Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dalla nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziata dal governo della Corea (MSIP; grant n. 2016R1A2B4008199 a Y-M. H.) e il Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI14C1324).

Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida istituzionali Animal Care e uso Comitato di Yonsei University College of Medicine, Corea. Proteina fluorescente LysM-verde (GFP; gfp / +) topi8 e CX3Cr1-GFP (gfp / +) topi9 a 8-12 settimane di età sono stati usati per l'imaging di videomicroscopia. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati nell'autoclave e disinfettato con alcol al 70%.
1. custom-designed mouse fegato imaging camera con strumenti di supporto
<ol><li>Fegato di topo imaging della camera di<ol>
<li>Fare un alloggiamento delle seguenti dimensioni per fegato di topo di immagine (Figura 1): camera interna (lunghezza × larghezza 160 mm × 30 mm altezza di 120mm), alloggiamento esterno (100 mm lunghezza × larghezza 100 mm × 24 mm altezza), bulloni (Ф 3 × 30 mm di altezza), noci (Ф 4 mm) e i dadi a forma di ala (Ф 4 mm).</li>
		<li>Misurare l'agente indurente ed elastomero base in rapporto 1:9 per fare un totale di 120 g di silicone.</li>
		<li>Mettere il composto di silicone liquido in una beuta da 250 mL e mescolare bene. Quindi mettere il pallone in un essiccatore e rimuovere le bolle d'aria per circa 1 h sotto vuoto attraverso la pompa.</li>
		<li>Versare la miscela di silicone liquido in una camera del mouse personalizzati alta come 10 mm di altezza e lasciarlo cura per un paio di giorni (Figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione dei vetrini di copertura ed il fegato fissaggio letto<ol>
<li>Sulla cornice metallica, fissare il vetro di copertura utilizzando colla siliconica. Lasciare asciugare per 1 giorno (Figura 1B).</li>
		<li>Al fine di tenere efficacemente l'acqua distillata per l'obiettivo d'immersione in acqua, una struttura di blocco acqua semipermanente è essenziale. Fare 1 mm colla siliconica di arrotondamento e si induriscono durante la notte.</li>
		<li>Mescolare l'agente indurente e l'elastomero base e poi versarlo in una piastra a 6 pozzetti ad un'altezza di circa 8-10 mm. eseguire il processo di indurimento come descritto in 1.1.2-1.1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione del LPS
<ol><li>Preparare sterile 1 × tampone fosfato salino (PBS) per diluire la polvere di LPS da Salmonella enterica sierotipo enteritidis. (1 × PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4).</li>
	<li>Pre-riscaldare PBS in bagnomaria a 37 ° C e aprire con cautela il flacone della polvere LPS (25 mg).</li>
	<li>Tramite un aiuto di dispensare, versare il PBS sterile (5 mL) nel flacone polvere LPS e mescolare delicatamente o sospendere la soluzione per preparare la soluzione di riserva. Nota: Dopo polvere LPS è liquefatto, Vortex dure può causare bolle. Evitare di fare bolle per minimizzare la perdita quando si effettuano le aliquote in provette da 1,5 mL.</li>
	<li>Conservare la soluzione stock di LPS a − 20 ° C e diluirla in una soluzione di LPS di 1 mg/mL per iniezione.</li>
	<li>Iniettare la soluzione di LPS di 1 mg/mL (20 mg/kg) nel peritoneo di un mouse non anestetizzato usando una siringa da 1 mL. Per l'animale di controllo, iniettare lo stesso volume di PBS.</li>
	<li>Attendere per 2 h per risposta infiammatoria sufficiente.</li>
</ol>3. preparazione del dextrano del Texas-rosso a macchiare i vasi sanguigni
<ol><li>Preparare due provette coniche da 15 mL e 10 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Diluire la polvere rosso-Texas destrano (25 mg) in 3 mL di PBS e mescolare bene. Trasferire il composto in una provetta conica 15 mL vuota.</li>
	<li>Trasferire il restante PBS (7 mL) nella provetta conica 15 mL contenente la miscela di destrano (3 mL).</li>
	<li>Collegare un siringa filtro da 0,45 µm fino alla punta di una siringa da 10 mL. Il filtro siringa dovrebbe sostituire l'ago.</li>
	<li>Filtrare la miscela di destrano (10 mL). Premere in modo uniforme la siringa al fine di evitare di versare.</li>
	<li>Dispensare 500 µ l di soluzione del dextrano 2,5 mg/mL nel tubo di 1,5 mL di luce-bloccata e conservarlo a − 20 ° C. Una volta scongelato, conservarlo a 4° C.</li>
</ol>4. processo chirurgico
<ol><li>Disinfettare la tabella di chirurgia e tutti gli strumenti usando alcool al 70% prima della chirurgia. Impostare gli strumenti per la chirurgia del fegato, quindi regolare la piastra riscaldante a 37 ° C (Figura 2A, B).</li>
	<li>Per l'anestesia, intraperitonealmente iniettare i topi con 30 mg/kg di tiletamina/zolazepam e 10 mg/kg di xilazina. Queste soluzioni possono essere mescolate e diluite in PBS per iniezione simultanea. Confermare amputate premendo delicatamente la punta del mouse.  Procedere passo successivo quando non c'è nessun riflesso.</li>
	<li>Applicare piccole quantità di unguento oculare per prevenire la secchezza della retina di topo.</li>
	<li>Rimuovere i peli del corpo intorno alla zona di addome usando crema depilatoria (Figura 2).</li>
	<li>Iniettare 200 µ l di soluzione di Texas-Red del dextrano (concentrazione di 2,5 mg/mL) tramite la vena caudale o retro-orbitale iniezione utilizzando una siringa da insulina (Figura 2D).</li>
	<li>Delimitare la zona di destra sottocostale con un pennarello. La linea dovrebbe essere disegnata dal processo xifoideo fino alla fine della nervatura. Tagliare l'epidermide con pinze e le forbici (Figura 2E, F).</li>
	<li>Aprire la cavità addominale con delle micro-forbici, pinze ed esporre il fegato con attenzione. Lobo laterale sinistra dovrebbe essere implementato utilizzando tamponi di cotone (Figura 2, H).</li>
	<li>Versare 500 µ l di PBS sterile sulla cavità addominale per prevenire la secchezza del fegato.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella posizione destra-decubitus in una camera di misura e applicare una piccola quantità di colla del tessuto per il letto di silicio. Quindi, fissare con attenzione il fegato utilizzando tamponi di cotone (Figura 2I). Nota: Poiché il tessuto del fegato è estremamente friabile, non meccanicamente estrarre il fegato. Delicatamente stenderla con tamponi di cotone.</li>
	<li>Pochi secondi dopo, bagnare il fegato nuovo con 500 µ l di PBS sterile per evitare l'essiccamento fuori del fegato. Posizionare il telaio in metallo sul fegato e fissarlo saldamente con i dadi (Figura 2J).</li>
</ol>5. videomicroscopia imaging del fegato con microscopia del due-fotone
<ol><li>Eseguire software ZEN (Carl Zeiss) per accendere il laser, impostare la lunghezza d'onda 880 nm, e set verde e canali rossi. Regolare la potenza del laser secondo l'intensità di fluorescenza (Figura 3A). Informazioni sul filtro di emissione è come segue: verde/Alexa488, 500-550 nm e rosso/Alexa 555, 575-610 nm.</li>
	<li>Posizionare la camera sul palco imaging e posizionare il 20X obiettivo per l'immersione in acqua, vicino al vetro di copertura.</li>
	<li>Fissare il riscaldatore della gomma di silicone sotto il corpo del mouse di mantenere la temperatura del corpo (Figura 3B).</li>
	<li>Goccia di 500 µ l di acqua distillata sul telaio metallico e poi tirare la lente dell'obiettivo vicino al fegato (Figura 3).</li>
	<li>Regolare la messa a fuoco e determinare la profondità e l'ora dell'area di imaging.</li>
	<li>Formazione immagine di condotta.</li>
	<li>Per l'imaging a lungo termine, iniettare mezza dose della miscela tiletamina/zolazepam e xilazina ogni ora durante la formazione immagine. Durante questa fase è essenziale mantenere la temperatura corporea dei topi a 37 ° C. Sempre tenere d'occhio per il mouse, poiché tempo amputate differisce da ogni mouse. Nota: Questo metodo non è adatto per il recupero dopo chirurgia e imaging. Sacrifichiamo eticamente il mouse immediatamente dopo la chirurgia.</li>
	<li>Controllare i pedali riflessi per ogni 30 min per stabile amputate.</li>
</ol>6. analisi dei dati
<ol><li>Aprire il software di analisi di dati Volocity e quindi importare i dati grezzi in biblioteca nel software.</li>
	<li>Rimuovere il rumore dall'immagine per adattarsi alla situazione e uno snapshot. Nota: Per ottenere immagini fluide, utilizzare il filtro di 'Bene' o 'Mediana'. Inoltre, è possibile utilizzare la funzionalità di 'Aumento di contrasto' per rendere le immagini sfocate o scure più chiare.</li>
	<li>Montare gli elementi modificati al 100% e l'esportazione come file JPEG o TIFF per immagini istantanee e file AVI per i filmati.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Girard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuels,+hormones,+and+liver+metabolism+at+term+and+during+the+early+postnatal+period+in+the+rat.">Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat.</a> J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).</li><li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li><li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection:+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics.">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> J Vis Exp. (101), e52303 (2015).</li><li>Honda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+neutrophil+recruitment+in+hepatic+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Sierro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Liver+Capsular+Network+of+Monocyte-Derived+Macrophages+Restricts+Hepatic+Dissemination+of+Intraperitoneal+Bacteria+by+Neutrophil+Recruitment.">A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.</a> Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice.">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li></ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Il fegato è stato studiato attivamente da molti gruppi3,10, a causa dell'importanza della sua funzione. Per esempio, Heymann et al ha suggerito un metodo delicato utilizzando dell'agarosi. Anche se questo metodo è stato trovato per essere altamente precisi, l'impostazione di agarosio richiede tempo. Tuttavia, con la nostra metodologia, tutte le procedure possono essere effettuate entro 30 min, minimizzando altri fattori di confusione. In secondo luogo, il fegato di stabilizzazione è estremamente importante perché il battito cardiaco può disturbare il video. Per eliminare questo fenomeno, abbiamo riposizionato i topi nella posizione di decubito destro.
Un altro passo fondamentale in questo protocollo è stata produzione del telaio di copertura in metallo e la sua posizione sulla barra di metallo. L'ostacolo più importante che abbiamo affrontato era di determinare come superare la friabilità del fegato in conformità con la fissazione del fegato usando una quantità appropriata di pressione. Inizialmente, quando solo i dadi ad alette sono stati applicati per contenere il vetrino di copertura, è stata ostacolata la circolazione del sangue e il fegato era incapace di sopportare il peso della diapositiva coperchio. Invece, abbiamo messo a punto un metodo per rotolare giù i bulloni prima di mettere il vetrino di copertura lungo la barra. Poiché il vetrino di copertura è stato supportato da bulloni, ha dato un po' di spazio per lo spessore del fegato e con la presente, non premere giù duro nel fegato ed ancora mantenuto l'equilibrio e la fissazione. Usando LysM-GFP topi6, abbiamo confermato che questo disegno potrebbe consentire la visualizzazione dei neutrofili in sinusoidi e le vene centrali. Topi CX3Cr1-GFP,5 sono stati utilizzati anche in questo modello al fine di osservare LCMs. LCMs sono stati trovati frequentemente sulla superficie del fegato.
L'altezza del piedistallo del fegato o il letto di silicio, era inoltre essenziale. Se fosse troppo alta, avrebbe interrotto la circolazione del sangue nel fegato. Quando l'altezza del piedistallo del fegato era troppo basso, era difficile mantenere la fissazione stabile del fegato. Perché tutti i topi avevano dimensioni corporee differenti, abbiamo prodotto letti di silicio che aveva diverse altezze utilizzando una piastra a 6 pozzetti, simile a quello utilizzato per la coltura cellulare. In questo modo, siamo stati in grado di personalizzare la camera secondo le dimensioni di ogni mouse. In sintesi, abbiamo progettato un romanzo e un semplice protocollo per videomicroscopia imaging del fegato di topo per studiare la morfologia e la motilità delle cellule immunitarie nel fegato in condizioni infiammatorie.
Questo nuovo protocollo potrebbe essere molto utile ai ricercatori in questo campo che vogliono osservare la risposta immunitaria acuta del fegato. Tuttavia, con questo metodo, i ricercatori non possono condurre a lungo termine imaging per più di 6 h a causa di fissazione del fegato con la colla del tessuto. Questo protocollo è un metodo unico una tantum, e di conseguenza, topi dovrebbero essere sacrificati immediatamente dopo formazione immagine. Quando il fegato è staccato dal letto silicio, il fegato sarà alla fine essere spogliato dal letto, con conseguente sanguinamento eccessivo. Pertanto, il reinserimento e la sutura della zona addominale è impossibile per l'osservazione futura.

Il fegato è l'organo metabolico principale nei mammiferi; Esso agisce come una torre di controllo per energia, ormoni e disintossicazione1. Grazie alla sua importanza, i ricercatori hanno condotto molti esperimenti in vitro e in vivo per delucidare i cambiamenti nel fegato durante l'infiammazione. La microscopia intravital è stata usata per catturare immagini in diretta dal fegato2 . Infatti, fegato vari metodi di formazione immagine sono stati introdotti2,3,4,5,6. Tuttavia, al fine di sviluppare un approccio chirurgico più semplificato e raggiungere la stabilizzazione dell'organo bersaglio e le cellule immunitarie, abbiamo progettato un semplice protocollo che possa guidare i ricercatori per ridurre al minimo il loro sforzo per videomicroscopia imaging.
In questo studio, abbiamo introdotto una camera di imaging stabile e romanzo e la tecnica chirurgica che possa essere utilizzata per ridurre al minimo il sanguinamento e possibili infezioni. Abbiamo confermato che il fegato è rimasta intatto per più di 2 h. Con questo metodo, abbiamo identificato correttamente morfologie di LCMs7 e neutrofili sotto condizione settica. Poiché questo metodo minimizza fisici e biologici fattori confondenti quali infiammazione tremante e imprevisto durante la procedura chirurgica, prevediamo che questo metodo potrebbe essere utilizzato per osservare le reazioni acute di cellule immunitarie nel fegato in risposta a i reagenti come LPS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Custom designed chamber</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Custom-designed size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Metal cover slide</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Custom-designed size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cover glass</td>
			<td style="width:239px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:272px;">#72204-03</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sylgard 184 Silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:239px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:239px;">DURAN</td>
			<td style="width:272px;">21 216 36</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cell culture plate (Flat type)</td>
			<td style="width:239px;">HYUNDAI Micro Co.</td>
			<td style="width:272px;">H31006</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Desiccator</td>
			<td style="width:239px;">ADARSH</td>
			<td style="width:272px;">55204</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">High Q BOND SE 5 mL</td>
			<td style="width:239px;">BJM LAB</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">To make semi-permanent dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Flexible Silicone Rubber Heaters</td>
			<td style="width:239px;">Omega</td>
			<td style="width:272px;">SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DC power supply</td>
			<td style="width:239px;">Toyotech</td>
			<td style="width:272px;">DP30-03A</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Home-made</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:260px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:272px;">L6011</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Texas Red Dextran</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:272px;">D1830</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:260px;">15 mL High-clarity polypropylene 
			conical tube</td>
			<td style="width:239px;">FALCON</td>
			<td style="width:272px;">14-959-49B</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:260px;">0.45 &#956;m filter (Minisart Syringe Filter)</td>
			<td style="width:239px;">Sartorius</td>
			<td style="width:272px;">16555k</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1.5ml Micro Tube, Amber</td>
			<td style="width:239px;">Axygen</td>
			<td style="width:272px;">MCT-150-X</td>
			<td style="width:233px;">For light-blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:239px;">Korea Vaccine</td>
			<td style="width:272px;">KV-S01</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:239px;">Korea Vaccine</td>
			<td style="width:272px;">KV-S03</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:239px;">Korea Vaccine</td>
			<td style="width:272px;">KV-S10</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">0.3 mL insulin syringe</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:272px;">324900</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Hair removal cream 100 mL</td>
			<td style="width:239px;">Body natur</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cotton swab</td>
			<td style="width:239px;">ABDI</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Zoletil 50 5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Virbac</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rompun 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Bayer</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Heating plate</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;">PH-S-10</td>
			<td style="width:233px;">Custom-designed size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DC controller</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;">CU-301</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microdessection Scissors</td>
			<td style="width:239px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:272px;">72-5418</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Scissors</td>
			<td style="width:239px;">Roboz</td>
			<td style="width:272px;">RS-5882</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Forceps</td>
			<td style="width:239px;">Roboz</td>
			<td style="width:272px;">RS-5137</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vet bond</td>
			<td style="width:239px;">3M</td>
			<td style="width:272px;">1469SB</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">ZEN software (Black Edition)</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Program for LSM 7 MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LSM 7 MP</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Volocity</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Analysis program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon intravital imaging of leukocytes during the immune response in lipopolysaccharide-treated mouse liver

La sepsi è un tipo di infezione grave che può causare insufficienza d'organo e tessuto danni. Anche se i tassi di mortalità e morbilità associata a sepsi trattamento estremamente alto, nessun diretto o meccanismo di organo è stato esaminato in dettaglio in tempo reale. Il fegato è l'organo chiave che gestisce le tossine e le infezioni nel corpo umano. Nel presente documento, abbiamo mirato a eseguire imaging videomicroscopia del fegato del mouse dopo induzione di endotoxemia al fine di monitorare la motilità delle cellule immuni, quali neutrofili e macrofagi del fegato capsulari (LCMs). Di conseguenza, abbiamo progettato un nuovo metodo chirurgico per l'esposizione del fegato con la chirurgia mini-invasiva. Topi sono stati iniettati intraperitonealmente con il lipopolysaccharide (LPS), un comune dell'endotossina. Utilizzando il nostro nuovo approccio chirurgico per l'esposizione e l'imaging videomicroscopia del reclutamento del mouse del fegato, che abbiamo trovato che dei neutrofili in proteina fluorescente verde-LysM LPS-trattati (GFP) mouse del fegato è stato aumentato rispetto a quello in tampone fosfato fegato di salino-trattati. Dopo il trattamento LPS, il numero dei neutrofili è aumentato significativamente con tempo. Inoltre, con successo, utilizzando topi CX3Cr1-GFP, visualizzato macrofagi residenti del fegato chiamati LCMs. Pertanto, per studiare l'efficacia di nuovi reagenti per controllare la mobilità immuni in vivo, determinare la motilità e la morfologia dei neutrofili e LCMs nel fegato possono permetterci di identificare effetto terapeutico in organo fallimento e tessuto danni causati da attivazione di leucociti nella sepsi.

Una camera semplice e molto stabile di imaging è stata ideata. Il fondo della camera era ricoperta di silicone, che ha impedito lo scivolamento del mouse corpo e organi. Inoltre, perché il silicio ha la giusta quantità di elasticità, potrebbe impedire danni attesi indotto dalla pressione della diapositiva coperchio (Figura 1A, C). Secondo, tessuto-cassaforte collante (Vet bond) è stato applicato al fine di risolvere il fegato estratto sul letto in silicone a forma di cerchio. Questo metodo permette di evitare tremore causato da battito cardiaco o movimento respirational. Infine, una diapositiva coperchio metallico era posizionata e fissata da bulloni e dadi basati sulla dimensione corporea dei topi e la posizione del fegato sporgente (Figura 1B–D). Quando l'anestesia è stata eseguita correttamente, è possibile che queste impostazioni imaging potrebbero durare più di 6 h.
Prima di iniziare l'intervento chirurgico, la temperatura corporea dei topi è stata controllata mettendo l'animale in una camera di riscaldamento che è stato pre-impostata a 37 ° C (Figura 2A). Successivamente, per prevenire l'infezione secondaria, tutti gli strumenti necessari per chirurgia del mouse e l'imaging sono stati sterilizzati con alcool al 70% e/o sterilizzato nell'autoclave per prevenire l'infezione secondaria (Figura 2B). Quindi, capelli del corpo del mouse è stato rimosso, in particolare dalla zona addominale, con una crema di rimozione dei capelli (Figura 2). Prima di effettuare l'incisione, la pelle è stata sterilizzata con povidone iodio. Il flusso di sangue era etichettato con destrano Texas-Red via l'iniezione della vena (Figura 2D). È stata tracciata una linea che ha cominciato il processo xifoideo e terminava alle costole destra. Questa linea di incisione sottocostale destra ha aiutato a ridurre al minimo il sanguinamento. Con un bisturi o un micro-forbici, la dissezione è stata avviata; l'addome non è stato aperto troppo per evitare l'espulsione degli intestini dalla cavità addominale (Figura 2E, F). Strati di tessuto grasso e sono stati rimossi con pinze e le forbici micro-dissezione e l'area di incisione era pulita con tamponi di cotone e PBS sterilizzati (Figura 2). Lobo laterale di sinistra, il più grande dei quattro lobi del fegato, è stato tolto con tamponi di cotone e poi attaccato al letto di silicio mediante un legame di tessuto (legame del veterinario). Come il tessuto del fegato era estremamente friabile, il fegato è stato spostato utilizzando tamponi di cotone (Figura 2 H, I). Dopo l'applicazione del metallo vetro di copertura, il fegato è stato sottoposto a imaging. Per prevenire la secchezza, PBS sterile è stato applicato allo spazio tra il fegato e il vetro di copertura (Figura 2J). L'altezza del vetro di copertura è stata regolata con dadi quando necessario.
Microscopia del due-fotone era equipaggiata con X, Y, e Z assi controller di micrometro e schermato con tenda nera (Figura 3A). Il laser è stato stabilmente bloccato in modalità sul software Zen. Per acquisire la formazione immagine stabile, alla deriva di organo bersaglio dovrebbe essere evitata. Pertanto, oltre alla camera di imaging e metodo chirurgico, i fili del pad riscaldamento elettronico erano protetto lontano dal palco imaging e ben organizzata dai nastri appiccicosi (Figura 3B). Infine, una quantità sufficiente di acqua distillata è stato aggiunto alla parte superiore di vetro di copertura per l'obiettivo d'immersione in acqua (Figura 3).
Il flusso di sangue è stato chiaramente indicato sullo schermo dopo l'iniezione endovenosa del dextrano del Texas-Red. Al fine di catturare contemporaneamente sia rosso e verde, abbiamo effettuato la formazione immagine con una lunghezza d'onda di 880 nm. Secondo l'analisi di imaging videomicroscopia, un congruo numero di neutrofili stava circolando sempre il sangue in condizione di PBS. Considerando che, il numero dei neutrofili in LPS topi trattati è stato aumentato significativamente. Si noti che un sacco di neutrofili circolavano all'interno del flusso sanguigno ma non migrano all'esterno della nave in condizioni infiammatorie. (Figura 4A, film supplementare 1). Neutrofili nei topi LPS-trattati sono stati rispettati più saldamente alla superficie luminal della nave, che ha reso più frequenti rilevazione dei neutrofili nel vaso (Figura 4A, complementare Movie 1). A parte la motilità dei neutrofili, LCMs in topi CX3Cr1-GFP sono stati osservati sulla superficie del tessuto del fegato piuttosto che profondo all'interno del tessuto (Figura 4B). LCMs ha mostrato poco movimento o attivazione nel fegato anche in topi LPS-trattati.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig1.jpg"> Figura 1 . Design dell'alloggiamento del fegato e strumenti sussidiari. (A) versare la miscela di silicone nella camera del mouse personalizzati. (B) dimensioni della diapositiva coperchio metallico (1 pollice = 25,4 mm, Ф = diametro). (C) l'immagine mostra la plastica personalizzati del fegato camera riempita con elastomero di silicone. (D) le altre parti sono stati usati per assemblare la camera del fegato. I dadi e i bulloni di fissaggio sono state fatte di ferro. Le frecce indicate, bulloni e dadi, rispettivamente, in (C) e (D). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig2.jpg"> Figura 2 . Procedura chirurgica per la chirurgia del fegato. (A) metallo e gomma riscaldamento piastre a 37° C e regolatore di temperatura DC prima della chirurgia. (B) generale chirurgia e strumenti di supporto per la chirurgia del fegato (a. cotone tampone e contenitore, b. alcool al 70%, c. carta velina, d. rasoio, crema depilatoria e., f. camera di misura, nastro chirurgico g., piedistallo del fegato fatto in casa di h., i. dadi ad alette e noci, coperchio metallico j. diapositiva, k. micro-dissezione Forbici, pinze l., m. forbici, n. 3-mL siringa, marcatore o., siringa da insulina 0,3 mL p., siringa 1 mL d.). Procedura per la chirurgia del fegato (C-J). (C) applicare crema depilatoria al sito addominale. (D) retro-orbitale iniezione dei topi con destrano Texas-Red. (E) marcatura dell'incisione con un pennarello. (F) l'epidermide con pinze e le forbici da taglio. (G) facendo un'incisione nella cavità addominale. (H) tirando delicatamente il lobo laterale sinistro. (I) allegando il lobo al piedistallo del fegato usando bond vet. (J) immagine della configurazione finale. I dadi sono stati fissati alla diapositiva coperchio metallico, e quindi il vetrino di copertura è stato fissato con dadi ad alette. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig3.jpg"> Figura 3 . Impostazioni per microscopia del due-fotone e fase imaging. (A) vista del due-fotone microscopia (LSM 7 MP) e la fase di formazione immagine, che può muoversi in x e y le direzioni. (B) una camera di imaging del fegato con un rilievo di riscaldamento di gomma è stata fissata con del nastro per coprire il mouse. (C) cadere acqua distillata acqua con una pipetta tra l'obiettivo e copertura in vetro. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig4.jpg"> Figura 4 . Visualizzazione dei neutrofili e macrofagi del fegato capsulari nel fegato di topi live. (A) esteso snapshot di messa a fuoco dei neutrofili nel fegato di topi LysM-GFP. L'immagine di controllo era da topi trattati con PBS. L'immagine di LPS era dai topi LPS-trattati. Immagini sono state acquisite utilizzando un 20x / lente 1,0 NA-immersione in acqua (campo visivo [FOV] = 424.3 µm × 424,3 µm, profondità = 40 µm, fetta intervallo = 1 µm, intervallo di tempo = 60 s, ciclo = 31). Barra della scala = 50 µm. (B) interno e superficie istantanea di zona di LCMs nel fegato di topi CX3Cr1-GFP. Immagini sono state acquisite utilizzando una lente di immersione in acqua di 20 × / 1.0 NA (FOV = 424.3 µm × 424,3 µm, profondità = 40 µm (interno) / 10 µm (superficie), fetta intervallo = 1 µm, intervallo di tempo = 60 s (interno) / 20 (superficie), ciclo s = 31). Barra della scala = 50 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57191/57191mov1.jpg"> Film supplementare 1. Confronto di PBS trattati fegato contro fegato LPS trattati. Chiara differenza in due condizioni diverse è ben osservato. In LPS trattati del fegato, del numero di neutrofili è aumentato significativamente e la motilità è in diminuzione. La stabilità del film in entrambe le condizioni sono osservate. Il flusso sanguigno è etichettato con destrano Texas Red. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/Movie_1.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Abbiamo stabilito un protocollo chirurgico romanzo per l'imaging del due-fotone del fegato di topi dal vivo con l'invasione minima. Con questa tecnica, abbiamo identificato la struttura dettagliata del fegato durante il endotoxemia lipopolysaccharide indotta. Prevediamo che questo metodo può essere utilizzato per determinare l'efficacia del trattamento di reagenti vari per migrazione leucocitaria epatica.

Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

two-photon-intravital-imaging-leukocytes-during-immune-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  Yonsei University College of Medicine. Abbiamo stabilito un protocollo chirurgico romanzo per l'imaging del due-fotone del fegato di topi dal vivo con l'invasione minima. Con questa tecnica, abbiamo identificato la struttura dettagliata del fegato durante il endotoxemia lipopolysaccharide indotta. Prevediamo che questo metodo può essere utilizzato per determinare l'efficacia del trattamento di reagenti vari per migrazione leucocitaria epatica.

Video: Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

An Introduction to vespe parassite di<em&gt; Drosophila</em&gt; E la risposta immunitaria antiparassitari

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imaging intravitale del Nodo poplitea Lymph mouse

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

Analisi di riparazione della membrana cellulare usando un microscopio a due fotoni Laser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...