È necessario un protocollo molto rigoroso in modo da poter confrontare validamente i preparati degli stessi animali o di diversi animali o arterie in presenza o assenza del grasso che li circonda o in presenza o assenza dell'endotelio. Il vantaggio principale di questa tecnica sperimentale è che possiamo confrontare anelli della stessa arteria in condizioni isometriche e quindi trarre validamente conclusioni sull'impatto dei fattori sperimentali che studiamo. Questo protocollo fornisce approfondimenti sulla modulazione della reattività vascolare da parte dei tessuti adiposi perivascolari di diversi animali geneticamente modificati.
Le disfunzioni del tessuto adiposo rappresentano un fattore di rischio indipendente per l'ipertensione e le relative complicanze cardiovascolari. Il nostro miografo prevede più passaggi complicati che richiedono estrema cautela in ogni punto per evitare di danneggiare la nave, specialmente durante il montaggio, e per garantire che la nave risponda in modo appropriato a vari stimoli. Iniziare questa procedura con i preparativi e la dissezione degli anelli arteriosi mesenterici come descritto nel protocollo di testo.
Accendere il computer e aprire il software di registrazione dati. Salvare l'esperimento come file di dati del grafico lab con un nuovo nome per evitare di sovrascrivere il file di impostazione originale. Aprire la finestra delle impostazioni di normalizzazione e impostare il fattore K su uno.
Accettare i valori predefiniti per la calibrazione degli IP, la pressione di destinazione, il tempo medio online e il tempo di ritardo. Fare clic su OK per salvare le impostazioni. Selezionare i canali di interesse e inserire il diametro del filo, i punti finali dei tessuti e la lettura iniziale del micrometro nella finestra di normalizzazione.
Per avviare la procedura di normalizzazione, applicare il primo tratto passivo al vaso sanguigno ruotando la vite del micrometro in senso antiorario. Dopo aver atteso tre minuti per la stabilizzazione della nave, inserire la nuova lettura del micrometro nella finestra di normalizzazione. La tensione della parete viene calcolata automaticamente e visualizzata come punto sul grafico.
Dopo ogni allungamento passivo, sostituire il tampone krebs di controllo con un krebs iso-osmotico ad alto potassio contenente 150 cloruro di potassio millimolare. Quando la contrazione raggiunge un plateau a circa tre minuti, registrare la forza attiva sottraendo la forza passiva ad ogni tratto dalla forza attivata dal potassio. Calcola la tensione della parete e i valori di circonferenza interna.
Rimuovere l'elevata condizione di potassio sostituendo l'alto tampone di potassio con un tampone di krebs fresco. Ripetere il lavaggio per tre volte più di cinque minuti. Ripetere i passaggi di normalizzazione inducendo tratti passivi seguiti da contrazione attiva in curve alternative fino a quando la tensione attiva inizia a diminuire.
Lavare accuratamente l'alto tampone di krebs di potassio ed equilibrare i preparati per altri 30-45 minuti. Reimpostare le tensioni basali a zero in modo che durante l'esperimento successivo venga registrata solo le risposte a contrattili attive. Preparare e montare anelli arteriosi accoppiati come descritto nel protocollo di testo dalle sezioni adiacenti di ogni arteria.
Preparare un anello arterioso con PVAT intatto e l'altro con PVAT rimosso. Dopo la normalizzazione, precontrattuare i segmenti arteriosi con tampone di krebs ad alto potassio aggiungendo 115 millimolare soluzione di cloruro di potassio alla camera contenente krebs. Dopo la contrazione al periodo dell'altopiano, lavare l'alto potassio e sostituire il tampone con un tampone di krebs fresco aerato.
Ripetere il lavaggio tre volte in cinque minuti. Ripetere la stimolazione e il lavaggio del cloruro di potassio tre volte e registrare la massima risposta contrattile al cloruro di potassio sottraendo la tensione di base dalla tensione dovuta alla stimolazione del cloruro di potassio. Dopo l'ultima contrazione e lavaggio, riempire la camera con tampone di krebs caldo e aerato e lasciare che l'arteria si riprenda per circa 30 minuti prima di eseguire l'attività successiva.
Ad ogni camera, aggiungere quantità cumulative di fenilefrina per indurre gli aumenti dipendenti dalla concentrazione e la tensione isometrica dei preparati quiescenti. Dopo aver aggiunto l'ultima dose di agonista, lavare accuratamente il farmaco e riempire la camera con un tampone di krebs fresco. Tracciare le risposte dipendenti dalla concentrazione come percentuali crescenti delle contrazioni massime indotte dal cloruro di potassio.
Per valutare il contributo dell'ossido nitrico, incubare i preparati con l'inibitore dell'ossido nitrico sintasi L-NAME per 30 minuti prima dell'aggiunta di fenilefrina. Per eseguire una seconda curva di risposta alla concentrazione in sequenza, lavare la camera completamente e ripetutamente per rimuovere tutti gli agonisti precedenti fino a quando non si osservano ulteriori cambiamenti di tono. La normalizzazione della relazione lunghezza-tensione è stata eseguita per le arterie mesenteriche isolate dai modelli di topi alimentati con chow standard o una dieta ricca di grassi.
Una relazione passiva lunghezza-tensione è stata stabilita dallo stiramento incrementale dei segmenti dell'arteria fino a ottenere una circonferenza interna corrispondente a 100 millimetri di pressione transmurale di mercurio, o IC100. Dopo ogni tratto, è stato applicato 115 cloruro di potassio millimolare per stimolare le contrazioni. Le curve di tensione della lunghezza attiva sono state tracciate dai dati di forza attiva sull'asse Y e dai valori IC calcolati dai dati del micrometro sull'asse X.
Un valore IC che si trova all'interno dell'altopiano di picco è IC1. Il fattore di normalizzazione, K, è stato calcolato come rapporto tra IC1 e IC100, che potrebbe quindi essere applicato a campioni dello stesso tipo di recipiente nell'esperimento successivo. Di seguito sono riportate le registrazioni in uscita delle risposte vasocostrittore alla fenilefrina nelle arterie mesenteriche con o senza PVAT circostante.
Concentrazioni cumulative di fenilefrina sono state applicate per stimolare le contrazioni delle arterie mesenteriche raccolte da un topo adiposet di 16 settimane fa. Le risposte contrattili sono state registrate e calcolate in percentuale della contrazione massima indotta da cloruro di potassio millimolare. L'area sotto le curve di contrazione è stata tracciata per il confronto.
Si noti che il PVAT dell'adiposet di un topo ha suscitato un effetto anti-contrattile sulla risposta alla fenilefrina. Quando si ottengono contrazioni indotte da KCL, le risposte devono essere stabili e stabili. Se la risposta è ancora in aumento dopo tre amministrazioni incrementali di KCL, potrebbe essere necessaria la stimolazione KCL.
Per ottenere condizioni ottimali delle tensioni, la fase di normalizzazione è molto importante, in quanto determina la forza per aprire i vasi sanguigni. Se non viene fatto correttamente, influenzerà l'intero esperimento. Questo protocollo può essere applicato ad altre impostazioni oltre alla contrazione o al rilassamento indotti dalla fenilefrina.
Ad esempio, in presenza o assenza di tessuto adiposo perivascolare, nervi autonomici o endotelio. Con questo protocollo, i ricercatori possono esaminare piccoli vasi sanguigni da modelli animali masi in diverse condizioni fisiopatiche, come obesità, diabete e malattie cardiovascolari.
