + 12S: P= 8.38 e-16; 16S: P= 5.91E-06; ND5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-Loop (6-298) include l'origine di replicazione e promotore di filo pesante 2 tRNA - F + 12S. Questi dati sono stati pubblicati altrove 3. <a href="/files/ftp_upload/57772/57772fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57772/57772fig4.jpg"> Figura 4 : L'uso di Bisearch per verificare primer specificità verso il genoma mitocondriale. A) sequenze dell'iniettore bisolfito-convertiti vengono aggiunti per la funzione BiSearch cerca di Primer (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). È contrassegnare la casella di bisolfito, e viene selezionato un genoma di riferimento. B) esempio di potenziali prodotti PCR generati sulle catene di senso e antisenso. <a href="/files/ftp_upload/57772/57772fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la quantificazione accurata della metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con una pipeline di analisi bioinformatica che può essere utilizzata per evitare la sopravvalutazione dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale causato dalla struttura secondaria del mtDNA.

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K Views.  University of Copenhagen. Qui, presentiamo un protocollo per consentire la quantificazione accurata della metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con una pipeline di analisi bioinformatica che può essere utilizzata per evitare la sopravvalutazione dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale causato dalla struttura secondaria del mtDNA.

Video: Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Ricerca

Genetica

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

Analisi completa della metilazione del DNA usando un metodo basato sulla cattura di dominio di metile-CpG in pazienti con leucemia linfocitica cronica

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Protocolli per l&#39;assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Sistema di integrazione bidirezionale retrovirale Metodo PCR e flusso di lavoro analitico dei dati quantitativi

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...