Questo metodo consente un rapido screening in vivo nei topi, dell'effetto di un transgene, ed è specificamente adattato per eseguire studi di guadagno o perdita di funzione, nonché una risposta e una mappatura del movente del DNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'uso pronostico di animali transgenici è superiore al 70% del neonato e può essere applicato a qualsiasi ceppi di topi, compresi gli animali transgenici. Dopo aver eutanasiato i topi, raccogliere gli ovidotti.
Per iniziare l'intervento chirurgico, utilizzare le forbici per fare una grande incisione orizzontale nella cavità addominale. Quindi, individuare l'ovidotto tra l'utero e l'ovaio. Successivamente, utilizzare le forcep curve per rimuovere il mesometrio e la membrana con i vasi sanguigni prominenti.
Quindi, separare l'ovidotto dall'ovaio e sezionare l'ovidotto dall'ovaio. Quindi, tirare sull'ovidotto e tagliare lontano dall'utero. Trasferire tutti gli ovidotti raccolti su mezzo M2 a temperatura ambiente.
Quando si maneggiano gli ovidotti, fare attenzione a evitare di toccare l'ampulla gonfia carica di uova fecondate. Quindi, aggiungere una goccia di 100 microliter di soluzione di lavoro di ialuronidasi a un piatto di 10 centimetri. Quindi trasferire i due ovidotti in esso, per rimuovere le cellule cumuli dalle uova.
Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare un paio di siringhe per insulina per fissare l'ovidotto mentre si strappa l'ampulla e si disperdono le uova fecondate. Quindi, utilizzare una pipetta di vetro preparata con tubi e un bocchino per aspirare tutte le uova. Utilizzando questo strumento, trasferirli tra sei gocce di mezzo M2 per lavare via le cellule cumuli circostanti.
Quindi, trasferire le uova lavate in un pozzo di 10 millimetri, in un piatto di quattro po ', riempito con preriscaldato con M16. Quindi, trasferire il piatto in un'incubatrice umidificata di 37 gradi Celsius. In preparazione, centrifugare la sospensione vettoriale lentivirale preparata a 160 g per due minuti, per pellettare i detriti spesso presenti in stock lentivirale.
In un armadio di sicurezza di classe due, trasferire i supernatanti in un nuovo tubo da 0,5 millilitri. Quindi, caricare un microlitro di supernatante, in una pipetta di iniezione. Quindi, attaccare la pipetta di iniezione al micromanipulato lato destro.
E attaccare la pipetta di tenuta al micromanipolatore laterale sinistro. Ora, erogare otto microlitri di mezzo M2 al centro dello scivolo depressionario. E coprire con olio di parafina leggera per evitare l'evaporazione.
Quindi, posiziona 20 uova nelle posizioni poco profonde nella goccia senza creare bolle. Assicurarsi quindi che la punta della pipetta di iniezione sia aperta. In caso meno, toccare la pipetta di iniezione con la pipetta di tenuta per aprirla.
Quindi, impostare il microiniettore per iniezioni di 20 secondi. Ora, usando la pipetta di tenuta e la pressione manuale aspirare un uovo fecondato che contiene due pronuclei e due corpi polari. Quindi, utilizzando la pipetta di iniezione iniettare lo spazio perivitellino dell'uovo.
Non toccare la membrana plasmatica. Regolare la pressione in modo che lo spazio perivitellino sia riempito con la soluzione. La pressione non deve superare i 600 etto pascal.
Immediatamente dopo aver iniettato le 20 uova, trasferire il lotto in un bagno di mezzo M16 preriscaldato. E incubarli per almeno 30 minuti prima di impiantarli. 16 ore dopo aver accoppiato femmine normali a maschi con vasectomie, verificare la presenza di spine di copulazione.
Usa queste femmine per l'impianto. Successivamente, realizzare pipette di impianto con diametro interno di circa 150 micron. E con punte lucidate a fiamma lunghe dai quattro ai cinque millimetri.
Caricare una pipetta con olio di parafine leggero testato e testato in embrione appena sopra il punto della spalla. Quindi, aspirare una piccola bolla d'aria e caricare ulteriormente la pipetta con mezzo M2. Quindi, aspira una seconda bolla d'aria.
Ora, disegna gli embrioni nella pipetta uno dietro l'altro, riducendo al minimo il volume di mezzo tra gli embrioni. Finire, aspirando una piccola goccia di olio di parafina larga solo un embrione. La preparazione della pipetta di reimpianto è fondamentale e richiede molta pratica.
Le uova nella pipetta devono essere allineate praticamente senza mezzo tra di loro. Successivamente, dopo aver anestetizzato il topo e confermato l'anestesia con un dito del piedi pizzicare Radersi da due strisce di capelli di due, due centimetri lungo il midollo spinale a livello dell'ultima costola. Ora, posizionare il mouse su un tappetino riscaldante su un campo sterile e drappeggiarlo, lasciando una finestra sulla pelle esposta.
Quindi, sanificare la pelle esposta con scrub alternati di iodoprovidone e 70% di etanolo. Per l'impianto, prima fare un'incisione trasversale di un centimetro, quindi far scorrere la pelle lateralmente fino a quando l'ovaio di colore arancione è visibile attraverso la parete del corpo. Quindi, fai un'incisione di cinque millimetri con le forbici fini e raccogli il cuscinetto grasso con un morsetto bulldog atraumatico.
Una volta afferrato il tampone, estrarre l'ovaio, l'ovidotto e la parte superiore dell'utero. Successivamente, individuare l'ampolla e fare un'emisezione con forbice di vannas, sul segmento dell'ovidotto che collega l'ovaio all'ampolla. Quindi, introdurre la pipetta dell'embrione di trasferimento ed espellere le uova.
Fermarsi alla prima bolla d'aria dopo che le uova sono state rilasciate. Avere i materiali richiesti pronti a ripetere la procedura sul secondo ovidotto. E una volta completato, chiudi la pelle con clip ferita.
Immediatamente dopo aver chiuso la pelle, iniettare per via intraperitoneaica e posizionare l'animale nella camera di recupero con un elemento riscaldante a 39 gradi Celsius. Monitorare fino a quando non è completamente sveglio. Gli animali transgenici sono stati generati utilizzando il metodo presentato.
Un alto vettore lentivirale titer sono stati prodotti utilizzando un potenziatore di base da 2,3 chili per Neurogenin-3 per guidare l'eGFP. O come controllo, un frammento del cromosoma sei per guidare l'eGFP. L'integrazione negli embrioni ha avuto abbastanza successo.
Dagli embrioni, il germoglio pancreatico è stato sessato e immunosocitato per cercare l'espressione localizzata di eGFP. Oltre il 90% dei vettori, con l'esaltatore Neurogenin-3, ha espresso eGFP nelle cellule che esprimono Neurog3. Tuttavia, nessuno dei vettori di controllo integrati ha espresso eGFP nella gemma pancreatica.
I siti di integrazione transgene sono stati valutati mediante PCR quantitativa, utilizzando il gene CDX2 come controllo. Il numero medio di siti di integrazione era di circa 20 utilizzando il costrutto Neurogenin-3, o 10 usando il costrutto di controllo. Curiosamente, il titer di trasduzione virale usato per il costrutto Neurogenin-3, era circa il doppio del vettore di controllo.
Suggerire una relazione tra il titer di trasduzione e il numero di integrazioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare un gran numero di embrioni transgenici fondatori utilizzando l'iniezione di perivitellina di vettori lentivirali ad alta efficacia. Una volta padroneggiata, questa tecnica può produrre fino a 50 animali fondatori entro un solo giorno dalla microiniezione, se eseguita correttamente.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'iniezione di DNA pronucleare del titer, al fine di stabilire linee di topo transgeniche. Non dimenticare che lavorare con vettori lentivirali è soggetto all'autorizzazione del tuo comitato OGM locale. Questi vettori possono essere estremamente pericolosi e la precauzione dovrebbe sempre essere presa durante l'esecuzione di questa procedura.
