Questo lavoro è stato supportato dalla British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust e il MRC.

<ol>
	<li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li><li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+diabetic+nephropathy:+their+utility+and+limitations.">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li><li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+diabetic+renal+injury+form+the+db/db+mouse+model+of+type+2+diabetic+nephropathy.">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li><li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+FSGS:+lessons+for+pathogenesis+and+treatment.">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li><li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A165b+protects+against+proteinuria+in+a+mouse+model+with+progressive+depletion+of+all+endogenous+VEGF-A+splice+isoforms+from+the+kidney.">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li><li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis.">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li><li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5/6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number.">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice.">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li><li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli.">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li><li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice.">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li><li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research.">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li><li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli.">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li><li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space.">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier:+a+morphofunctional+study+in+the+rat.">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277 (2011).</li><li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats.">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li><li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy.">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice.">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Consentono i passaggi critici di ogni metodo per dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, compresa la valutazione della permeabilità dei reni nel suo complesso (misure della creatinina del plasma e dell'uACR), la permeabilità della singoli dei glomeruli (glomerulare LpA / Vho), esame delle alterazioni strutturali (PAS, Trichrome blu ed EM), la localizzazione della proteina (se) e l'espressione genica glomerulare (RT-PCR e Western blotting). Questi metodi sono fondamentali per la valutazione completa della funzione glomerulare in modelli murini di malattia renale.
Nel valutare la permeabilità della GFB, molti studi hanno optato per utilizzare il tasso di escrezione dell'albumina dell'uACR o 24h convenzionale come una misura efficace17,18. Anche se queste tecniche permettono la valutazione della permeabilità GFB nel suo complesso, non consente per la valutazione individuale permeabilità glomerulare e variazione tra i glomeruli. Gli studi precedenti hanno trovato misura del glomerulare LpA / V,i , per essere una misura più sensibile delle modifiche al GFB permeabilità5,9. Infatti, nei risultati della rappresentativi ha dimostrati in questa carta, a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO, VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b topi hanno un significativamente più bassa dell'uACR rispetto ai topi KO VEGF-A; Tuttavia, questo risultato non viene riflessa nella glomerulare LpA / Vho misure, dove VEGF-A165b non ha impedito significativamente aumenta in GFB permeabilità (Figura 1 e Figura 2)5. Ciò dimostra l'importanza di utilizzare saggi multipli per valutare sia la permeabilità del rene e la permeabilità dei glomeruli individuali. Inoltre, la glomerulare LpA / Vho oncometric l'analisi suggerisce che la permeabilità dei glomeruli individuali dal rene stesso può variare notevolmente, in particolare malattia modelli5,10, 19. una limitazione alla misura la glomerulare LpA / Vho è che essa può essere eseguita solo nel punto finale sperimentale; Pertanto, misure regolari dell'uACR vengono richiesto di fornire un'indicazione del punto finale sperimentale.
Oltre a valutare il fenotipo funzionale, il presente metodo incoraggia inoltre la valutazione del fenotipo strutturale ed ultrastrutturale. Questo può essere fatto utilizzando una selezione di macchie quali PAS, tricromica e le macchie d'argento; ogni valutare diversi aspetti della morfologia glomerulare. Nei modelli acuti della malattia glomerulare, che è spesso il caso in modelli murini, è può essere difficile da rilevare eventuali anomalie strutturali maggiori utilizzando queste macchie, a meno che non sei un patologo renale addestrato. Di conseguenza, realizzazione di EM è suggerito per valutare l'ultrastruttura di GFB, che permette la misurazione quantitativa di parametri quali il GBM, fenestrae endoteliale e numero le dimensioni caratteristiche del Podocita. Tali misure richiedono una formazione minima eseguire e permette al ricercatore di determinare la cella-tipi e strutture interessate in un modello di malattia. Nell'esempio indicato nei risultati rappresentativi, il mouse VEGF-A KO è stato trovato per essere un modello delicato della malattia glomerulare, così, non presenti anomalie strutturali maggiori erano presenti al momento di colorazione PAS. Tuttavia, specifici del Podocita VEGF-A KO ha indotto i cambiamenti il GBM, podociti e cellule endoteliali durante l'esame l' ultra-struttura glomerulare5. Purtroppo, la preparazione del rene per EM descritte nel presente metodo non attivare il rilevamento del glicocalice endoteliale, che è anche conosciuto per avere effetti significativi sulla permeabilità del GFB19. Al fine di misurare con precisione la profondità di glicocalice, rene dovrebbe essere irrorare-fisso con glutaraldeide 2,5% con 1% Alcian blu per l'etichettatura di glicocalice endoteliale, come descritto in Oltean et al.19.
Una volta che sono stati valutati il fenotipo funzionale e strutturale, il pattern di espressione/attivazione di diversi geni e vie quindi può essere valutato specificamente nei glomeruli. Previa valutazione ultra-strutturale potrebbe dare alcune informazioni per quanto riguarda la cella tipi/glomerulare strutture coinvolte, che indica se Podocita o endoteliali specifici geni/pathways dovrebbe essere esaminato. Ad esempio, nei risultati rappresentativi dai topi KO VEGF-A, è stata osservata una riduzione del numero di fenestrae endoteliale (Figura 3D); Pertanto, l'espressione della proteina glomerulare di un indicatore endothelial noto per essere coinvolti nella via del VEGF-A è stato esaminato; VEGFR-2 (Figura 4B)5. Oltre l'espressione delle proteine nei glomeruli, la loro localizzazione possa anche essere visualizzata con se. In uno studio di Zhang et al.20, specifiche del Podocita sovraespressione di GLUT1 è stata confermata in podociti di se co-localizza il GLUT1 aumentata con podocina.
Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'uso del metodo descritto in questo documento per valutare la funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare permette il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. Questo metodo può essere applicato facilmente per le indagini future in funzione glomerulare nella valutazione di fenotipi di malattia e di terapeutica potenziale.
In conclusione, questo protocollo generico ed adattabile descrive un work-up completo del rene per modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. Tali modelli murini includono spontanea come spontaneamente ipertesi (SHR) ratti1, streptozotocin (STZ)-indotta in ratti diabetici e topi2, e il db/db tipo II topi diabetici3, modelli geneticamente come primaria specifiche del Podocita sclerosi glomerulare segmentale focale (FSGS) modelli4, specifici del Podocita endoteliale fattore di crescita vascolare (VEGF-A) knock-out (KO VEGF-A) modello5, e la sindrome di Alport modelli6e acquisito modelli come la nefrectomia di 5/67 e l'ostruzione ureteral unilaterale (UUO) modello8. Al fine di valutare i diversi aspetti della funzione glomerulare in questi modelli, sono disponibili diverse tecniche. Lo scopo di questa carta di metodo è quello di dimostrare un work-up completo che deve essere eseguito in modelli murini di malattia renale al fine di valutare appieno la funzione glomerulare.
La spiegazione razionale dietro l'uso di questo metodo è che esso consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Questo include la valutazione della permeabilità glomerulare, sia di proteine e di acqua, le anomalie strutturali glomerulari e cambiamenti nell'espressione/impionbatura di mRNA e proteine essenziali per la normale funzione glomerulare. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Si tratta di informazioni vitali sul meccanismo della malattia, che è necessaria quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli.
Nella letteratura, è un evento comune per essere presentato con un modello murino di malattia glomerulare dove il fenotipo è determinato da un aumento del livello di albumina nelle urine. Tuttavia, ci è prova per suggerire che un unico metodo per determinare la funzione glomerulare non è sempre efficace; misura il tasso di escrezione urinaria dell'albumina o il rapporto di creatinina urinaria dell'albumina (dell'uACR) fornisce solo informazioni sulla funzione renale totale e non dei singoli glomeruli. Precedenti studi hanno dimostrato che la permeabilità può variare in glomeruli differenti dalla stessa rene5,9,10. Inoltre, la valutazione della permeabilità dei glomeruli individuali è un modo più sensibile di valutazione della funzione glomerulare; la tecnica di misurazione della permeabilità glomerulare individuali (LpA / Vio) ha dimostrato di essere più sensibili ai cambiamenti nella funzione glomerulare rispetto alla valutazione dell'uACR9. Questo test è utile in modelli murini che sono resistenti alla proteinuria, come quelle su una priorità bassa c57BL/611. Il vantaggio della carta metodo attuale è che esamina sia la totale permeabilità renale all'albumina, nonché i singole glomerulare permeabilità all'acqua.
Esame delle anomalie strutturali glomerulari è spesso valutata tramite una batteria di macchie quali acido periodico Schiff (PAS), tricromica e le macchie d'argento. Questi strumenti consentono un patologo renale addestrato per valutare il livello di malattia renale tramite un metodo segnante. Anche se tutti i buoni metodi, le modifiche alla macro-struttura glomerulare non sono sempre rispettati nel danno renale acuto modelli12. Questo metodo propone che oltre a svolgere le tecniche di istologia renale sopra descritte, l'ultra-struttura glomerulare dovrebbe essere valutata anche tramite microscopia elettronica (EM). Un glomerulo macchiato può guardare relativamente normale microscopio ottico regolari; Tuttavia, al momento della valutazione con EM, piccoli cambiamenti nella membrana basale glomerulare (GBM) larghezza, Podocita piede processo effacement, fenestrazioni endoteliali e la copertura dello spazio sub-Podocita è analizzato. Pertanto, è essenziale che l'ultra-struttura glomerulare e la microstruttura è valutato per determinare il meccanismo di disfunzione glomerulare.
Oltre a valutare le anomalie strutturali glomerulari, cambiamenti in mRNA e l'espressione della proteina e splicing, come pure l'attivazione della proteina (ad es., fosforilazione), dovrebbero essere esaminati per più ulteriormente per delucidare i meccanismi della malattia glomerulare. Quando guardando la malattia glomerulare, o, per esempio, quando KO/over-expressing un gene specificamente in cellule glomerulari, ad esempio il Podocita specifiche VEGF-A KO del mouse5, è importante che i cambiamenti di mRNA e proteina sono esaminati solo all'interno del cellule glomerulari e non l'intero rene. Questo protocollo descrive un metodo in cui i glomeruli sono isolati dalla corteccia del rene del mouse, e quindi il proteina/RNA sono isolati. Questo permette l'analisi specifica della disregolazione della proteina/mRNA nei glomeruli di modello della malattia.
Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic Cages</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>52-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5912-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>E90-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRstar nano</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>SPECTRstar nano or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilisation solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% precast protein gel</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laaemmli Sample buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot cell</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris running buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatinine Companion</td>
			<td>Exocell</td>
			<td>1012 Strip Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Blood Collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-25G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>PMC0735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Vial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0914X10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10110101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10681894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tissue Molds</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Surgical Disection Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-005-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>EC1 64-0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomerular Permeability Rig</td>
			<td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td>
			<td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Sieves</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-59984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>108298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425-72EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aradite Resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>CY212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>e.g. 957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td>
			<td>Acris</td>
			<td>BP5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0372-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 Cell Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FNN0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Transfer Buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10713387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M053S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo dT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>48190011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9915G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Light Miscroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Analysis Software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Microscope</td>
			<td>Britannica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. La nostra ricerca è concentrata sulla valutazione della funzione glomerulare in nefropatia diabetica e specifiche del Podocita VEGF-A topi knock-out; di conseguenza, questo protocollo descrive il rene completo work-up utilizzato nel nostro laboratorio per valutare questi modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'utilizzo del metodo descritto in questo documento consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore può determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. I metodi consentono dettagliata valutazione funzionale della barriera di filtrazione glomerulare attraverso misurazioni del rapporto creatinina urinaria dell'albumina e permeabilità glomerulare individuali, così come esame sia strutturale che ultra-strutturale usando la macchia dello Schiff dell'acido periodico e la microscopia. Inoltre, analisi della dysregulated geni a livello di mRNA e proteina consente analisi meccanicistica della funzione glomerulare. Questo protocollo descrive i metodi generici ma adattabili che possono essere applicati a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Urina è stata raccolta utilizzando gabbie metaboliche da wild type (WT), inducibile Podocita specifiche VEGF-A knock out (VEGF-A KO) e VEGF-A KO X Jhonny-VEGF165b topi (VEGF-A KO topi che over-esprimono l'isoforma b umano VEGF-A165in podociti in un maniera costitutiva). Su misura del rapporto albumina urinaria della creatinina alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di doxiciclina di VEGF-A KO, VEGF-A KO topi sviluppato progressivo albuminuria da 10 settimane rispetto al WT littermate controlli. I valori assoluti può essere visto in Figura 2Ae la normalizzazione alla linea di base di ogni valori del mouse nella Figura 2B. Tuttavia, albuminuria in non osservato nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (Figura 2), che indica che il VEGF-A165b è protettiva nel modello dell'albuminuria5.
La glomerulare LpAVmi è stata misurata in singoli glomeruli setacciati da WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b reni. Un esempio di come un glomerulo viene catturato e la contrazione osservata quando perifused con 8% BSA è mostrato in Figura 3A. Questo restringimento viene quindi utilizzato per determinare la glomerulare LpA / Vho per ogni glomerulo (Figura 3B). Topi KO per il VEGF-A ha avuto un significativo aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-KO rispetto ai glomeruli controllo WT. Anche se più bassi in VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi, l'aumentata glomerulare LpA / V non è stato impedito di sovra-espressione di VEGF-A165b a 14 settimane5.
PAS di colorazione di sezioni di corteccia del rene 14 settimane dopo induzione di VEGF-A KO non ha rivelato alcune anomalie strutturali glomerulari nei VEGF-A KO o VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi (Figura 4A). Tuttavia, sull'analisi della ultra-struttura glomerulare tramite EM, VEGF-A KO topi avevano sviluppato una maggiore larghezza GBM, riduzione del numero di fenestrae endoteliale, è diminuito di copertura SPS e maggiore Podocita medio taglio (Figura 4-4F ). Il piede Podocita medio processo di larghezza e il numero di strisce è rimasto invariato (Figura 3B e 3G). Sovra-espressione di VEGF-A165b nei topi KO VEGF-A ha impedito i cambiamenti per il GBM e taglio (Figura 4 e 4F). Tuttavia, il VEGF-A165b ha avuto alcun effetto sul numero di fenestrae alterata e SPS copertura (Figura 4 e 4E)5.
RT-PCR effettuata su RNA Estratto da glomeruli setacciati ha rivelato che l'umano VEGF-A165b mRNA è presente solo nei topi di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (Figura 5A). Durante l'estrazione della proteina da glomeruli setacciati e valutazione dei livelli di proteine tramite Western blotting, l'espressione della proteina glomerulare di VEGFR-2 è stata trovata per essere diminuita in topi KO VEGF-A, che è stata impedita da sovra-espressione di VEGF-A165b ( Figura 5B e 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Figura 1. Impostare schematica dell'impianto di perforazione permeabilità glomerulare (LpA). (A) il glomerulo è catturato su (B) la micropipetta all'interno di un supporto mediante aspirazione, che è fissato su un supporto per la stabilità. (C) rettangolare 2mpx. Obiettivo 4x (D) di un microscopio con una videocamera. (E) soluzione di BSA 1% riscaldato a 37 ° C. (F) soluzione all'8% BSA riscaldato a 37 ° C. (G) remoto toccare cuscinetto perifusate-contenente due linee, che consente lo scambio rapido perifusate. (H) itinerario di perifusate verso la 2mpx, che poi si bagna il glomerulo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figura 2. Rapporto della creatinina urinaria dell'albumina. (A) i valori dell'uACR alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di VEGF-A KO in topi165b WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A. (B) gli stessi valori dell'uACR normalizzato al valore basale (settimana 0) di ogni singoli mouse. Dell'uACR aumentato significativamente in topi KO per VEGF-A alle settimane 10 e 14 confrontati ai comandi di littermate WT, che è stata impedita nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; ANOVA a due vie, correzione per il confronto tra le coppie; n = 4-12 topi al punto di tempo; barre di errore: errore standard della media [SEM]). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figura 3. Misura della permeabilità glomerulare. (A) il glomerulo è catturato la micropipetta tramite aspirazione; il perifusate è passato da BSA 1% (Ai) a 8% BSA (Aii), e restringimento glomerulare è osservato. (B) le misurazioni effettuate prima e dopo il passaggio di BSA 8% vengono utilizzate per determinare la glomerulare LpA / Vho. (C) VEGF-A KO topi sviluppano un aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO confrontati ai comandi WT. Questo non è stato impedito significativamente nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 4-9 topi, 15-30 glomeruli; barre di errore: SEM). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figura 4. Analisi strutturale glomerulare. (A) PAS macchiatura della corteccia del rene non ha indicato tutte le anomalie strutturali nei glomeruli da topi WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b (Ai - iii). EM ha rivelato le anomalie ultrastrutturali nei glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) la media FPW non è cambiato tra gruppi. (C) The GBM aumentato nei glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (D) il numero di fenestrae è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che è rimasto inalterati dalla copertura di VEGF-A165b. (E) la SPS è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che inoltre è rimasto invariati da VEGF-A165b. (F) la media a taglio larghezza è stata aumentata in glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (G) il numero di fessura è rimasto invariato fra i tre gruppi (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 topi, 9 glomeruli; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figura 5. espressione di mRNA e proteina di marcatori. (A) RT-PCR ha mostrato che umana espressione di mRNA di VEGF-A165b solo era evidente nei glomeruli setacciati dai topi di VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b. (B) Western blotting hanno indicato che l'espressione della proteina VEGFR-2 era down-regolata in glomeruli VEGF-A KO, che è stata impedita in glomeruli di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 - 6 topi; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease at JoVE.com

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

assessment-of-kidney-function-in-mouse-models-of-glomerular-disease

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

17.4K Views.  University of Exeter. Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Video: Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of cardiovascular disease. Although molecular biology is necessary in identifying key changes in the signaling pathway, it is not a surrogate for functional significance. While physiology can provide answers to the question of function, combining physiology with biochemical assessment of metabolites in the intact, beating heart allows for a complete picture of cardiac function and energetics. For years, our laboratory has utilized isolated heart perfusions combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accomplish this task. Left ventricular function is assessed by Langendorff-mode isolated heart perfusions while cardiac energetics is measured by performing 31P magnetic resonance spectroscopy of the perfused hearts. With these techniques, indices of cardiac function in combination with levels of phosphocreatine and ATP can be measured simultaneously in beating hearts. Furthermore, these parameters can be monitored while physiologic or pathologic stressors are instituted. For example, ischemia/reperfusion or high workload challenge protocols can be adopted. The use of aortic banding or other models of cardiac pathology are apt as well. Regardless of the variants within the protocol, the functional and energetic significance of molecular modifications of transgenic mouse models can be adequately described, leading to new insights into the associated enzymatic and metabolic pathways. Therefore, 31P NMR spectroscopy in the isolated perfused heart is a valuable research technique in animal models of cardiovascular disease.

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff-mode isolated heart perfusion, in conjunction with 31P NMR spectroscopy, combines the fields of biochemistry and physiology into one experiment. The protocol allows for the dynamic measurement of high energy phosphate content and turnover in the heart while concurrently monitoring physiologic function. When performed correctly, this is a valuable technique in the assessment of cardiac energetics.

Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante 31 P spettroscopia NMR

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Ricerca

Medicina

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Small animal magnetic resonance imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial tissue. The high heart rates of small animals (200 to 600 beats/min) have previously limited the role of CMR imaging. Small animal Look-Locker inversion recovery (SALLI) is a T1 mapping sequence for small animals to overcome this problem 1. T1 maps provide quantitative information about tissue alterations and contrast agent kinetics. It is also possible to detect diffuse myocardial processes such as interstitial fibrosis or edema 1-6. Furthermore, from a single set of image data, it is possible to examine heart function and myocardial scarring by generating cine and inversion recovery-prepared late gadolinium enhancement-type MR images 1.
	The presented video shows step-by-step the procedures to perform small animal CMR imaging. Here it is presented with a healthy Sprague-Dawley rat, however naturally it can be extended to different cardiac small animal models.

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Contrast enhanced cardiac magnetic resonance (CMR) imaging allows comprehensive in vivo assessment of the heart in small animal models of cardiovascular disease. Here we detail the procedures to perform CMR imaging, reconstruction and analysis using Small Animal Lock-Locker Inversion Recovery (SALLI) in rats.

Valutazione della funzione cardiaca e Morfologia miocardica Utilizzando Small Animal Look-Locker Inversion Recovery (SALLI) MRI nei ratti

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Valutazione del ventricolo destro Struttura e funzione in modello murino di polmonare Arteria Costrizione da ecocardiografia transtoracica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

Valutazione della funzione vascolare nei pazienti con malattia renale cronica

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

L&#39;uso di ultra-alto campo MRI in piccolo roditore modelli di malattia del rene policistico per<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotipizzazione and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

La valutazione transcutanea della funzione renale nei roditori Conscious

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated measurements over weeks or months of accessory respiratory muscle activity while simultaneously measuring ventilation in a non-anesthetized, freely behaving mouse. The technique includes the surgical implantation of a radio transmitter and the insertion of electrode leads into the scalene and trapezius muscles to measure the electromyogram activity of these inspiratory muscles. Ventilation is measured by whole-body plethysmography, and animal movement is assessed by video and is synchronized with electromyogram activity. Measurements of muscle activity and ventilation in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are presented to show how this tool can be used to investigate how respiratory muscle activity changes over time and to assess the impact of muscle activity on ventilation. The described methods can easily be adapted to measure the activity of other muscles or to assess accessory respiratory muscle activity in additional mouse models of disease or injury.

This paper introduces a method for repeated measurements of ventilation and respiratory muscle activity in a freely behaving amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mouse model throughout disease progression with whole-body plethysmography and electromyography via an implanted telemetry device.

Misurazione ripetuta di attività muscolare respiratoria e ventilazione in modelli murini di malattie neuromuscolari

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively affect skeletal muscle. This can result in a loss of muscle mass (atrophy) and/or loss of muscle quality (reduced force per unit of muscle mass), both of which are prevalent in chronic disease, muscle-specific disease, immobilization, and aging (sarcopenia). Skeletal muscle function in animals can be evaluated by a range of different tests. All tests have limitations related to the physiological testing environment, and the selection of a specific test often depends on the nature of the experiments. Here, we describe an in vivo, non-invasive technique involving a helpful and easy assessment of force frequency-curve (FFC) in mice that can be performed on the same animal over time. This permits monitoring of disease progression and/or efficacy&#160;of a potential therapeutic treatment.

Measurement of rodent skeletal muscle contractile function is a useful tool that can be used to track disease progression as well as efficacy of therapeutic intervention. We describe here the non-invasive, in vivo assessment of the dorsiflexor muscles that can be repeated over time in the same mouse.

Valutazione non invasiva della funzione Dorsiflexor muscolare nei topi

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...