Si ringrazia Laura Denti, Valentina Senatore e il personale dell'unità risorse biologiche presso la UCL Institute of Ophthalmology per aiutare con allevamento del mouse e Camille Charoy per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Medical Research Council (MR/N011511/1) a C. Rührberg e un British Heart Foundation PhD studentship di J.T. Brash (FS/13/59/30649).

Tutto il lavoro animale è stato effettuato seguendo UK Home Office e le linee guida istituzionali Animal Welfare ed etici recensione corpo (AWERB).
1. preparazione Mouse
Nota: Eseguire esperimenti su topi adulti di almeno 8 settimane di età, fino a 6 mesi di età. Al fine di dimostrare la riproducibilità tecnica e tempistica coerenza per ogni passaggio di questa procedura tra animali diversi, utilizzare un minimo di 2 e massimo di 6 topi per ogni sessione sperimentale. Per valutare l'effetto di una mutazione su una sostanza che induce permeabilità in topi geneticamente modificati, idealmente, usare 2 topi mutanti e 2 littermate controlli per esperimenti.
<ol><li>24 h prima del hyperpermeability vascolare stimolante, anestetizzare topi usando un adatto inalazione anestetica come isoflurano. Utilizzare 3% isoflurane per induzione di anestesia, fino a che il riflesso di raddrizzamento e il mouse non risponde agli stimoli esterni. Utilizzare isoflurane 1.5% per la manutenzione di anestesia (assicurarsi che il mouse ha i ritmi respiratori costanti). Nell'ambito dell'anestesia, radere accuratamente entrambi i fianchi di ogni mouse con un rasoio elettrico, evitando lesioni alla pelle. Nota: L'anestesia è usata per evitare di causare stress per l'animale e ridurre al minimo il movimento durante la rasatura, che può provocare danni alla pelle.</li>
	<li>Tornare il mouse rasato alla sua gabbia a casa. Per topi maschi, luogo ogni maschio in una gabbia individuale dopo il recupero di anestesia per evitare combattimenti e, di conseguenza, danneggiare la pelle. Per topi femmina, restituirli in un gruppo di loro gabbia a casa. Nota: Se viene osservato un comportamento combattimento tra topi maschi nella gabbia, prima della procedura, separarli in gabbie individuali per 3 giorni prima dell'esperimento per consentire potenziali danni alla pelle di guarire.</li>
	<li>Monitorare i topi fino a recuperare la coscienza (di solito entro pochi secondi) e muoversi intorno alla gabbia (di solito entro 1 min).</li>
</ol>2. endovenosa di Evans Blue Dye
<ol><li>In un flusso laminare, preparare soluzioni sterili separate del maleate di pyrilamine inibitore dell'istamina (4 µ g / µ l di soluzione fisiologica allo 0,9%) e del colorante blu di Evans (1% p/v in soluzione fisiologica allo 0,9%). Sterilizzare le soluzioni di passaggio attraverso un filtro 22 µm.</li>
	<li>Utilizzare una siringa sterile da 1 mL con ago 30g per iniettare intraperitonealmente ogni mouse con 10 µ l pyrilamine maleato soluzione/grammo di peso corporeo (Figura 1A). Per eseguire la collottola prima, iniezione, il mouse e quindi inclinarlo in modo che la testa è diretto verso il suolo e l'addome è diretto verso l'alto. Iniettare nei quadranti inferiori dell'addome partire dal midline per evitare di colpire la vescica. Nota: Il peso dei topi tra 8 settimane e 6 mesi di età solitamente varia tra 15 e 30 g. Pyrilamine maleato inibisce il rilascio di istamina endogena, che altrimenti sarebbe promuovere perdita vascolare indipendentemente l'agente da testare.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una camera di calore di 37 ° C per 10 min promuovere la vasodilatazione. In alternativa, utilizzare una lampada di calore adatto focalizzata sulla coda per promuovere la vasodilatazione se è consentito l'uso di una lampada di calore dagli orientamenti etici locali.</li>
	<li>Spostare un mouse contemporaneamente a un dispositivo di ritenuta del mouse e strofinare la coda con etanolo al 70% per pulire l'area di iniezione e promuovere ulteriormente la vasodilatazione.</li>
	<li>Utilizzare una siringa sterile da 1 mL con ago 30g per amministrare 100 µ l blu di Evans per via endovenosa attraverso la vena caudale (Figura 1B). Immediatamente applicare pressione al sito di iniezione tenendo la coda tra un dito e il pollice per prevenire le emorragie. Nota: Visualizzazione della vena della coda può essere migliorata da dirigere la luce alla zona di iniezione. Ulteriori dettagli sull'esecuzione di iniezioni endovenose nella vena della coda del mouse possono essere trovato in un protocollo pubblicato18.</li>
	<li>Consentire la tintura di circolare per 30 min.</li>
</ol>3. stimolare Hyperpermeability vascolare
<ol><li>Utilizzando soluzioni sterili in un flusso laminare, diluire l'agente d'induzione permeabilità di interesse ad una concentrazione che consente la dose finale deve essere consegnato in un volume di 20 µ l. Nota: L'esperimento di esempio illustrato nella Figura 1-Figura 2, che VEGFA è usato per stimolare hyperpermeability vascolare ad una concentrazione di 2,5 ng / µ l di PBS, producendo una dose totale di 50 ng e PBS viene utilizzato come un controllo del veicolo.</li>
	<li>Caricare l'agente d'induzione permeabilità di interesse e il controllo del veicolo in separato 2 sterile 300 µ l siringhe con ago 31G. Caricare la soluzione sufficiente per iniettare ogni mouse con 20 µ l della soluzione in triplice copia (cioè preparare 60 µ l di agente e veicolo per mouse, più volume aggiuntivo per tenere conto per volume morto dell'ago).</li>
	<li>Anestetizzare il primo mouse per essere testato con isoflurano (3% per induzione di anestesia fino a che il riflesso di raddrizzamento e il mouse non risponde agli stimoli esterni e 1,5% per la manutenzione di anestesia, assicurandosi che il mouse ha i ritmi respiratori costanti).</li>
	<li>Iniettare per via intradermica 20 µ l dell'agente promotore permeabilità nel fianco del mouse (Figura 1). Assicurarsi che l'ago sia ad un angolo di 15° per la pelle. Verifica per la formazione di una bolla rialzata all'interno della pelle che indica un'iniezione di successo. Ripetere l'iniezione intradermica a 2 siti aggiuntivi, un minimo di 1 cm.</li>
	<li>Ruotare il mouse per esporre il fianco 2 e ripetere triplicate iniezioni con la soluzione di controllo veicolo. Registrare sulla carta la posizione di ogni sito di iniezione per facilitarne l'identificazione per la successiva raccolta di campioni di pelle. Nota: Maneggiare la pelle del topo con cautela in questa fase; ad esempio, evitare di pizzicare la pelle durante l'esecuzione di iniezioni intradermiche.</li>
	<li>Tornare il mouse iniettato alla sua gabbia a casa e controllare il mouse fino a quando si recupera la coscienza (di solito entro pochi secondi) e si muove intorno alla gabbia.</li>
	<li>Mentre il primo mouse recupera, immediatamente ripetere i passaggi da 3.3 e 3.5 con il mouse secondo, e così via (fino a 6 topi al massimo per ogni sessione). Tenere traccia del tempo che ogni mouse è stato iniettato per regolare l'ora in cui procedere al passaggio successivo.</li>
</ol>4. quantificazione di blu di Evans accumulati all'interno del derma
<ol><li>Abbattere ogni mouse di dislocazione cervicale 20 min dopo che ha ricevuto le iniezioni intradermiche, osservando lo stesso ordine in cui i topi sono stati iniettati. Nota: La durata di perdita vascolare può variare a seconda dell'agente d'induzione permeabilità utilizzato, e, di conseguenza, il tempo tra l'iniezione intradermica e abbattimento potrebbe essere necessario ottimizzare.</li>
	<li>Luogo ogni abbattuti del mouse sulla sua schiena e perno i piedi su una tavola di sughero avvolto con un panno pulito (Figura 1).</li>
	<li>Utilizzando le forbici smussate, praticare un'incisione verticale di circa 3-4 cm dalla parte inferiore dell'addome fino al petto di topo morto. Con un bisturi e pinze, stuzzicare via la pelle da entrambi i fianchi per rivelare il lato interno del derma e siti di accumulo di blu di Evans (Figura 1E). Appuntare giù la pelle flaccida e rimuovere il grasso dalle regioni intorno al sito di perdite con un bisturi. Se necessario, prendere una foto rappresentativa per dimostrare la grandezza di perdita di blu di Evans nella pelle.</li>
	<li>Usando un bisturi e pinze, accise regioni della pelle che comprende il colorante blu di Evans trapelato per ogni sito iniettato con l'agente d'induzione permeabilità o veicolo. Nota: fare attenzione a dimensioni simili regioni della pelle per assicurarsi che, alle successive 4.7 di passaggio, una parte simile del volume formammide sarà essere adsorbita da ogni campione di pelle, consentendo la tintura estratta da diluire in un volume simile di formammide rimanente per asportare . La mappa di iniezione registrata nel passaggio 3.5 vi aiuterà a definire l'area da essere asportata.</li>
	<li>Ogni campione viene posto in una provetta da 1,5 mL ed etichettato di conseguenza, assicurandosi che ogni campione poggia sul fondo del tubo. Conservare i campioni a - 20 ° C fino all'utilizzo ulteriore. Se l'elaborazione immediatamente, seguire la procedura riportata di seguito.</li>
	<li>Asciugare i campioni di pelle durante la notte mettendo tubi aperti in forno o nel pozzo di un blocco di riscaldamento a 55 ° C.</li>
	<li>Per estrarre il colorante blu di Evans, aggiungere 250 µ l di formamide deionizzata ai campioni in una cappa, chiudere i tubi. Assicurarsi che i campioni di pelle sono tutti coperti da formammide e incubare per una notte in un forno o un blocco di riscaldamento a 55 ° C.</li>
	<li>Centrifugare i campioni in una centrifuga da banco a massima velocità (> 10.000 x g) per 40 min.</li>
	<li>In una cappa, trasferire 100 µ l del supernatante contenente colorante da ciascun campione in un pozzo separato di una piastra a 96 pozzetti trasparente, piatto fondo (Figura 2A).</li>
	<li>Picco di misura assorbanza di blu di Evans a 620 nm con una lettura di riferimento di 740 nm in uno spettrofotometro. Nota: 620 nm è l'assorbanza del picco di blu di Evans, mentre 740 nm non è assorbito dal blu di Evans e funge da una lunghezza d'onda di riferimento.</li>
	<li>Media le letture di assorbanza delle iniezioni triplice copia dello stesso agente o veicolo per ogni mouse per rappresentare la variabilità tecnica (Figura 2B).</li>
	<li>Calcolare la differenza di piega delle letture da agente d'induzione permeabilità rispetto al controllo del veicolo (Figura 2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. 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Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi per dichiarare.

Dalla sua prima descrizione nel 195217, il dosaggio di Miles ha fornito i ricercatori con un metodo relativamente rapido, semplice e affidabile per lo studio dei meccanismi molecolari di hyperpermeability vascolare. Ad esempio, il dosaggio di Miles è stato utilizzato per testare la capacità e/o potenza di diversi agenti per indurre hyperpermeability19,20,21 o per testare l'efficacia di hyperpermeability blocco agenti8 ,22,23. Come altro esempio, gli agenti che inducono la permeabilità vascolare sono stati testati in topi geneticamente modificati ed i loro comandi littermate per determinare i requisiti di specifici recettori e proteine per hyperpermeability indotta da legante di trasduzione del segnale le risposte10,11,12,13,14,15,20,23. Diverse versioni modificate del dosaggio Miles da allora sono state usate, ad esempio per quanto riguarda il tracciante utilizzato. Così, blu di Evans è stato sostituito in alcuni studi con fluorescenza-labeled destrani di diverse dimensioni o microsfere11,13.
Il vantaggio principale del dosaggio Miles su altri saggi per studiare i meccanismi vascolari hyperpermeability è che è relativamente facile da eseguire e non richiede costose attrezzature. Inoltre, come tecnica di in vivo , questa perdita vascolare di modelli di analisi nel contesto dei vasi sanguigni intatti, al contrario di misurazione perdita attraverso in vitro dosaggi come trans bene le analisi di flusso o trans endoteliale resistenza elettrica ( Saggi TEER), che si concentrano, esclusivamente, sul monostrato endoteliale. I saggi alternativi in vivo di hyperpermeability vascolare possono differire del dosaggio di Miles qui descritto utilizzando un percorso di consegna diverso per l'agente d'induzione hyperpermeability o analizzando la perdita vascolare in siti diversi, per esempio di consegna sistemica di un agente tramite vena caudale seguita da esame di perdita vascolare nei polmoni o la trachea11,13,15. Una limitazione del dosaggio Miles è che l'iniezione intradermica di determinati agenti potrà, in linea di principio, anche influenzare la pressione sanguigna e il flusso oltre alla rottura della barriera endoteliale e, pertanto, anche indirettamente influisce sulla permeabilità vascolare. Tuttavia, questo test recentemente è stato indicato per misurare la permeabilità vascolare indotta da VEGF-A indipendentemente dagli effetti sulla pressione arteriosa sistemica15. Un'altra limitazione del dosaggio Miles è che letti vascolari in tessuti differenti possono rispondere diversamente a permeabilità-Promozione agenti e i risultati ottenuti con un dosaggio di Miles nella pelle possono, quindi, non essere rappresentante, ad esempio, di ciò che avviene nella polmone o il cervello.
Età e il peso dell'animale possono influenzare la perdita osservata nell'analisi della Miles. Per ridurre al minimo l'effetto di queste variabili, i ricercatori devono utilizzare littermates o similmente dimensioni e topi come controlli invecchiati. Quando si valutano i mutanti del topo per un particolare gene di interesse, topi devono essere generati attraverso un eterozigote contro littermates di strategia e wildtype eterozigoti allevamento utilizzati come controlli. Inoltre, si consiglia di utilizzare anestetici gas rapidamente reversibili, come isoflurano, per evitare di vasocostrizione, che è stato descritto per qualche farmaco anestetico somministrato tramite iniezioni parenterali24,25. L'iniezione di blu di Evans in vena caudale laterale del mouse è un passo fondamentale in questo protocollo e può notevolmente influenzare la qualità dei dati e esperimento. Così, i ricercatori devono essere competenti nell'esecuzione di iniezioni di vena di coda e sarà probabilmente bisogno di precedente esperienza o pratica prima di iniziare che le miglia saggio sperimentare. In alternativa, i ricercatori potrebbero utilizzare altre vie endovenosa per recapitare Evans blu, come l'iniezione di retro-orbitale se essi vengono vissuti con esso. Iniezione intradermica di permeabilità-promuovere soluzioni possono causare danni di agente indipendente per la pelle. Pertanto, iniezioni intradermiche non deve superare i 20 µ l di volume, dovrebbero sempre essere effettuate in presenza dell'inibitore dell'istamina e normalizzate a iniezioni di controllo del veicolo.
Il dosaggio di Miles è stato utilizzato da molti ricercatori per valutare componenti il VEGF-A della via di segnalazione, ad esempio, perché permeabilità vascolare indotta da VEGF-una causa di ascite nel cancro pazienti16 e visione-alterando l'edema in parecchi neovascolare occhio malattia7. Così, noi ed altri abbiamo usato l'analisi di Miles per confrontare il VEGF-A perdita vascolare indotta in topi geneticamente modificati per la mancanza di componenti specifici del VEGF-A segnalazione cascata12,13,14, 15 , 20 , 23. il nostro studio recente utilizzando questo approccio ha rivelato che l'isoforma patologica principale di VEGF-A, VEGF165, segnali attraverso un complesso di VEGFR2 e NRP1, in cui il dominio citoplasmatico di NRP1 promuove l'attivazione di chinasi-mediata di ABL di chinasi della famiglia SRC per evocare una risposta di hyperpermeability14. VEGFA, inoltre, promuove la crescita dei vasi sanguigni e potrebbe, pertanto, essere utilizzato terapeuticamente per ripristinare il flusso sanguigno ai tessuti ischemici se sue attività hyperpermeability potrebbe essere specificamente inibita. Ricerca delucidare il meccanismo molecolare che dirige il VEGF-A risposte delle cellule endoteliali vascolari verso hyperpermeability vascolare potrebbe, pertanto, individuare percorsi che possono essere manipolate in modo selettivo per inibire patologico VEGF-A ha indotto l'edema nelle malattie, come il cancro o malattia ischemica dell'occhio. Il dosaggio di Miles senza dubbio continuerà a essere un metodo utile per sostenere questi e molti altri tipi di studi funzionali per delucidare molecolari regolatori ed effettori della hyperpermeability vascolare.

La funzione primaria del sistema cardiovascolare è quello di consentire il trasferimento di gas, nutrienti e prodotti di scarto tra la circolazione e tessuti in tutti gli organi. Vasi sanguigni hanno organo-specifici livelli di permeabilità basale per consentire tali scambi1. Per esempio, i vasi sanguigni nel rene sono altamente permeabili, mentre la barriera ematoencefalica costituisce un'interfaccia altamente impenetrabile, stretto2,3,4. Le cellule endoteliali che formano il rivestimento interno dei vasi sanguigni forniscono una barriera fisica tra la circolazione e tessuti sottostanti e regolano la permeabilità vascolare in un modo di organo-specific. Tuttavia, determinati stimoli causano un crollo parziale della barriera endoteliale per aumentare lo stravaso di fluido dalla circolazione nell'interstizio sopra i livelli basali di1. Tale hyperpermeability è osservata, per esempio, ai luoghi del trauma dei tessuti, nell'infiammazione, nei tumori, durante la sepsi, in occhi con malattia neovascular o nel cervello e nel cuore, quando ischemia del tessuto si verifica a causa di un ictus o un infarto miocardico, rispettivamente 5 , 6 , 7 , 8. quando cronicamente elevati, hyperpermeability conduce all'edema, che a sua volta provoca danni ai tessuti, come la perdita della visione nell'occhio malattia9. Così, la modellazione della risposta vascolare hyperpermeability è auspicabile per la comprensione dei meccanismi che aumentano la permeabilità endoteliale e per testare l'efficacia degli agenti progettati per inibire questo.
Il dosaggio di Miles è una tecnica ben consolidata, comunemente usata e relativamente semplice che misura perdita vascolare in vivo come una misura di surrogato del hyperpermeability vascolare. Anche se essa non tener conto ad aggravare i fattori che possono aumentare la perdita vascolare indipendentemente dal regolamento barriera endoteliale, quali pressione sanguigna o flusso sanguigno, il dosaggio di Miles è generalmente pensato per fornire un metodo affidabile per valutare la permeabilità-modulazione attività di sostanze e identificare i mediatori di segnalazione che promuovono la loro attività. Di conseguenza, il dosaggio di Miles è stato parte integrante di numerosi studi che hanno identificato mediatori di hyperpermeability vascolare e dei loro meccanismi di azione10,11,12,13, 14,15, ad esempio il fattore di crescita endoteliale vascolare VEGF-A che è stato originariamente identificato come il fattore di permeabilità vascolare VPF16.
Originariamente sviluppato da miglia e miglia per studiare la permeabilità vascolare in cavie17, loro dosaggio è stato successivamente adattato all'utilizzo di topi, che sono ora l'organismo modello di scelta per delucidare i meccanismi molecolari della permeabilità vascolare regolamento a causa della loro idoneità squisita di manipolazione genetica. Brevemente, colorante blu di Evans è per via endovenosa iniettato in topi adulti e ammessi a circolare per 30 minuti (Figura 1). Agenti d'induzione permeabilità contro controllo veicolo quindi vengono iniettati per via intradermica in più siti su opposti fianchi del mouse per indurre la perdita vascolare (Figura 1). Di conseguenza, colorante blu di Evans albumina extravasates e si accumula nel derma (Figura 1). Dopo umanamente abbattimento il mouse, blu di Evans è estratta dal derma e il livello di perdita vascolare calcolato come il rapporto del test al veicolo-indotte da sostanze di densità ottica (Figura 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

La funzione primaria dell'endotelio vascolare negli organismi vertebrati è di servire come una barriera tra il sangue e ogni tessuto del corpo, per cui la permeabilità dell'endotelio a cellule del sangue, macromolecole del plasma e l'acqua può essere adattata secondo il bisogno fisiologico. In alcune malattie, citochine e fattori di crescita vengono rilasciati che mirano la barriera endoteliale per aumentare transitoriamente la permeabilità vascolare; Tuttavia, la loro presenza prolungata può causare hyperpermeability vascolare cronica e quindi danneggiano il tessuto dell'edema. Il dosaggio di Miles è una tecnica di in vivo che permette ai ricercatori di studiare hyperpermeability vascolare attraverso la misurazione di proxy di perdita vascolare. Qui, forniamo un protocollo dettagliato su come eseguire questa procedura nel topo, che è l'organismo di modello più ampiamente usato per studiare la patologia e fisiologia dei mammiferi. La procedura prevede l'iniezione endovenosa di blu di Evans per etichettare l'albumina circolante seguita da multiple iniezioni intradermiche di agenti d'induzione permeabilità e soluzioni di controllo del veicolo in opposti fianchi del mouse. Di conseguenza, colorante blu di Evans perde gradualmente nel derma, dove si accumula e può essere estratta per quantificazione come perdita indotta dall'agente d'induzione permeabilità rispetto al veicolo. Il dosaggio di Miles può essere eseguito in wild-type o geneticamente modificati modelli murini e può essere combinato con drug administration per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare e identificano gli agenti/bersagli in grado di indurre o il blocco hyperpermeability.

Abbiamo usato l'analisi di Miles per valutare la capacità del VEGF-A di indurre perdita vascolare rispetto al controllo del veicolo (PBS) in topi C57/Bl6 wildtype. Qui, indichiamo un rappresentanza esperimento utilizzando topi selvatici stimolati con l'iniezione intradermica di 20 µ l di soluzione contenente 50 ng di VEGF-A in PBS o veicolo PBS solo. Un chiaro aumento nella perdita di colorante blu di Evans in campioni di pelle iniettato con VEGF-A rispetto a PBS era apparente in situ (Figura 1E) e dopo l'estrazione del colorante in formammide (Figura 2A). Quantificazione degli esperimenti multipli illustra che 50 ng di VEGF-A induce significativamente più Evans blu perdita di PBS da solo (Figura 2B), con una media 3 volte aumentare in perdita vascolare rispetto al veicolo (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Figura 1: induzione di perdita vascolare nell'analisi della Miles. Rappresentazione schematica (pannello superiore) e immagini corrispondenti (pannello inferiore) dei passaggi sequenziali durante l'esecuzione del test di Miles nel topo. (A) Pyrilamine maleato è iniettato intraperitonealmente per impedire il rilascio di istamina endogena 10-30 minuti prima dell'iniezione endovenosa (B) di 100 µ l 1% Evans blue nella coda della vena del mouse. (C), 30 min più tardi, vascolare perdita è indotta tramite l'iniezione intradermica dell'agente (50 ng di VEGF-A; verde cerchi) contro controllo veicolo (PBS; cerchi bianchi). (D, E) Per accedere ai siti di accumulo di blu di Evans, il mouse è abbattuti 20 minuti dopo le iniezioni intradermiche e la pelle di entrambi i fianchi dissecato e appuntato giù. i.p.: intraperitoneale; i.v.: endovenosa; i.d.: intradermica; scala bar, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Figura 2: quantificazione di perdita vascolare nell'analisi della Miles. Evans (A) colorante blu viene estratta in formammide da campioni di pelle ottenuti da ogni iniezione intradermica nella Figura 1 e caricato in una piastra a 96 pozzetti per lettura con uno spettrofotometro dell'assorbanza. (B, C) Rappresentazione grafica delle letture di assorbanza da esperimenti multipli tracciando entrambi valori (B) l'assorbanza normalizzato (densità ottica, OD) di entrambi l'agente d'induzione permeabilità (VEGF-A; scuro verde cerchi) e veicolo (PBS; grigio Cerchi), o (C) modifica la piega in OD per l'agente rispetto al veicolo (barre di errore: SEM). Le letture di assorbanza della triplice copia PBS e campioni di VEGF-A mostrato in (A) sono una media e mostrate in (B, C) come cerchi bianchi o verde, rispettivamente. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Qui, presentiamo un protocollo per misurare la perdita vascolare indotta dalla somministrazione intradermica di agenti di promozione di permeabilità nella pelle murina. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la capacità delle molecole di promuovere o inibire la perdita vascolare o per studiare i meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare.

Valutazione vascolari agenti d'induzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  University College London. Qui, presentiamo un protocollo per misurare la perdita vascolare indotta dalla somministrazione intradermica di agenti di promozione di permeabilità nella pelle murina. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la capacità delle molecole di promuovere o inibire la perdita vascolare o per studiare i meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare.

Video: Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction.  (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).

As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns.

Costruzione e l&#39;impianto di un sistema Microinfusion sostenuta per l&#39;erogazione degli agenti neuroattivi.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Ricerca

Biologia

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenica saggio: cellule aderenti

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood supply. The capillary lamina of the choroid lines the outer surface of the retina and is the dominating source of oxygen in most vertebrate retinas. However, this vascular bed is challenging to image with traditional optical techniques due to its position behind the highly light-absorbing retina. Here we describe a high-frequency ultrasound technique with subsequent flow-enhancement to image deep vascular beds (0.5-3 cm) of the eye with a high spatiotemporal resolution. This non-invasive method works well in species with nucleated red blood cells (non-mammalian and fetal animal models). It allows for the generation of non-invasive three-dimensional angiographies without the use of contrast agents, and it is independent of blood flow angles with a higher sensitivity than Doppler-based ultrasound imaging techniques.

We present a non-invasive ultrasound technique for generating three-dimensional angiographies in the eye without the use of contrast agents.

Imaging vascolare profondo nell'occhio con ultrasuoni ottimizzati per il flusso

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Applicazione del movimento passivo della testa per generare accelerazioni definite alle teste dei roditori

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolamento di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali per studi elettrofisiologici

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...