Bu çalışmada bir hibe--dan Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Kore hükümeti (MSIP; grant No 2016R1A2B4008199 Y-m tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir H.), Sağlık Bakanlığı ve refah, Güney Kore (sayı vermek: HI14C1324).

Tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kore kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır. LysM-yeşil flüoresan protein (GFP; gfp / +) fareler8 ve CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 fare 8-12 hafta-in yaş, intravital görüntüleme için kullanılmıştır. Tüm cerrahi alet autoclaved ve % 70 alkol ile dezenfekte edildi.
1. özel tasarlanmış fare araçları destekleyici odası Imaging karaciğer
<ol><li>Fare karaciğer odası tasarım görüntüleme<ol>
<li>Fare karaciğer (şekil 1) görüntüleme için aşağıdaki boyut TMMOB olun: iç Odası (120 mm Uzunluk × 160 mm genişlik × 30 mm yükseklik), dış Kamara (100 mm Uzunluk × 100 mm genişlik × 24 mm yükseklik), cıvata (Ф 3 mm × 30 mm yükseklik), fındık (Ф 4 mm) ve kanat şeklindeki fındık (Ф 4 mm).</li>
		<li>Kür Ajan ve elastomer 1:9 oranı temel silikon 120 g toplam yapmak için ölçmek.</li>
		<li>Sıvı silikon karışımı bir 250 mL Erlenmeyer şişeye koyun ve iyice karıştırın. Sonra bir desiccator şişeye koy ve hava kabarcıkları vakum altında yaklaşık 1 h için pompa ile kaldırın.</li>
		<li>10 mm yükseklik gibi yüksek bir özel tasarlanmış fare odasına sıvı silikon karışımı dökün ve izin için bir kaç gün (şekil 1A) tedavi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kapak slaytlar ve yatak sabitleme karaciğer hazırlanması<ol>
<li>Metal çerçeve üzerinde kapak cam silikon yapıştırıcı kullanarak ekleyin. 1 gündür (şekil 1B) kurumasını bekleyin.</li>
		<li>Etkili bir şekilde su daldırma lens için distile su tutmak için semipermanent su engelleme yapısı çok önemlidir. 1 mm silikon yapıştırıcı yuvarlama yapmak ve gecede sertleşmesine.</li>
		<li>Mix kür Ajan ve elastomer temel ve sonra içine 6-şey plaka bir yükseklikte, yaklaşık 8-10 mm. gerçekleştir sertleştirme işlemi 1.1.2-1.1.4 içinde açıklandığı gibi dökün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. LPS hazırlanması
<ol><li>Steril 1 × fosfat tamponlu tuz (PBS) üzerinden Salmonella enterica serotip enteritidis LPS toz sulandırmak için hazırlayın. (1 × PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4).</li>
	<li>PBS su banyosu 37 ° C'de ön ısı ve LPS toz şişe (25 mg) dikkatlice açın.</li>
	<li>Damlalıklı yardımların kullanılması, steril PBS (5 mL) LPS toz şişe içine dökün ve hafifçe karıştırın veya hisse senedi çözüm hazırlamak için çözüm askıya alabiliriz. Not: LPS toz sıvılaşmış sonra sert vortexing kabarcıklar neden olabilir. Aliquots 1.5 mL tüplerde yaparken kaybı en aza indirgemek için baloncuklar yapmaktan kaçının.</li>
	<li>−20 ° C de hisse senedi LPS çözüm depolamak ve enjeksiyon için 1 mg/mL LPS çözüm içine oranında seyreltin.</li>
	<li>1 mg/mL LPS çözüm (20 mg/kg) 1-mL şırınga kullanarak bir sigara anestezi fare Periton enjekte. Denetim hayvan için PBS aynı hacmi enjekte.</li>
	<li>2s için yeterli inflamatuar yanıt bekleyin.</li>
</ol>3. kan damarları leke hazırlanması Texas-kırmızı Dextran
<ol><li>İki 15 mL konik boru ve 10 mL steril PBS hazırlayın.</li>
	<li>Texas-kırmızı Dextran toz (25 mg) PBS 3 ml seyreltik ve iyice karıştırın. Karışımı bir boş 15 mL konik tüp aktarın.</li>
	<li>Kalan PBS (7 mL) dextran karışımı (3 mL) içeren 15 mL konik tüp aktarın.</li>
	<li>0,45 µm şırınga filtre bir 10 mL şırınga ucunu bağlayın. Şırınga filtre iğne değiştirmeniz gerekir.</li>
	<li>Dextran karışımı (10 mL) filtre. Şırınga eşit dökülmesini önlemek için tuşuna basın.</li>
	<li>2.5 mg/mL dextran çözüm ışık bloke 1.5 mL tüp içinde 500 µL dağıtmak ve −20 ° C. saklayın Bir kez çözdürülen, 4 ° C'de depolayın</li>
</ol>4. cerrahi işlem
<ol><li>Cerrahi tablo ve tüm aletleri ameliyat öncesi % 70 alkol kullanarak dezenfekte edin. Sonra karaciğer ameliyatı için araçları seti ve ısıtma yüzeyi 37 ° C (şekil 2A, B) için ayarlayın.</li>
	<li>Anestezi için 30 mg/kg tiletamine/zolazepam ve 10 mg/kg xylazine ile fareler intraperitoneally enjekte et. Bu çözümler karışık olabilir ve aynı anda enjeksiyon için PBS içinde seyreltilmiş. Anesthetization yavaşça fare ayak basarak onaylayın.  Hiçbir refleks olduğunda sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Fare'nın retina kuruluğu önlemek için göz merhem küçük miktarda uygulayın.</li>
	<li>Vücut saç saç dökücü krem (şekil 2C) kullanarak karın çevresinde kaldırın.</li>
	<li>Texas-kırmızı Dextran eriyik (2.5 mg/mL konsantrasyonu) kuyruk ven veya bir insülin şırınga (şekil 2B) kullanarak retro-orbital enjeksiyon yolu ile 200 µL enjekte.</li>
	<li>Şu subcostal alan bir marker ile işaretleyin. Çizgi xiphoid işleminden kaburga sonuna kadar çizilmiş olması. Forseps ve makas (şekil 2E, F) ile epidermis kesti.</li>
	<li>Karın boşluğu mikro-makas ve forseps kullanarak açın ve karaciğer dikkatle bulaşmasına neden. Sol yan lob pamuk temizleme bezi (Şekil 2 g, H) kullanılarak alınması.</li>
	<li>Steril PBS 500 µL kuruluk karaciğer önlemek için karın boşluğuna dökün.</li>
	<li>Özel olarak tasarlanmış odası sağ-decubitus konumda fareyi getirin ve doku yapıştırıcı az miktarda silikon yatağa uygulayın. Pamuk temizleme bezi (şekil 2I) kullanarak karaciğer yapıştırmanız dikkatle. Not: karaciğer dokusu son derece kırılgan olduğundan, mekanik karaciğerinden çekmeyin. Yavaşça pamuk temizleme bezi ile tomar dışarı.</li>
	<li>Birkaç saniye sonra Karaciğer karaciğer dışarı kurutma önlemek için steril PBS 500 µL ile tekrar ıslak. Metal çerçeve üzerinde karaciğer yerleştirin ve sıkıca fındık (şekil 2J) ile düzeltmek.</li>
</ol>5. İki fotonlu mikroskobu ile karaciğer intravital görüntüleme
<ol><li>ZEN yazılım (Carl Zeiss) üzerine lazer açmak, dalga boyunu ayarlamak için 880 nm ve set yeşil, çalıştırın ve kırmızı kanalları. Lazer güç floresan yoğunluğu (şekil 3A) göre ayarlayın. Emisyon filtre bilgi ise şöyle: yeşil/Alexa488, 500-550 nm ve kırmızı/Alexa 555, 575-610 nm.</li>
	<li>Odası görüntüleme sahnesinde yerini ve 20 X su-daldırma objektif lens kapağı cam yakın yerleştirin.</li>
	<li>Silikon kauçuk ısıtıcı (şekil 3B), vücut ısısını korumak için fare cesedi altında düzeltmek.</li>
	<li>500 µL distile su üzerinde metal çerçeve bırakın ve sonra karaciğer (şekil 3 c) yakın objektif lens çekin.</li>
	<li>Derinlik ve saati görüntüleme alanını belirlemek ve odağı ayarlayın.</li>
	<li>Kuralları görüntüleme.</li>
	<li>Uzun vadeli görüntüleme için her saat görüntüleme sırasında yarım doz tiletamine/zolazepam ve xylazine karışımı enjekte et. Vücut ısısı 37 ° C'de farelerin Bakımı sırasında bu sahne çok önemlidir. Her zaman anesthetization zaman her fare farklılık fare için göz kulak ol. Not: Bu yöntem cerrahi ve görüntüleme sonra kurtarma için uygun değildir. Etik fare hemen ameliyat sonrası kurban ediyoruz.</li>
	<li>Kararlı anesthetization için her 30 dakika pedal refleksleri kontrol edin.</li>
</ol>6. veri analizi
<ol><li>Veri analiz yazılımı Volocity açın ve sonra kütüphanede ham veri yazılım alın.</li>
	<li>Gürültü durumu uygun ve bir anlık görüntü almak için görüntüden kaldırın. Not: düzgün görüntü elde etmek, 'Para' veya 'Orta' filtresini kullanın. Ayrıca, karanlık ya da bulanık görüntülerin daha net yapmak için 'Kontrast geliştirme' özelliğini kullanın.</li>
	<li>Anlık görüntüler için JPEG veya TIFF dosyalarını ve AVI dosyalarını filmler için % 100 ve ihracat için düzenlenmiş öğe sığar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Girard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuels,+hormones,+and+liver+metabolism+at+term+and+during+the+early+postnatal+period+in+the+rat.">Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat.</a> J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).</li><li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li><li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection:+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics.">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> J Vis Exp. (101), e52303 (2015).</li><li>Honda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+neutrophil+recruitment+in+hepatic+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Sierro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Liver+Capsular+Network+of+Monocyte-Derived+Macrophages+Restricts+Hepatic+Dissemination+of+Intraperitoneal+Bacteria+by+Neutrophil+Recruitment.">A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.</a> Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice.">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Karaciğer aktif olarak birçok gruplar3,10, onun işlevini önemi nedeniyle tarafından incelenmiştir. Örneğin, Heymann vd. özel kullanarak hassas bir yöntem önerdi. Bu yöntem son derece kesin olarak bulundu rağmen özel ayar sürüyor. Ancak, bizim metodoloji ile tüm yordamları karıştırıcı diğer faktörler minimize 30 dk içinde yürütülen. Kalp atışı video rahatsız edemez çünkü İkincisi, karaciğer sabitleme son derece önemlidir. Bu olgu ortadan kaldırmak için biz fareyi sağ dekübitus pozisyona yeniden konumlandırılmış.
Bu iletişim kuralı bir kritik adım metal kapak çerçeve ve metal çubuk üzerindeki konumu üretim oldu. Friability Karaciğer karaciğer fiksasyon basınç uygun bir miktarda kullanarak uygun olarak üstesinden gelmek nasıl belirlemek için biz karşı en önemli engel oldu. Başlangıçta, sadece Kelebek somun kapak slayt tutun uygulandığı zaman, kan dolaşımını sekteye ve karaciğer kapak slayt ağırlığını tahammül edemedi. Bunun yerine, kapak slayt çubuğu boyunca yerleştirmeden önce cıvata aç için bir yöntem geliştirdi. Kapak slayt cıvata tarafından desteklenen karaciğer kalınlık ve bu vesile ile bazı yer verdi, sert karaciğer bastırın değil ve henüz denge ve fiksasyon yapılmaktadır. LysM-GFP fareler6kullanarak, bu tasarım görselleştirme nötrofil sinusoids ve merkezi damarlar izin verebilir doğruladı. CX3Cr1-GFP fareler5 de kullanılmıştır bu modelde LCMs. LCMs incelemek için sık sık karaciğer yüzeyinde bulundu.
Karaciğer Kaide veya silikon yatak yüksekliği de gerekli. Çok yüksek olsaydı, kan dolaşımını karaciğerde tahrip edilmesini. Karaciğer Kaide yüksekliğini çok düşük iken, karaciğer stabil fiksasyonu korumak zordu. Çünkü farklı vücut boyutları tüm fareler vardı, biz farklı yükseklikleri 6-şey plaka, hücre kültürü için kullanılan benzer kullanarak vardı silikon yatak üretti. Bu şekilde, biz odası her fare boyutuna göre özelleştirmek başardık. Özet olarak, biz bir roman ve basit iletişim kuralı morfolojisi araştırmak için fare karaciğer intravital görüntüleme ve inflamatuar koşullar altında karaciğerde bağışıklık hücreleri hareket için tasarlanmıştır.
Bu yeni iletişim kuralı akut bağışıklık yanıtı karaciğer gözlemlemek isteyen bu alandaki araştırmacılar için çok yararlı olabilir. Ancak, bu yöntemle, araştırmacılar doku yapıştırıcı ile karaciğer fiksasyonu nedeniyle 6 h daha uzun uzun vadeli görüntüleme kuralları olamaz. Bu iletişim kuralı tek seferlik bir tek yöntem ve bu nedenle, fare hemen sonra görüntüleme feda. Karaciğer silikon yatağından kesildi, karaciğer sonunda aşırı kanama ortaya çıkan yatağı çıkardı. Bu nedenle, ekleyen ve karın bölgesinin kalbinde dikiş imkansız gelecek gözlem için.

Karaciğer önemli metabolik organ memelilerde olduğunu; enerji, hormonlar ve detoksifikasyon1için bir kontrol kulesi olarak görür. Onun önemi nedeniyle, araştırmacılar değişiklikleri karaciğerde iltihap sırasında aydınlatmak için birçok vitro ve in vivo deneyler yaptık. İntravital mikroskobu karaciğer2 canlı görüntüleri yakalamak için kullanılır. Gerçekten de,2,3,4,5,6çeşitli karaciğer görüntüleme yöntemleri olmuştur tanıttı. Ancak, daha basitleştirilmiş bir cerrahi yaklaşım geliştirmek ve sabitleme hedef organ ve bağışıklık hücreleri elde etmek için biz kendi çaba intravital görüntüleme için en aza indirmek araştırmacılar rehberlik eder basit bir protokol tasarlanmıştır.
Bu çalışmada, istikrarlı ve yeni görüntüleme odası ve kanama ve olası enfeksiyon en aza indirmek için kullanılabilir cerrahi tekniği tanıttı. Karaciğer daha 2 h için sağlam kaldı doğruladı. Bu yöntemle başarıyla türleri Morfoloji LCMs7 ve nötrofil septik koşul altında tanımlanan. Bu yöntem titreyen ve beklenmedik iltihabı gibi fiziksel ve biyolojik karıştırıcı faktörlerin cerrahi işlem sırasında en aza indirir bu yana, biz bu yöntemi yanıt olarak karaciğerde bağışıklık hücrelerinin akut reaksiyonlar gözlemlemek için kullanılan olabilir tahmin reaktifler LPS severim.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Custom designed chamber</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Custom-designed size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Metal cover slide</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Custom-designed size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cover glass</td>
			<td style="width:239px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:272px;">#72204-03</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sylgard 184 Silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:239px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:239px;">DURAN</td>
			<td style="width:272px;">21 216 36</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cell culture plate (Flat type)</td>
			<td style="width:239px;">HYUNDAI Micro Co.</td>
			<td style="width:272px;">H31006</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Desiccator</td>
			<td style="width:239px;">ADARSH</td>
			<td style="width:272px;">55204</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">High Q BOND SE 5 mL</td>
			<td style="width:239px;">BJM LAB</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">To make semi-permanent dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Flexible Silicone Rubber Heaters</td>
			<td style="width:239px;">Omega</td>
			<td style="width:272px;">SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DC power supply</td>
			<td style="width:239px;">Toyotech</td>
			<td style="width:272px;">DP30-03A</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Home-made</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:260px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:272px;">L6011</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Texas Red Dextran</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:272px;">D1830</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:260px;">15 mL High-clarity polypropylene 
			conical tube</td>
			<td style="width:239px;">FALCON</td>
			<td style="width:272px;">14-959-49B</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:260px;">0.45 &#956;m filter (Minisart Syringe Filter)</td>
			<td style="width:239px;">Sartorius</td>
			<td style="width:272px;">16555k</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1.5ml Micro Tube, Amber</td>
			<td style="width:239px;">Axygen</td>
			<td style="width:272px;">MCT-150-X</td>
			<td style="width:233px;">For light-blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:239px;">Korea Vaccine</td>
			<td style="width:272px;">KV-S01</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:239px;">Korea Vaccine</td>
			<td style="width:272px;">KV-S03</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:239px;">Korea Vaccine</td>
			<td style="width:272px;">KV-S10</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">0.3 mL insulin syringe</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:272px;">324900</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Hair removal cream 100 mL</td>
			<td style="width:239px;">Body natur</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cotton swab</td>
			<td style="width:239px;">ABDI</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Zoletil 50 5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Virbac</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rompun 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Bayer</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Heating plate</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;">PH-S-10</td>
			<td style="width:233px;">Custom-designed size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DC controller</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;">CU-301</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microdessection Scissors</td>
			<td style="width:239px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:272px;">72-5418</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Scissors</td>
			<td style="width:239px;">Roboz</td>
			<td style="width:272px;">RS-5882</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Forceps</td>
			<td style="width:239px;">Roboz</td>
			<td style="width:272px;">RS-5137</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vet bond</td>
			<td style="width:239px;">3M</td>
			<td style="width:272px;">1469SB</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">ZEN software (Black Edition)</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Program for LSM 7 MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LSM 7 MP</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Volocity</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Analysis program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon intravital imaging of leukocytes during the immune response in lipopolysaccharide-treated mouse liver

Sepsis organ yetmezliği ve doku neden olabilir şiddetli enfeksiyon türüdür hasar. Mortalite ve morbidite oranları sepsis ile ilişkili, ancak son derece yüksek, hayır doğrudan tedavi vardır veya mekanizma organ ile ilgili ayrıntılı gerçek zamanlı olarak inceledi. Karaciğer toksinleri ve enfeksiyonlar insan vücudunda yönetir anahtar organdır. Burada, nötrofil ve karaciğer kapsüler makrofajlar (LCMs) gibi bağışıklık hücreleri hareket izlemek için fare karaciğer intravital görüntüleme sonra endotoksemi indüksiyon gerçekleştirmek amaçladık. Buna göre bir roman cerrahi yöntemi pozlama minimal invaziv cerrahi ile karaciğer için tasarlanmış. Fareler intraperitoneally ile lipopolysaccharide (LPS), bir ortak endotoksin enjekte edildi. Pozlama ve LPS tedavi LysM-yeşil flüoresan protein (GFP) fare karaciğer, o nötrofil bulduk alımı intravital görüntüleme için bizim yeni cerrahi yaklaşım kullanarak fare karaciğer bununla fosfat tamponlu göre artış serum fizyolojik tedavi karaciğer. LPS tedaviden sonra nötrofil sayısı önemli ölçüde zamanla arttı. Ayrıca, CX3Cr1-GFP fare kullanarak, biz başarıyla karaciğer ikamet makrofajlar LCMs adı görüntülenir. Bu nedenle, bağışıklık hareketlilik vivo içindekontrol etmek için yeni reaktifler etkinliğini araştırmak için hareketliliği ve nötrofil ve LCMs morfolojisi karaciğerde belirleme organ yetmezliği ve doku hasarı nedeniyle tedavi edici etkisi tanımamıza izin verebilir Sepsis lökosit etkinleştirme.

Basit ve çok kararlı görüntüleme odası geliştirildi. Odası alt fare vücudu ve organları kaymasını engelleyen silikon ile kaplıydı. Ayrıca, silikon elastikiyet doğru miktarda olduğundan, beklenen hasar kapak slayt (şekil 1A, C) basınç tarafından indüklenen engelleyebilir. İkinci, doku-kasa tutkal (veteriner bond)'i ayıklanan karaciğer daire şeklinde silikon yatağa düzeltmek için uygulandı. Bu yöntem kalp atışı ya da respirational hareketi neden titreyen önlemek için bize etkin. Son olarak, bir metal kapak slayt yerleştirilir ve somunlar fareler vücut büyüklüğü ve çıkıntılı karaciğer (şekil 1B-D) konumunu temel alan tarafından sabit. Anestezi düzgün gerçekleştirildiğinde, bu görüntüleme ayarları 6 h daha uzun sürebilir.
Ameliyat başlamadan önce fareler vücut sıcaklığı 37 ° C (şekil 2A) önceden ayarlanmış bir Isıtma odası hayvan yerleştirerek tarafından kontrol ediliyordu. Daha sonra ikincil enfeksiyonu önlemek için fare cerrahi ve görüntüleme için tüm gerekli araçları % 70 alkol ile sterilize edilmiş ve/veya ikincil enfeksiyon (2B rakam) önlemek için autoclaved olduğunu. Ardından, fare vücut saç, özellikle karın bölgesi, bir saç dökücü krem (şekil 2C) ile kaldırılmıştır. Kesi yapmadan önce cilt povidone iyot ile sterilize. Kan akımı Texas-kırmızı Dextran ile ven enjeksiyon yolu ile (şekil 2B) etiketli. De xiphoid süreci başladı ve sona erdi sağ kaburga bir çizgi çizilmiştir. Bu şu subcostal kesik çizgi kanama en aza indirmek yardımcı oldu. Bir neşter veya mikro-makas ile diseksiyon başladı; Karın çok fazla bağırsaklar sınırdışı karın boşluğu (şekil 2E, F) önlemek için açılmamış. Yağ ve doku katmanları forseps ve mikro-diseksiyon makası ile kaldırılmıştır ve kesi alan sterilize PBS ve pamuk temizleme bezi ile (Şekil 2 g) temizlendi. Sol yan lob, dört karaciğer lobları en büyük pamuk temizleme bezi ile çıkartılır ve doku bond (veteriner bond) kullanarak silikon yatağa bağlı. Karaciğer dokusu son derece kırılgan olduğu gibi karaciğer pamuk temizleme bezi (Şekil 2 H, ben) kullanarak taşındı. Metal kapak cam uygulandıktan sonra karaciğer Imaging'e maruz bırakıldı. Kuruluğu önlemek için steril PBS karaciğer ve cam (şekil 2J) arasındaki boşluğu uygulandı. Cam yüksekliği ile gerektiğinde fındık ayarlandı.
İki fotonlu mikroskobu donatılmıştır X, Y, ve Z eksenleri mikrometre denetleyicisi ve siyah perde (şekil 3A) ile korumalı. Lazer stabil Zen yazılım modunda kilitli. İstikrarlı görüntüleme elde etmek için hedef organ sürüklenen olmak önlemek. Bu nedenle, görüntüleme odası ve cerrahi yöntemi ek olarak, görüntüleme sahne uzak güvenli ve iyi organize edilmiş Yapışkan bantlar (şekil 3B) tarafından elektronik Isıtma yastığını teller vardı. Son olarak, distile su yeterli miktarda su daldırma lens (şekil 3 c) için kapak cam üst eklendi.
Kan akımı Texas-kırmızı Dextran intravenöz enjeksiyon sonra ekranda açıkça belirtilmiştir. Kırmızı ve yeşil aynı anda yakalamak için biz bir dalga boyu 880 ile görüntülemede gerçekleştirilen nm. İntravital görüntüleme analizine göre nötrofil uygun sayıda her zaman PBS koşulu kanda dolaşan. LPS nötrofil sayısı farelerde tedavi ise önemli ölçüde arttı. Bir sürü nötrofiller kan içinde dolaşan ama onlar gemi inflamatuar durumu dışında göç değil unutmayın. (Şekil 4A, takıma giren film 1). Nötrofil LPS tedavi edilen farelerde daha sıkıca nötrofil daha sık algılama gemi (4A rakam, takıma giren film 1) yapılan gemi luminal yüzeyine yapıştırılır. Nötrofil hareketliliği dışında LCMs CX3Cr1-GFP farelerde karaciğer dokusunun yerine (4B rakam) doku içinde derin yüzeyinde tespit edildi. LCMs küçük hareket ya da harekete geçirmek karaciğer LPS tedavi edilen farelerde bile gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig1.jpg"> Resim 1 . Karaciğer odası ve yardımcı araçlar tasarımı. (A) silikon karışımı özel tasarlanmış fare odanın içine dökme. (B) boyutlarında metal kapak slayt (1 inç = 25,4 mm, Ф çapı =). (C) görüntü karaciğer odası özel tasarlanmış silikon elastomer ile dolu plastik gösterir. (D) diğer parçaları karaciğer odası araya kullanılmıştır. Sabitleme somunlar demirden yapılmıştır. Oklar belirtilen somunlar, sırasıyla, (C) ve (D). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig2.jpg"> Resim 2 . Cerrahi adımları karaciğer ameliyatı için. (a) Metal ve kauçuk plakalar 37 ° C ve DC sıcaklık denetleyicisi ameliyattan önce Isıtma. (B) genel cerrahi ve karaciğer ameliyatı (a. pamuk çubukla ve konteyner, b. % 70 alkol, c. kağıt dokusu, ö. ustura, e. saç dökücü krem, f. özel tasarlanmış odası, g. cerrahi bant, h. ev yapımı karaciğer Kaide, ı. kanat fındık ve fındık, j. metal kapak için destek araçları Slayt, k. mikro-diseksiyon makası, l. forseps, m. makas, i. 3 mL şırınga, o. marker, s. 0.3 mL insülin şırınga, s. 1-mL şırınga). Yordam karaciğer ameliyatı (C-J) için. (C) uygulama saç dökücü krem karın sitesinde. (D) retro-orbital enjeksiyon Texas-kırmızı Dextran ile fare. (E) kesi site bir marker ile işaretleme. (F) epidermis forseps ve makas ile kesme. (G) bir kesi karın boşluğuna yapma. (H) sol yan lob hafifçe çekerek. (I) veteriner bond kullanarak karaciğer Kaide LOB ekleme. (J) final görüntüsünü ayarlayın. Fındık metal kapak slayta tespit edildi ve daha sonra kapak slayt Kelebek somun ile tespit edildi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig3.jpg"> Şekil 3 . İki fotonlu mikroskobu ve görüntüleme sahne ayarlarını. (A) İki fotonlu mikroskobu (LSM 7 MP) ve x ve y yönde taşıyabilirsiniz görüntüleme sahne görünümünü. (B) bir karaciğer görüntüleme odası ile yastık Isıtma bir lastik bant fare kullanacak bağlıydı. (C) bırakarak distile su ile objektif lens ve cam arasında bir pipet. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig4.jpg"> Şekil 4 . Görselleştirme canlı fare Karaciğer karaciğer kapsüler makrofajlar ve nötrofiller. (A) odak anlık nötrofil LysM-GFP farelerin karaciğer genişletilmiş. Denetim görüntü PBS tedavi fareler oldu. LPS görüntü LPS tedavi fareler yapıldı. Görüntüleri bir 20 X kullanarak elde / 1.0 NA su-daldırma lens (görüş alanı [FOV] 424.3 µm × 424.3 µm, Derinlik = 40 µm, dilim aralığı = 1 µm, zaman aralığı = 60 = s, döngüsü = 31). Ölçek çubuğu 50 µm. (B) = iç ve yüzey alan anlık görüntüsünü LCMs CX3Cr1-GFP farelerin karaciğer. Görüntüleri bir 20 × / 1.0 NA su-daldırma lens ile elde (FOV 424.3 µm × 424.3 µm, Derinlik = 40 µm (iç) = / 10 µm (yüzey), dilim aralığı 1 µm, zaman aralığı = 60 = s (iç) / 20 s (yüzey), döngüsü = 31). Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57191/57191mov1.jpg"> Takıma giren film 1. PBS karşılaştırılması karşı tedavi LPS Karaciğer karaciğer tedavi. İki farklı koşullarda açık fark de görülmektedir. LPS tedavi karaciğer, nötrofil sayısı önemli ölçüde artırılır ve motilite azalır. Koşulların her ikisi de filmde kararlılığını görülmektedir. Kan akımı Texas kırmızı dextran ile etiketlenir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/Movie_1.avi" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver at JoVE.com

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Bir roman cerrahi protokol İki fotonlu görüntüleme en az invaze olan canlı fare karaciğer için kurduk. Bu teknik ile karaciğer detaylı yapısını lipopolysaccharide kaynaklı endotoksemi sırasında tespit. Biz bu yöntemi hepatik lökosit göç için çeşitli reaktifler tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılması gereken tahmin.

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

two-photon-intravital-imaging-leukocytes-during-immune-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Görüntüleme.  Yonsei University College of Medicine. Bir roman cerrahi protokol İki fotonlu görüntüleme en az invaze olan canlı fare karaciğer için kurduk. Bu teknik ile karaciğer detaylı yapısını lipopolysaccharide kaynaklı endotoksemi sırasında tespit. Biz bu yöntemi hepatik lökosit göç için çeşitli reaktifler tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılması gereken tahmin.

Video: Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve antiparaziter İmmün Yanıt

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...