慢病毒载体介导的转基因小鼠生产: 一种简单高效的创始人直接研究方法

这种方法允许在小鼠体内快速筛选，对转基因的影响，并特别适应进行功能增益或损失的研究，以及答案和DNA动机图谱。该技术的主要优点是转基因动物的预测使用超过70%的新生儿，可以应用于任何小鼠菌株，包括转基因动物。对老鼠实施安乐死后，收集卵巢。

要开始手术，使用剪刀将一个大的水平切口放入腹腔。然后，找到子宫和卵巢之间的卵巢。接下来，使用弯曲的钳子去除带有突出血管的肌膜和膜。

然后，将卵巢与卵巢分离，从卵巢中解剖卵巢。然后，拖着卵巢，切离子宫。在室温下将所有收集的卵巢转移到M2介质。

处理卵巢时，注意避免接触装满受精卵的肿胀的安布拉。接下来，在10厘米的培养皿中加入100微升的海龙酶工作溶液。然后将两个卵巢转移到其中，从卵子中去除积细胞。

在立体显微镜下，使用一对胰岛素注射器固定卵巢，同时撕裂安培和分散受精卵。然后，使用准备好的玻璃移液器与管道和喉舌吸气所有的鸡蛋。使用此工具，将它们转移到六滴M2介质之间，以洗掉周围的积液细胞。

然后，将洗净的鸡蛋转移到一个10毫米的井中，放在一个四井板中，里面装满了M16的预热。然后，将菜转移到加湿的37摄氏度的孵化器。在制备过程中，将制备的扁病毒载体悬浮液在160克下离心两分钟，以对通常存在于扁病毒库存中的碎片进行颗粒化。

在第二类安全柜中，将超级钠转移到新的0.5毫升管中。接下来，将一微升的上流液装入喷射移液器中。然后，将喷射移液器连接到右侧微调节器。

并将保持移液器连接到左侧微操纵器。现在，在凹陷滑梯的中心分配八个微升的M2介质。并覆盖轻副鳍油，以避免蒸发。

然后，将20个鸡蛋放入下降的浅处，而不产生气泡。接下来，确保注射移液器的尖端是打开的。如果没有，用保持移液器轻点喷射移液器以打开它。

然后，将微注射器设置为 20 秒的注射。现在，使用保持移液器和手动压力吸气的受精卵，其中包含两个前核和两个极性体。然后，使用注射移液器注射卵子的环线空间。

不要触摸等离子膜。调整压力，使边缘空间充满溶液。压力不应超过600个 hecto pascals。

注射20个卵子后，立即将批次转移到预热M16介质的浴缸中。在植入它们之前，先孵育至少30分钟。将正常雌性与男性进行输精管切除术后 16 小时，检查有没有交配塞。

使用这些女性进行植入。接下来，制作内径约150微米的植入移液器。和火焰抛光尖端，约四到五毫米长。

将带胚胎测试的移液器加载到肩点上方。然后，吸出一个小气泡，然后用 M2 介质进一步加载移液器。接下来，吸进第二个气泡。

现在，将胚胎放入另一个后面的移液器中，最大限度地减少胚胎之间的介质体积。完成，通过吸一小滴副鱼油只有一个胚胎宽。重新植入移液器的制备是关键，需要大量的实践。

移液器中的鸡蛋必须与它们之间几乎没有介质对齐。接下来，麻醉后，鼠标和确认麻醉与一个头趾捏剃掉两个，两厘米的头发条沿脊髓的最后一根肋骨的水平。现在，将鼠标放在无菌场地的加热垫上，然后披上它，为裸露的皮肤留下一扇窗户。

接下来，用交替的碘酮和70%乙醇的交替磨砂来消毒暴露的皮肤。对于植入，首先做一个一厘米的横向切口，然后横向滑动皮肤，直到橙色的卵巢通过身体壁可见。接下来，用细剪刀做一个五毫米的切口，用创伤斗牛犬夹拿起脂肪垫。

一旦垫被抓住，拉出卵巢，卵巢和子宫的顶部。接下来，找到安图拉，并在将卵巢与安培的卵巢连接的卵巢段上与凡纳斯剪刀进行下切。然后，引入移植胚胎移液器并弹出卵子。

鸡蛋释放后，在第一个气泡停止。准备好所需材料，在第二次风管上重复该过程。完成后，用伤口夹合上皮肤。

关闭皮肤后，立即注射镇痛剂，并放置动物在恢复室与39摄氏度的加热元素。监控，直到它完全清醒。转基因动物是用介绍的方法产生的。

使用2.3公斤基增强剂为神经根-3驱动eGFP，生产了高滴度扁病毒载体。或者作为一个控制，染色体六的片段来驱动eGFP。进入胚胎是相当成功的。

从胚胎，胰腺芽被分段和免疫污，以寻找eGFP的局部表达。超过90%的载体，用神经原宁-3增强剂，在神经g3表达细胞中表达eGFP。然而，在胰腺芽中，没有一个综合控制载体表示eGFP。

利用CDX2基因作为对照，通过定量PCR对转基因整合位点进行评估。使用 Neurogenin-3 构造的集成站点的平均数量约为 20 个，使用控制构造的集成站点数约为 10 个。奇怪的是，用于神经基因-3构造的病毒转导滴度，是控制载体的两倍。

建议转导滴度与集成数之间的关系。看完这段视频后，你应该对如何利用高疗效的扁病毒载体的近维泰林注射产生大量创始人转基因胚胎有了很好的了解。一旦掌握，这项技术可以产生多达50个创始人动物在一天内的微注射，如果它执行得当。

按照这个程序，其他方法，如滴度亲核DNA注射可以执行，以建立转基因小鼠线。不要忘记，使用扁病毒病媒需要获得您当地的转基因委员会的授权。这些病媒可能非常危险，执行此过程时应始终采取预防措施。