Questo lavoro è stato supportato da fondi di avvio dall'Università del Nevada, Reno e da NIGMS del National Institute of Health, sotto concessione numero P20 GM103650.

1. costruire un Arena di comportamento e preparazione Hardware per abilitare optogenetica stimolazione in ambito di comportamento
<ol><li>Per costruire un arena di comportamento luce-sfavoriti, costruire una scatola con una dimensione di 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24" W x 26" H) fatta di lastre acriliche in plexiglass colorato nero (3 mm di spessore) (Vedi Tabella materiali). Materiali per costruire tale scatola dovrebbero essere disponibile presso negozi di ferramenta locale. Posizionare la scatola su un tavolo nella sala comportamento (Figura 1A).</li>
	<li>Montare una telecamera monocromatica USB 3.0 CCD dotata di un filtro di IR lungo-passa 830 nm e una lente f 1.4 C-mount di 8 mm (Vedi Tabella materiali) al centro del soffitto della scatola nera. Posto due infrarossi LED strisce (Vedi Tabella materiali) sul piano del tavolo per illuminare le larve nell'arena scuro (Figura 1A).</li>
	<li>Per creare la piattaforma di LED, ottenere una lastra di alluminio quadrata 22 cm × 22 cm (preferibilmente spruzzo verniciato con una finitura nera opaca per eliminare eventuali riflessi). Al centro del piatto, utilizzando un coltello di metallo, tagliare un buco abbastanza grande per adattarsi intorno la telecamera CCD.</li>
	<li>Coprire la piastra metallica con luci di striscia di LED rosso (Vedi Tabella materiali). Saldare fili di luce di striscia di LED in serie e passare i cavi di striscia in un fotoaccoppiatore relè controllato da un microprocessore di 2B Raspberry Pi (Vedi Tabella materiali) (Figura 1B e 2).</li>
	<li>Installare e configurare il sistema operativo Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux basato sul processore Raspberry Pi prima di collegare il relè opto per le strisce di LED. Collegare un alimentatore per alimentare le strisce di LED e l'optoisolatore (Figura 2) (Vedi Tabella materiali). Montare la piattaforma LED intorno alla telecamera CCD (Figura 1B). Nota: Ubuntu Mate v16.04 sistema operativo è liberamente disponibile. Una serie di semplici comandi basato su Python può essere facilmente adattata ai modelli di programma di stimoli luminosi LED (vedere file di sintassi).</li>
	<li>Garantire irraggiamento omogeneo nei vari punti all'arena di comportamento. Misurare l'irradianza assoluta presso la superficie dell'arena con l'aiuto di uno spettrometro e determinare che sia ~1.3 W/m2 su tutta la superficie dell'arena. Nota: A questa intensità, senza i cambiamenti significativi sono stati osservati di temperatura nel corso degli esperimenti. Un altro studio10 utilizzato un maggiore irraggiamento di ~1.9 W/m2 e non osservato nessun cambiamento nella temperatura nel corso degli esperimenti.</li>
</ol>2. preparazione di larve di Drosophila per analisi di comportamento
<ol><li>Mantenere le mosche sul cibo vola standard (Vedi Tabella materiali) a 25 ° C, 50-60% RH e un ciclo luce/buio di 12 h/12 h.</li>
	<li>
Al fine di esprimere CsChrimson in una singola coppia di ORNs, attraversare le femmine vergini da una linea UAS-IVS-CsChrimson ai maschi da una linea di OrX-Gal4 ('X' corrisponde a uno dei 21 del ricevitore di odore larvale (o) geni che sono espressi in modo univoco in ogni 21 paia di ORNs)9,11.
	<ol>
<li>In alternativa, per esprimere CsChrimson in tutti i 21 ORNs larvale, attraversare le femmine vergini da un UAS-IVS-CsChrimson linea ai maschi da una linea di Orco-Gal4 ('Orco' è il co-recettore che si esprime in tutti i 21 ORNs).</li>
		<li>Utilizzare UAS-IVS-CsChrimson linea di per sé come un controllo in questi esperimenti. Nota: Le scorte volare qui elencate sono tutti disponibili presso il centro di Stock di Drosophila Bloomington (Vedi Tabella materiali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Una volta mosche maschii e femminili in una croce sono ammessi per accoppiarsi e deporre le uova per 48 h, trasferire gli adulti ad un flacone di fresco.
	<ol>
<li>Alla superficie del flaconcino cibo contenente le uova, aggiungere 400 µ l di una miscela contenente 400 µM all-trans retinico (ATR) dissolto in dimetilsolfossido (DMSO) e saccarosio 89mm disciolto in acqua distillata. Nota: La piccola quantità di saccarosio promuove alimentazione larvale della soluzione ATR. ATR è un cofattore necessario per aumentare di CsChrimson espressione9,10. ATR è sensibile alla luce.</li>
		<li>Una volta ATR è aggiunto le fiale di alimenti contenenti uova, incubare i flaconi al buio per 72 h. Nota: Mentre questo studio e sopra due studi non hanno osservato gli effetti sul comportamento larvale dovuta ATR alimentazione, si consiglia di controllare per gli effetti dell'ATR alimentazione sottoponendo le linee di test per la stessa quantità di miscela di cui sopra che non contengono ATR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre le larve di terza-instar (~ 120 h dopo la deposizione delle uova) dalla superficie dell'alimento facendo galleggiare utilizzando una soluzione di saccarosio ad alta densità (15%). Utilizzando un P1000 micropipetta separare le larve galleggiano sulla superficie della soluzione di saccarosio in un becher di vetro da 1000 mL.</li>
	<li>Lavare le larve 3 – 4 volte scambiando 800 mL di acqua distillata di fresco in bicchiere di vetro ogni volta. Consentire le larve di riposare per 10 min prima di sottoporli a test comportamento.</li>
</ol>3. comportamento saggio
<ol><li>Mantenere costante la temperatura (tra 22 – 25 ° C) e umidità (tra 50 e 60% RH) nel comportamento locale.</li>
	<li>
Preparare larvale supporto strisciante di versare 150 mL di agarosio fuso (1,5%) in un quadrato di 22 x 22 cm di Petri. Una capsula di Petri è versato per ogni prova del test, prove di 8 – 10 per esperimento. Consentire l'agarosio solidificare e raffreddare per 1 – 2 h nei piatti Petri prima del loro utilizzo nell'analisi di comportamento.
	<ol>
<li>Trasferire non più di 20 delle larve di terza-instar preparate per il centro di Petri piatto (Figura 1C). Coprire il piatto di Petri con il suo coperchio. Posizionare la piastra di Petri nell'arena comportamento sotto la telecamera CCD. Nota: A seconda dell'esperimento, comportamento analisi vengono effettuate in genere per 3 – 5 min. Se un odorant viene utilizzato nell'analisi per fornire spunti di orientamento, è stato osservato che la pendenza risultante di odore rimane stabile per circa 5 min1. Tempi più lunghi di dosaggio non sono raccomandati. Non sono stati osservati effetti deleteri sulle larve a causa di disidratazione o da una prolungata esposizione di luce rossa 630 nm all'interno di questi intervalli di tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girare ON the 850 nm infrarossi sorgente luminosa LED per visualizzare le larve nel video. Avviare la fotocamera CCD per registrare il movimento larvale.</li>
	<li>Utilizzando il software associato al processore di Raspberry Pi, programma la procedura per l'amministrazione di modelli appropriati di stimolazione di luce rossa. Nota: Una serie di semplici comandi basato su Python può essere facilmente adattata ai modelli di programma di stimoli luminosi LED (vedere file di sintassi).</li>
</ol>4. elaborazione dei dati e analisi
<ol><li>Importare i video registrati di ogni prova in qualsiasi software di programmazione disponibile come Matlab.</li>
	<li>Ottenere le coordinate XY di ogni larva in un film come funzione del tempo. Basato su limiti del software di monitoraggio, 15 – 20 terza-instar larve possono essere monitorate in un unico filmato1,8. Nota: Viene fornito un set di semplici codici Matlab ('Tracklarva') che può essere facilmente adattato per soddisfare le condizioni appropriate (vedere file di sintassi). Questo programma combina tutte le prove in un esperimento e uscite le coordinate XY di ogni larva per tutta la durata del test (Vedi la sintassi del codice qui sotto). In alternativa, uno può usare diversi programmi basati su open source che sono liberamente disponibili per i ricercatori. Ad es. JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.</li>
	<li>
Utilizzare le coordinate XY generate per tracciare traiettorie larvale e analizzare ulteriormente locomozione larvale.
	<ol>
<li>Per analisi di comportamento, è possibile utilizzare le statistiche navigazione quali velocità, percorso della curvatura, angolo di intestazione, per segmentare individuali larvale traiettorie in alternando sequenze di piste e si trasforma.</li>
		<li>Funzionamenti sono definiti come periodi continui di movimento in avanti. Turni separano esecuzioni successive. Giri vengono contrassegnati quando cambiamenti agli angoli di orientamento traiettoria erano > 45° (vedere file di sintassi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare i valori medi di velocità di esecuzione, esecuzione lunghezza, direzione e altri parametri come richiesto. Nota: Viene fornito un set di sintassi semplice per estrarre 'corre' e 'si ferma' da larvale traiettorie (vedere file di sintassi). Semplice Matlab o Excel funzioni base possono essere applicate ai dati estratti per calcolare valori per 'velocità', 'Esegui lunghezza' ecc.</li>
	<li>Rappresentare i dati per ogni metrica comportamentale come media ± SEM</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mathew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+among+sensory+receptors+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).</li><li>Ramaekers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+maps+without+cellular+redundancy+at+successive+levels+of+the+Drosophila+larval+olfactory+circuit.">Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit.</a> Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).</li><li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular,+anatomical,+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system.">Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+larva.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva.</a> Neuron. 46, 445-456 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+sensory+input+into+behavioral+output+via+an+olfactory+system.">Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system.</a> Neuron. 59, 110-124 (2008).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li><li>Monte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+larval+olfactory+response+in+Drosophila+and+its+genetic+basis.">Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis.</a> Behav Genet. 19, 267-283 (1989).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature methods. 9, 290-296 (2012).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-correlation+analysis+of+navigation+dynamics+in+Drosophila+larva+using+optogenetics.">Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAABA:+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior.">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature methods. 10, 64-67 (2013).</li><li>Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contributions+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit.</a> eNeuro. 3, (2016).</li><li>Schulze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+feature+extraction+at+the+sensory+periphery+guides+chemotaxis.">Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Tastekin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Subesophageal+Zone+in+Sensorimotor+Control+of+Orientation+in+Drosophila+Larva.">Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva.</a> Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).</li><li>Famiglietti, E. V., Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ON-and+OFF-center+responses+in+retinal+ganglion+cells.">Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells.</a> Science. 194, 193-195 (1976).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans+is+mediated+by+distinct+sensorimotor+strategies+driven+by+the+AFD+thermosensory+neurons.">Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).</li><li>Berck, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wiring+diagram+of+a+glomerular+olfactory+system.">The wiring diagram of a glomerular olfactory system.</a> eLife. 5, (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, abbiamo descritto un metodo che consente la misurazione di Drosophila comportamento larvale in risposta all'attivazione di optogenetica simultanea dei neuroni olfattivi. Precedentemente descritto larvale metodi1,di rilevamento8 utilizzano la tecnologia di consegna di odore diverso per attivare ORNs. Tuttavia, questi metodi non possono controllare per la specificità o un pattern temporale di attivazione ORN. Il nostro metodo supera questi deficit utilizzando stimoli leggeri invece di stimoli di odore per un controllo più preciso dell'attivazione ORN.
I materiali necessari per costruire l'arena di comportamento possono essere facilmente ottenuti presso il negozio di ferramenta locale e richiede un minimo sforzo all'Assemblea. L'elettronica necessaria per preparare il modulo optogenetica è facilmente disponibili e costruito. Il metodo descritto qui utilizza luce rossa per attivare una rodopsina canale rosso-spostato (CsChrimson) espresso nei neuroni specifici. Il comportamento risultante larvale in risposta all'attivazione di ORN corrispondente viene registrato utilizzando una telecamera CCD e misurato usando software scritto personalizzato fornito qui. Il nostro metodo permette ai ricercatori di chiedere risposte a molte domande che non erano possibili prima di: 1) Qual è l'impatto dei modelli differenti di stimolo olfattivo sulla capacità dell'animale di navigare verso un odore? 2) simile a ON-center e cellule gangliari OFF-center in retina mammifera16, ci sono ORNs che rispondere specificatamente ad una diminuzione in stimoli olfattivi oltre a ORNs che rispondono ad un aumento di stimoli olfattivi? Infine, il nostro metodo permette una varietà di applicazioni future, compresa la misurazione dell'impatto dei neuroni a valle del circuito olfattivo (PNs e LNs) di navigazione larvale.
Mentre ci sono diversi vantaggi al nostro metodo, riconosciamo alcune limitazioni. Non è chiaro se gli effetti di concentrazione osservati con odoranti possono essere facilmente replicati utilizzando questo sistema. Mentre la nostra impostazione attuale non consente questo, il modulo di optogenetica potrebbe essere facilmente modificato per ospitare aumenta o diminuisce l'intensità dello stimolo luminoso. In futuro, controlleremo per vedere se cambia intensità di stimolo luminoso imita gli effetti di concentrazione di odorizzazione. Tecniche genetiche volare semplice utilizzabile per esprimere CsChrimson in entrambi tutte le 21 coppie di ORNs (utilizzando Orco-Gal4) o in una singola coppia di ORNs (utilizzando singoli o-Gal4s). Tuttavia, complicata genetica sarebbe stato necessario esprimere CsChrimson in 1 < n < 21' neuroni. A causa di questo, sarebbe difficile da replicare gli effetti osservati con miscele di odore dove i singoli componenti della miscela suscitano le risposte da più di un ORN. Anche se il comportamento di navigazione larvale è considerato un comportamento dimensionale basso, riconosciamo che il nostro programma di rilevamento larvale potrebbe essere ulteriormente migliorata in futuro prendendo in considerazione ulteriori descrittori del comportamento basati sulla postura degli animali (per esempio. probabilità di testa gira, corpo curve ecc)8,17. Il nostro studio era limitata ai neuroni sensitivi di primo ordine nella larva. L'indagine successiva è necessaria prima che il nostro metodo può essere applicato ai neuroni di proiezione secondo ordine e neuroni locali che sono incorporati nella regione del lobo del cervello del cervello18.
In sintesi, il nostro metodo offre la possibilità di sezionare la funzione di ogni ORN nel circuito semplice, gestibile olfattivo della larva della drosofila . Così facendo, il nostro metodo consentirà lo sviluppo di modelli computazionali più precisi che descrivono come odore segnali vengono convertiti in diverse uscite comportamentale.

Informazioni olfattive in ambiente di una larva di Drosophila sono percepite dal solo 21 ORNs funzionalmente distinte, le attività di cui in definitiva determinare comportamento larvale1,2,3,4. Ancora, relativamente piccolo è conosciuto circa la logica con cui informazioni sensoriali sono codificate nelle attività di questi 21 ORNs. C'è quindi la necessità di misurare sperimentalmente i contributi funzionali di ogni ORN larvale di comportamento.
Anche se il profilo di risposta sensoriale di tutto il repertorio di Drosophila larvale ORNs è stato studiato in dettaglio1,4,5, i contributi dei singoli ORNs al circuito olfattivo e quindi a comportamento di navigazione rimangono in gran parte sconosciuti. Difficoltà negli studi di comportamento larvale, finora, a causa dell'incapacità spazialmente e temporalmente attivare singole ORNs. Un pannello di odorizzazione che specificamente attivare 19 del 21 ORNs larvale di Drosophila è stata recentemente descritta1. Ogni odorant nel pannello, a basse concentrazioni, suscita una risposta fisiologica solo da sue cognate ORN. Tuttavia, a concentrazioni più elevate che sono normalmente utilizzati per le analisi di comportamento convenzionale, ogni odorant suscita risposte fisiologiche da più ORNs1,5,6. Ulteriormente, odoranti in questo pannello hanno variato le volatilità che complicano l'interpretazione degli studi di comportamento che dipendono dalla formazione di odore stabile pendenze7,8. Infine, gli stimoli d'avvenimento di odore hanno naturalmente un componente temporale che è difficile da replicare in condizioni di laboratorio. Pertanto è importante sviluppare un metodo che può misurare il comportamento larvale durante l'attivazione simultanea di ORNs individuali in modo spaziale e temporale.
Qui, dimostriamo che un metodo che presenta i vantaggi sopra precedentemente descritto rilevamento larvale dosaggi1,8. L'analisi di rilevamento descritto in Gershow et al. utilizza valvole controllate elettronicamente per mantenere un gradiente stabile di odore nel comportamento arena8. Tuttavia, a causa del livello di ingegneria complesso coinvolto costruire il setup di stimolo di odore, questo metodo è difficile da replicare in altri laboratori. Ulteriormente, i problemi relazionati all'utilizzo odoranti specificamente attivare singole ORNs rimangono irrisolti. L'analisi di rilevamento descritto in Mathew et al. utilizza un sistema di consegna di odore più semplice, ma la pendenza risultante di odore è dipenda dalla volatilità dei test odorant ed è instabile per lunghi periodi di analisi1. Così, sostituendo gli stimoli odore con stimoli leggeri, il nostro metodo ha i vantaggi della specificità e preciso controllo temporale di attivazione ORN e non è dipendente da formazione di gradienti di odore di diversi punti di forza.
Il nostro metodo è facile da configurare ed è adatto per i ricercatori interessati a misurare gli aspetti della navigazione larvale della drosofila . Questa tecnica potrebbe essere adattata ad altri sistemi di modello purché il ricercatore è in grado di guidare l'espressione di CsChrimson in neuron(s) del loro sistema preferito di scelta. CsChrimson è una versione del rhodopsin canale rosso-spostato. Si attiva a lunghezze d'onda che è invisibili al sistema fototassi di larva. Siamo quindi in grado di manipolare l'attività dei neuroni con specificità, affidabilità e riproducibilità9. Modificando l'usanza scritto software per tenere conto di modifiche delle dimensioni degli oggetti, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per la ricerca per indicizzazione larve di altre specie di insetti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:925px;" width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Video camera to capture larval movement</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CCD Camera&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:208px;">106215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">M52 to M55 Filter Thread Adapter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">2&#34; Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RG-715, 2&#34; Sq. Longpass Filter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>46-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Electronics for optogenetic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Raspberry Pi 2B</td>
			<td>RASPBERRY-PI.org</td>
			<td>RPI2-MODB-V1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">3 Channel programmable power supply</td>
			<td>newegg.com</td>
			<td>9SIA3C62037092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">8 Channel optocoupler relay</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>6454319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">630nm Quad-row LED strip lights</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>red3528-450-reel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">850nm LED strips</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>wp-4000K-CC5050-60x2-kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Ubuntu MATE v16.04</td>
			<td>Nubuntu</td>
			<td>https://github.com/yslo/nubuntu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Other items</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Plexiglass black acrylic</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td style="width:208px;">MC1184848bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fly food and other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Nutrifly fly food</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>66-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Agarose powder</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>20-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">22cm X 22cm square petri-dish</td>
			<td style="width:296px;">VWR Inc.</td>
			<td>25382-327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">All trans-retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UAS-IVS-CsChrimson&#160;</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>55134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Orco-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>26818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or42a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>9970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or7a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>23907</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drosophila larval behavior in response to optogenetic stimulation of olfactory neurons

La capacità degli insetti di navigare verso le fonti di odore si basa sulle attività del loro primo ordine neuroni olfattivi (ORNs). Mentre una notevole quantità di informazioni è stata generata per quanto riguarda ORN risposte a odoranti, il ruolo di specifici ORNs in risposte comportamentali di guida rimane capito male. Complicanze nelle analisi di comportamento derivano a causa della diversa volatilità di odorizzazione che attivano ORNs singole, multiple ORNs attivato dal singolo odoranti e la difficoltà nella replica naturalmente osservate variazioni temporali in stimoli olfattivi utilizzando metodi convenzionali odore-consegna in laboratorio. Qui, descriviamo un protocollo che analizza il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica di sua ORNs. La tecnologia optogenetica qui permette per la specificità di attivazione ORN e un controllo preciso del pattern temporale di attivazione ORN. Corrispondente movimento larvale viene tenuta traccia, digitalmente registrati e analizzati utilizzando scritta software personalizzata. Sostituendo gli stimoli odore con stimoli leggeri, questo metodo consente un controllo più preciso di attivazione ORN individuale al fine di studiare il suo impatto sul comportamento larvale. Il nostro metodo potrebbe essere esteso a studiare l'impatto dei neuroni di proiezione di secondo ordine (PNs) così come i neuroni locali (LNs) sul comportamento larvale. Questo metodo permetterà dunque una dissezione completa della funzione olfattiva circuito e complemento studi sulle attività del neurone olfattivo come traducono risposte di comportamento.

Per illustrare la specificità di attivazione ORN, il nostro metodo è stato applicato con successo per determinare l'impatto di due differenti ORN (ORN::7a & ORN::42a) (ORNs che esprimono Or7a o Or42a) attivazione sul comportamento larvale (Figura 3). Coerente con gli studi recenti di quell'individuo ORNs larvale sono funzionalmente distinte1,10,13, nostri dati rappresentativi dimostrano che quando ORN::7a esprimendo la CsChrimson è stata stimolata dalla luce, c'era un diminuzione significativa nella lunghezza di esecuzione rispetto agli animali di controllo. Al contrario, quando ORN::42a esprimendo la CsChrimson è stata stimolata dalla luce, c'era un significativo aumento in lunghezza di esecuzione rispetto agli animali di controllo (Figura 3). I dati collettivi analizzati da ~ 100-120 tracce larvali sono state ottenute da (n = 8) prove eseguite per ciascun genotipo. Le barre di errore rappresentano SEM Mentre Descriviamo qui solo un parametro di comportamento singolo (lunghezza di esecuzione), notiamo che ogni traccia larvale può essere ulteriormente analizzato per calcolare i parametri di velocità, curvatura del percorso, e il corpo si piega1,8,13, 14,15. Parametri più legate alla direzionalità come angolo di intestazione, eseguire lunghezza ed eseguire velocità verso e lontano da odori possono essere ottenuti se una fonte di odore è fornito su un lato dell'arena1,8,13.
Per dimostrare le capacità del nostro metodo di alterare il pattern temporale di attivazione ORN, abbiamo variato il nostro stimolo per alternare tra le luci e spegnendo. Abbiamo sottoposto le larve esprimendo UAS -CsChrimson in ORN::42a a tre differenti schemi temporali di stimoli luminosi durante il periodo di ON luci (0,04 Hz, 1Hz e costante). Quindi abbiamo misurato i cambiamenti nei parametri comportamentali che si verificano durante la fase di luci OFF → ON e durante luci su fase OFF →. Abbiamo trovato che per ORN::42a, diversi schemi temporali di stimolazione luminosa ha suscitato diverse risposte comportamentali (Figura 4). Tali modifiche non sono state osservate nelle larve di controllo che non esprimono UAS-CsChrimson in qualsiasi ORNs. Questi risultati di evidenziare l'importanza di comprendere schemi come temporali di attivazione ORN contribuiscono al comportamento animale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig1.jpg"> Figura 1 : Comportamento arena e larvale medio strisciante. (A) vista dell'arena comportamento scatola nera frontale. La porta aperta dell'arena rivela una fotocamera CCD appesa al soffitto della scatola. (B) vista dal basso di una piattaforma di metallo contenente strisce della luce del LED rossi usati per stimolazioni optogenetica è montato intorno alla telecamera CCD. Vista del mezzo strisciante larvale usato nell'analisi superiore (C) . Prima dell'inizio della registrazione movimento larvale, ~ 20 lavato le larve vengono deposte lungo il centro di un 22 x 22 cm di Petri a strati con 1,5% di agarosio. La capsula di Petri contenente larve è posto al centro dell'arena sotto la telecamera CCD e tra due strisce luce infrarossi LED che vengono utilizzati come una fonte di luce per la fotocamera. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig2.jpg"> Figura 2 : Installazione optogenetica. Un'infografica che mostra la disposizione elettronica per l'installazione di optogenetica. Brevemente, luce del LED (630 nm) strisce sono collegati in serie e fili dalle strisce vengono introdotti in un accoppiatore ottico collegato ad un microprocessore di 2B PI lampone. Sia le strisce della luce del LED e il fotoaccoppiatore sono alimentati da un alimentatore. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig3.jpg"> Figura 3 : Impatto di fotoattivazione di ORNs individuali sul comportamento larvale. Lunghezza di esecuzione delle larve esprimendo la CsChrimson in ORN::7a e ORN::42a sono stati colpiti in modo diverso rispetto per controllare le larve al momento dell'attivazione luce. Ogni barra rappresenta RI media ± SEM (n = 8). Lunghezza di esecuzione delle larve quando ORN::7a è stato attivato era significativamente più basso di controllo. Lunghezza di esecuzione delle larve quando ORN::42a è stato attivato era significativamente superiore di controllo. Barre rappresentano la media ± SEM (n = 8, test t di Student; "*" è p < 0.05, "* *" è p < 0,001). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig4.jpg"> Figura 4 : Impatto di diversi schemi temporali di attivazione ORN sul comportamento larvale. (A) tre schemi temporali degli stimoli utilizzati per l'attivazione ORNs. R: stimolo 1 min costante luce durante la stimolazione leggera stimolazione luminosa di stimolo c: 1 Hz durante periodo di LED ON in minuto 2 stimolo b: 0,04 Hz. (B) le larve sono stati sottoposti a tre diversi modelli di stimoli luminosi descritti A. Ogni punto rappresenta il cambiamento nel comportamento larvale, sotto ogni pattern di stimoli luminosi, quando attivazione luce passa da ON a OFF. Cambiare 'Esegui lunghezza' (AV. eseguire lunghezza (OFF) - AV. eseguire lunghezza (ON)) viene tracciata sull'asse x. Cambiare 'Esegui velocità' (AV. eseguire velocità (OFF) - AV. eseguire speed (ON)) viene tracciata sull'asse y. Il grafico a sinistro (punti grigi) rappresenta misure da larve di controllo e il grafico a destro (punti rossi) rappresenta misure da larve esprimendo la CsChrimson in ORN::42a. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Final Code PDF" src="/files/ftp_upload/57353/57353code.jpg"> File supplementare di sintassi: un insieme di semplici codici Matlab ('Tracklarva') che può essere facilmente adattato alle diverse condizioni appropriate. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/Final_Code.pdf" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Monitoraggio del comportamento larvale della Drosophila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi | Neuroscienze | Video

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

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7.2K Views.  University of Nevada. Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.

Video: Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Stimolazione optogenetic del nervo uditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...