Questa ricerca è stata finanziata dal National Science Foundation Award numero 1237969, "Dipanare l'eterozigosi, composizione allelica e variazione numero di copia della patata" e USDA speciale Grant 2014-34141-22266 (University of Maine) a RV.

Nota: È importante includere i controlli appropriati, solitamente sotto forma di tessuto fogliare della ploidia stesso come campioni sperimentali. Questo è perché il picco di 2C di campioni di tuberi può essere piccoli e difficili da identificare.
1. preparati
Nota: Le soluzioni elencate qui possono essere preparate prima del tempo e conservate a 4 ° C, ma quelli presentati nei passaggi successivi deve essere fatta fresche il giorno di utilizzo.
<ol><li>Rendere un appropriato volume della soluzione di incubazione Plasmolisi (PIS) (15 mL/campione): 0,55 M mannitolo, 2mm CaCl2, 1mm KH2PO4, 1mm MgCl2, 50 mM Tris tampone a pH 7,5 (regolato con HCl).</li>
	<li>Rendere un appropriato volume della soluzione di lavaggio Plasmolisi (PWS) (15 mL/campione) che è identico al PIS tranne aggiunta di 0,71 M mannitolo.</li>
	<li>Fare 250 mL di flusso Cytometry Buffer11 (FCB di Galbraith modificate): 13,6 mM sodio citrato (trisodico), MOPS di 8 mM, 18 mM MgCl2, 0,4% v/v Triton X-100. Agitare per almeno 30 min distribuire il X-100 Triton.</li>
	<li>Filtro sterilizzare PIS e PWS soluzioni con un filtro di 0,22 µm asimmetrica in polietersulfone (aPES). Utilizzare unità di filtrazione sotto vuoto guidato.</li>
	<li>
Preparare 106 µm filtri a rete per lisato protoplasti. Preparare 1,5 mL microcentrifuga che può direttamente essere annidate in tubi di raccolta, tuttavia può essere utilizzato qualsiasi metodo di sospensioni di passaggio attraverso un filtro di 106 µm. Nota: Questi non devono essere sterili.<ol>
<li>Se utilizzando provette per microcentrifuga da 1,5 mL, tagliare 1 cm la punta ogni tubo del microcentrifuge. Utilizzando una piastra calda o altri calore di fonte di calore un 1 cm2 pezzo 106 µm in acciaio maglia su un pezzo di carta stagnola. Premere l'estremità tagliata del tubo nella maglia fino a quando essi si sono fusi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le patate da campionare, rimuovendo tutto il suolo e detriti. Nota: Età e dimensione del tubero deve essere appropriate per gli obiettivi dell'esperimento, ma non sembrano influenzare la qualità dei risultati. Abbiamo applicato con successo questo protocollo ai tuberi che sono stati in celle frigorifere (4 ° C, 95% RH) fino a 8 mesi. Mentre tuberi con difetti (ad es. tubero marciume, cava di cuore, zone necrotiche marroni) possono essere reattivi, essi dovrebbero essere evitati, se possibile.</li>
</ol>2. giorno 1: Plasmolyze tessuto di tuberi
Nota: I campioni di foglia di controllo possono essere inclusi qui per produrre i protoplasti o al punto 5.2 se preparazioni grezze sono preferiti. Questa deve essere eseguita con strumenti sterili, in un ambiente asettico come una cappa a flusso laminare.
<ol><li>Superficie sterilizzare tuberi di patata tramite immersione in etanolo di 75% per almeno 5 min.</li>
	<li>Rimuovere i tuberi da etanolo e lasciare asciugare all'aria. Questo di solito prende ~ 5 min, più a lungo se il tubero è maggiore di 100 g.</li>
	<li>Preparare e provette coniche da etichetta sterile 50 mL per ogni campione e aliquota 15 mL di filtro sterilizzato PIS in ciascuno.</li>
	<li>
Campione di circa 1 cm3 del tessuto desiderato da tuberi sterilizzati mediante bisturi sterilizzato o trivellatore di sughero. Nota: A seconda del tessuto campionato si può usare un trivellatore di sughero sterilizzato o un coltello/bisturi. Per esempio, se il midollo è desiderato il trivellatore di sughero può essere utilizzati per prendere un nucleo da apicale all'estremità distale del tubero e la frazione centrale del nucleo si può campionare. Tuttavia, a causa della morfologia interna asimmetrica di tuberi di patata, può essere più preciso di parenchima campione o corteccia di dimezzare il tubero e asportando il tessuto desiderato. Vedere la Figura 1 per una rappresentazione della morfologia interna tubero.<ol>
<li>Tritare grossolanamente tessuto usando un bisturi sterilizzato in circa 3 mm3 pezzi e trasferimento del tessuto a tubo conico contenente PIS. Incubare per una notte a 4 ° C. Nota: Si tratta di massimizzare la superficie affinché il PIS, e più tardi la soluzione di enzima, completamente può permeare il tessuto con conseguente digestione più completa.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> Figura 1: morfologia interna di un tubero di patata. La separazione tra midollo (P) e perimidollari parenchima (PM) è illustrata con linee nere. Anello vascolare, che separa il parenchima dalla corteccia (C) viene indicata con una freccia nera. La fine stolone (S) e il tubero gli occhi (E) sono etichettati come bene. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. giorno 2: Generare protoplasti di patate
Nota: Questo deve essere eseguito con strumenti sterili, in un ambiente asettico come una cappa a flusso laminare.
<ol><li>Preparare e filtro (filtro di scimmie 0,45 µm) un quantitativo adeguato della soluzione di enzima (ES) (10 mL/campione): 0,71 M mannitolo, 3 mM CaCl2, 1mm KH2PO4, 1mm MgCl2, cellulasi Onozuka R-10 4%, 0.8% macerozyme R-10, hemicululase 1%, 10 tampone MES mM, pH 5,8. Garantire che filtri appropriati vengono utilizzati in questo passaggio; filtri con pori di dimensione inferiore a 0,45 µm sono inclini a intasamento mentre una membrana di associazione povera in proteine, come scimmie, minimizza la perdita dell'enzima durante la filtrazione.</li>
	<li>Aspirate fuori PIS da campioni in provette coniche utilizzando una pipetta sterile e sierologica.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di ES a ciascun campione e invertire 2 – 3 volte.</li>
	<li>Incubare i campioni durante la notte a 29 ° C con agitazione orizzontale 180 giri/min. Incubare i campioni per almeno 16 h.</li>
</ol>4. giorno 3: Harvest protoplasti e lavaggio protoplasti
Nota: In condizioni asettiche sono no lunghi necessari a questo punto.
<ol><li>Rimuovere i campioni da shaker e permettere loro di stabilirsi per ~ 10 min.</li>
	<li>
Aspirate fuori tanto della soluzione ES come possibile.
	<ol>
<li>Rimuovere la maggior quantità di soluzione ES come fattibile con una pipetta sierologica, avendo cura di evitare di rimuovere il tessuto digerito.</li>
		<li>Utilizzando una micropipetta, rimuovere eventuali residui di soluzione ES, evitando nuovamente il tessuto digerito. Ciò avviene più facilmente da tenendo il tubo ad angolo in modo che la soluzione ES fluisce verso il coperchio mentre il tessuto digerito rimane nella parte inferiore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 15 mL di PWS per ogni campione e invertire delicatamente 2 – 3 volte. Permettono di protoplasti di stabilirsi per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere PWS con una pipetta sierologica. Utilizzare una micropipetta per rimuovere il liquido rimanente. Nota: Questo passaggio è assolutamente fondamentale per garantire l'integrità dei nuclei del campione durante la citometria a flusso. Risoluzione dei problemi, questo passaggio è stato trovato per essere la fonte più probabile di guasto in un campione.</li>
</ol>5. giorno 3: Preparare i campioni per citometria a flusso
Nota: I campioni devono essere tenuti sul ghiaccio da qui se non specificato diversamente.
<ol><li>Preparare soluzioni RNasi e ioduro di propidio (0,4 mg propidio ioduro/mL FCB) (0,8 mg RNasi A / mL FCB) sciogliendo ciascuno in FCB. Attenzione: Ioduro di propidio è altamente tossico. Evitare il contatto con la pelle o gli occhi. Indossare appropriati PPE.</li>
	<li>
Aggiungere 1,5 mL di ghiaccio freddo FCB per ogni campione. Brevemente agitare o vortex ciascun campione per spezzare aggregati dei tessuti. È importante rompere i grumi di tessuto di tubero affinché il FCB completamente può permeare le cellule e i nuclei di rilascio. Diversi campioni possono richiedere più o meno agitazione a seconda del tessuto e del genotipo. Nota: Il FCB Lisi i protoplasti, rilasciando i nuclei. Da qui la necessità di mantenere i campioni sul ghiaccio per prevenire il degrado.<ol>
<li>Se esempi di citometria a flusso di controllo non sono stati inclusi nel passaggio di generazione di protoplasti possono essere inclusi qui. Se un controllo deve essere aggiunto, tritare finemente una piccola foglia (~ 3 cm2) in 1,5 mL di ghiaccio freddo FCB utilizzando una lama di rasoio. Campioni di controllo dovrebbero essere la stessa ploidia dei campioni sperimentali, preferibilmente lo stesso genotipo. In vitro piantine tendono a dare picchi di pulitore di serra o piante coltivate in campo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passare 1 mL della sospensione FCB/tessuto attraverso un filtro a maglia 106 µm. Utilizzare un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL con la punta tagliata e maglia metallica fusa a fondo come descritto al punto 1.5.1. Questo tubo del microcentrifuge può essere nidificato direttamente in una provetta da microcentrifuga da 2 mL e il campione passare direttamente attraverso. Se si utilizza un altro metodo di filtrazione, il filtrato può essere raccolto in una piastra di Petri ghiacciata e poi trasferito in una provetta da 2 mL. Nota: a volte i restanti aggregati e detriti cellulari possono intasare il filtro a rete. In questo caso, è sufficiente toccare la microcentrifuga nidificato due un paio di volte per rimuovere i detriti.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l della soluzione RNasi a ciascun campione. Capovolgere e incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA). Nota: Questo passaggio è destinato a rimuovere il RNA dai campioni, che conduce a meno rumore durante la citometria a flusso. Tuttavia, come i nuclei sono di breve durati, i ricercatori possono decidere di ridurre il tempo di incubazione o eseguirla sul ghiaccio se si verificano gravi riduzione dei loro campioni.</li>
	<li>Aggiungere 125 µ l di soluzione di ioduro di propidio per ogni campione. Capovolgere e incubare in ghiaccio per 30 min. Nota: I campioni devono essere utilizzati per citometria a flusso più presto possibile, come il degrado è evidente entro 2 h, anche su ghiaccio.</li>
</ol>6. giorno 3: Flusso Cytometry di Nuclei di tubero di patata
Nota: Software e funzionamento citometro a flusso variano a seconda dello strumento e del produttore. Istruzioni dettagliate per il funzionamento specifico del citofluorimetro è prevista nel manuale utente dello strumento.
<ol><li>Creare due appezzamenti di dot utilizzando la scala logaritmica di forward scatter vs side scatter e dispersione laterale di propidio ioduro (PI) vs. Anche creare un istogramma con PI sull'asse x. Scala logaritmica è necessaria per garantire a che tutti gli eventi sono all'interno di scala come i nuclei possono differire notevolmente in fluorescenza.</li>
	<li>
Caricare una provetta del campione di controllo conosciuto e regolare la tensione in modo che tutti gli eventi sono su scala. Usiamo il tessuto fogliare in vitro da un genotipo di campione. Se i campioni di diversi Ploidie devono essere eseguiti, un campione di controllo per ciascuna deve essere incluso.
	<ol>
<li>Prendere nota del canale del picco 2C del campione di controllo. I picchi di 2C dei campioni sperimentali dovrebbero cadere nella stessa posizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caricare un campione sperimentale (tubero) e ancora assicurarsi che tutti gli eventi sono su scala. Se le regolazioni sono necessarie, ripetere passo 6.2 per identificare il canale 2 c picchi.</li>
	<li>Manualmente i nuclei di protoplasti utilizzando la dispersione del vs PI lato del cancello.</li>
	<li>Impostare l'istogramma di PI per mostrare solo la regione di nuclei di protoplasti gated.</li>
	<li>Raccogliere il numero desiderato di eventi di ogni campione. I ricercatori utilizzano frequentemente 10.000 eventi gated per citometria a flusso; Tuttavia utilizziamo 2.000 eventi per i campioni di protoplasti di tubero per ospitare più campioni e campioni con concentrazioni basse.</li>
	<li>Calcolare EI di ogni campione dagli istogrammi di PI utilizzando la seguente formula: EI =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> dove 4C è la percentuale di nuclei che sono 4C (che rappresenta un singolo round di endoreduplicazione), 8C è la percentuale che sono 8C e così via. Vedere Figura 4 per esempi di istogrammi e C-valori delle cime.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wilson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The karyoplasmic ratio. 727, (1925).</li><li>Szymanski, D. B., Marks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLABROUS1+overexpression+and+TRIPTYCHON+alter+the+cell+cycle+and+trichome+cell+fate+in+Arabidopsis.">GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).</li><li>Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+endopolyploidy+and+cell+size+in+epidermal+tissue+of+Arabidopsis.">Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).</li><li>Grafi, G., Larkins, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+in+maize+endosperm:+involvement+of+M+phase--promoting+factor+inhibition+and+induction+of+S+phase--related+kinases.">Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases.</a> Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).</li><li>Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+maize+endosperm+development+and+DNA+endoreduplication.">Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication.</a> Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+tuber+cell+division+and+growth+to+shade+and+elevated+CO2.">Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2.</a> Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+dry+matter+assimilation+and+partitioning+to+elevated+CO2+at+various+stages+of+tuber+initiation+and+growth.">Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth.</a> Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).</li><li>Cheniclet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+expansion+and+endoreduplication+show+a+large+genetic+variability+in+pericarp+and+contribute+strongly+to+tomato+fruit+growth.">Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth.</a> Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).</li><li>Pirrello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fruit+developmental+biology+makes+use+of+flow+cytometry+approaches.">How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).</li><li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+and+fruit+growth+in+tomato:+evidence+in+favour+of+the+karyoplasmic+ratio+theory.">Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory.</a> J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).</li><li>Galbraith, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+analysis+of+the+cell+cycle+in+intact+plant+tissues.">Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues.</a> Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).</li><li>Dole&#382;el, J., Greilhuber, J., Suda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+with+Plants:+An+Overview.">Flow Cytometry with Plants: An Overview.</a> Flow Cytometry with Plant Cells. , 41-65 (2007).</li><li>Dole&#382;el, J., Barto&#353;, J. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+DNA+flow+cytometry+and+estimation+of+nuclear+genome+size.">Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size.</a> Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyphal+wall+components+from+Phytophthora+infestans+on+protoplasts+of+potato+tuber+tissues.">Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).</li><li>Davis, D. A., Currier, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+phytoalexin+elicitors,+arachidonic+and+eicosapentaenoic+acids,+and+other+unsaturated+fatty+acids+on+potato+tuber+protoplasts.">The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).</li><li>Laimbeer, F. P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplast+isolation+prior+to+flow+cytometry+reveals+clear+patterns+of+endoreduplication+in+potato+tubers,+related+species,+and+some+starchy+root+crops.">Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops.</a> Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).</li><li>Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+potato+monohaploids+(2n=x=12)+through+prickle+pollination.">Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination.</a> Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).</li><li>Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+doubling+in+monohaploid+and+dihaploid+potatoes+by+regeneration+from+cultured+leaf+explants.">Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants.</a> Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).</li><li>Doke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+anion+by+potato+tuber+protoplasts+during+the+hypersensitive+response+to+hyphal+wall+components+of+Phytophthora+infestans+and+specific+inhibition+of+the+reaction+by+suppressors+of+hypersensitivity.">Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity.</a> Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+the+hypersensitive+response+of+potato+tuber+protoplasts+to+hyphal+wall+components+by+water+soluble+glucans+isolated+from+Phytophthora+infestans.">Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).</li><li>Saxena, P. K., King, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reuse+of+enzymes+for+isolation+of+protoplasts.">Reuse of enzymes for isolation of protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).</li><li>Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+and+flow+cytometry+of+4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole+(DAPI)-stained+suspensions+of+nuclei+released+from+fresh+and+fixed+tissues+of+plants.">Cytometry and flow cytometry of 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants.</a> Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).</li><li>Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cell+culture.">Tissue and cell culture.</a> Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , 39-50 (2013).</li><li>Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasts+as+Vehicles+for+Plant+Propagation+and+Improvement.">Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement.</a> Advances in Cell Culture. 1, 241-279 (1981).</li><li>Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchyma+cell+growth+in+potato+tubers+I.+Different+tuber+regions.">Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions.</a> Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).</li><li>Scholes, D. R., Paige, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+ploidy:+a+generalized+response+to+stress.">Plasticity in ploidy: a generalized response to stress.</a> Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Il protocollo presentato qui fornisce i ricercatori con un mezzo per valutare endoreduplicazione all'interno di tuberi di patata, cui cellulare modificate contenuti e una maggiore dimensione della cellula apparentemente precludono altre preparazioni di citometria a flusso. Il protocollo si basa sulla generazione di protoplasti come mezzo per ridurre il rumore e detriti mantenendo integrità nucleare. In precedenza, i ricercatori hanno descritto preparazioni simili per campioni di cytometry di flusso particolarmente recalcitranti come pure utilizzato protoplasti di tubero per studiare una varietà di argomenti quali la patogenesi19,20. Tuttavia, a nostra conoscenza, nessuno hanno combinato l'uso di tali protoplasti di tubero con citometria a flusso per lo studio endoreduplicazione. Inoltre, abbiamo trovato l'uso dei protoplasti di essere più affidabile di tipiche preparazioni grezze come pure la tecnica utilizzata in due solo altri studi per valutare il tubero endoreduplicazione6,7. Qui discutiamo le carenze del protocollo, trabocchetti potenziali nella sua esecuzione e preparazione di campioni e risultati di un esperimento tipico che si impiega.
Nonostante l'utilità e la ripetibilità del protocollo tubero flusso cytometry, ha alcuni punti deboli che devono essere discussi. Per cominciare, il protocollo è tempo intensivo, che richiede due incubazioni overnight. Il protocollo prevede inoltre che alcuni reagenti costosi, in particolare la cellulasi e macerozyme. Inoltre, i preparativi sono altamente sensibili al fattore tempo, degradante entro poche ore, che possono limitare la velocità effettiva in un solo giorno, soprattutto se molti eventi sono desiderati. Infine, il protocollo, mentre affidabile, è sensibile a errori all'interno di preparazione del campione che sembrano causare danni ai nuclei e risultati di qualità inferiore. Ad esempio, la contaminazione microbica può verificarsi durante le fasi di generazione Plasmolisi e protoplasti (1 – 3.4) a causa di impropria tecnica asettica. Contaminazione del campione, mentre non sempre che preclude il successo di un campione, sembra diminuire drasticamente la qualità di istogrammi ottenuti, ancora una volta probabilmente dovuto ai danni dei nuclei.
Come affermato in precedenza, gli svantaggi principali del protocollo sono costi, tempo e sensibilità agli errori. I ricercatori potrebbero desiderare di prendere provvedimenti per attenuare ciascuno di questi. Per quanto riguarda il costo, i ricercatori intendono applicare il protocollo di molti campioni possono considerare modificando le concentrazioni negli enzimi e/o la durata della fase di digestione come tessuti differenti e genotipi possono variare nella capacità di risposta. Questo include la possibilità di filtraggio e riciclo l'ES che precedentemente è stata dimostrata ma non impiegato qui21. Per quanto riguarda il tempo, nella nostra osservazione, è possibile erogare con la prima incubazione (il passo di Plasmolisi) e ancora estrarre protoplasti; Tuttavia, l'integrità e la abbondanza soffrirà, che impatti negativamente i risultati. Per ridurre il deterioramento dei campioni i ricercatori possono considerare che alcuni approcci di citometria a flusso implicano l'uso di fissativi (ad es. formaldeide) per preservare l'integrità di esempio22. Questo può essere un mezzo utile per impedire il deterioramento sia consentire per esempio deposito piuttosto che del protoplasto concussione e flusso cytometry che accade lo stesso giorno come presentato. Un altro mezzo per prevenire il logorio dei nuclei potrebbe essere di includere un inibitore di nucleasi dell'ES e/o FBC; mentre 2-mercaptoetanolo non effettuato nessun cambiamenti notevoli durante lo sviluppo, altri inibitori non sono stati testati nel presente documento.
Nella nostra osservazione, la singola fase più critica è passo 4.4, la rimozione di tutte le soluzione di lavaggio Plasmolisi prima dell'aggiunta del buffer di citometria a flusso (FCB). Se anche un piccolo volume (< 10 µ l) resti, i campioni sono molto più propensi a essere degradato che può condurre ad un campione di povero o addirittura non riuscito. Ciò è probabilmente dovuto le impurità all'interno della soluzione di enzima (ad es. nucleasi, proteasi)23,24 che degradano rapidamente i nuclei durante i periodi di incubazione e il tempo tra le esecuzioni di campione, anche a basse concentrazioni. Un'altra considerazione importante è la durata delle fasi di incubazione PI e RNasi. Come indicato nel protocollo, i campioni non rimangono stabili per più di un paio d'ore dopo aggiunta del FCB così i ricercatori possono decidere di ridurre la durata di questi passi per ospitare ulteriori campioni o citometria a flusso lunga esecuzione derivanti dai nuclei Bassi concentrazioni. Questo richiede anche il ricercatore a considerare il compromesso tra il numero di eventi al campione e il numero totale di campioni da essere eseguito o considerare l'uso di fissativi come accennato in precedenza.
Differenze tra genotipi e tessuti
Per fornire rappresentante risultati del protocollo abbiamo progettato due semplici esperimenti per confermare la variazione precedentemente segnalati dal tessuto ed esaminare l'influenza della ploidia e genotipo. I risultati dell'esperimento tessuto dimostrano che il protocollo produce risultati riproducibili, come tessuto di midollo ancora una volta è stato trovato per avere il più alto EI. Abbastanza sorprendentemente tessuto di parenchima, che non era stata precedentemente valutato, ha avuto un valore EI simile a tessuto corticale e significativamente più basso di midollo. Questo è stato imprevisto come le cellule parenchima sono in genere più grande o di midollo o di cellule corticali, almeno a maturità. Una possibile spiegazione è che i tuberi (90 – 130 g) erano troppo immaturi per le cellule del parenchima, che costituiscono la maggior parte del volume di tubero a maturità, per completamente ampliato e ha raggiunto il loro massimo C-valori25. Questo potrebbe anche spiegare perché il dihaploid (VT_SUP_19) e il dihaploid raddoppiato (VT_SUP_19 x 4) dimostrato significativamente maggiore EI di tuberi Superior CV; mentre tuberi di approssimativamente uguali dimensioni sono state campionate da ciascun genotipo, la dimensione massima dei tuberi da VT_SUP_19 o il tetraploide isogeniche è molto più piccola di quella del progenitore. Pertanto, potrebbe essere che essi visualizzati maggiore EI semplicemente perché erano più grandi rispetto alla loro dimensione massima raggiungibile. In alternativa, la differenza può essere una conseguenza del complemento genetico che vt_sup_19 ricevuto dal suo progenitore tetraploide. Un'altra possibilità è che la riduzione di genomica che si sono verificati sull'estrazione della dihaploid dalla tetraploide può hanno smascherato alleli deleteri conseguente sforzo di tutto l'impianto, che ha anche dimostrato di contribuire a elevata EI26. Tuttavia, ciò dimostra che i ricercatori di attenta considerazione devono impiegare quando si seleziona tuberi e tessuti da utilizzare per il confronto dei valori EI, soprattutto fra i genotipi.
Applicazioni future
Il protocollo descritto in questo articolo fornisce ai ricercatori uno strumento importante per comprensione endoreduplicazione nella patata. Può consentire per studi nei componenti genetiche ed ambientali di endoreduplicazione, il corso di tempo di sviluppo attraverso tessuti tubero e valutazione della variazione naturale. In definitiva, endoreduplicazione può rendere un bersaglio promettente per miglioramento di patate, un'impresa che richiederà un mezzo affidabile di valutazione.

Endoreduplicazione è il processo mediante il quale una cella rinuncia il tipico ciclo cellulare e subisce invece un corso alternativo di sviluppo costituito da ripetuti cicli di replicazione del DNA senza divisione cellulare. La cella risultante avrà un aumento del DNA dimensione contenuto e nucleare, che è pensato per svolgere un ruolo nella regolazione cellulare, espansione e specializzazione. Generalmente, un giro di endoreduplicazione (chiamato un endocycle) e il corrispondente aumento nel contenuto di DNA sono associati con più grande volume di cella, un'osservazione che ha precipitato la "teoria karyoplasmic" che ha aumentato il contenuto di DNA è necessario correttamente regolano una più grande, forse più complesso, cella1. Questo fenomeno è comune nelle piante superiori, avendo osservati in una gamma di tessuti, compresi quelli con strutturale/difensivo (tricomi)2,3, nutritiva (mais endosperma)4,5e lavandino/memorizzazione ( pericarpo di pomodoro; funzioni di tubero di patata)6,7,8 . Nel frutto, è stato suggerito che endoreduplicazione svolge un ruolo nel facilitare la rapida espansione del pericarpo, come dimostra la relazione negativa tra periodo inerente allo sviluppo endoreduplicazione e frutta per9. Per esempio le cellule con DNA contenuto fino a 512C (512 volte il genoma aploide) sono stati osservati nel pericarpo pomodoro8. Inoltre Chevalier et al (2014) hanno dimostrato che le alterazioni nell'espressione dei geni del ciclo cellulare possono condurre agli aumenti nei livelli endoreduplicazione entro il pericarpo che poi si traduce in più grande frutta10. Alterazione di geni promuovendo endoreduplicazione fornisce quindi un potenziale bersaglio per miglioramento della biomassa o resa attraverso allevamento vegetale o la manipolazione genetica. Tuttavia, tale miglioramento è subordinato a una maggiore comprensione delle cause e conseguenze della endoreduplicazione.
Endoreduplicazione è più spesso misurati tramite flusso cytometry per cui nuclei, rilasciati in tessuto greggio preparazioni11, sono incubati con un fluoroforo legante il DNA, come ad esempio propidio ioduro12 (PI). I campioni filtrati vengono quindi passati dal laser di un citometro a flusso, dove possa essere osservati lunghezze d'onda di emissione specifici per il fluoroforo. L'intensità di fluorescenza in ogni evento (cioè, nucleo) è direttamente correlata con il contenuto di DNA della particella. Pertanto, confrontando a uno standard conosciuto, può essere calcolato il contenuto di DNA relativo e assoluto delle celle in un dato campione. Endoreduplicazione indici (EI) sono determinati stabilendo il numero medio di endocycles per cella all'interno di un campione osservando il contenuto di DNA cellulare (C-valore) dove 1C è il contenuto di DNA di una cellula aploide (formula presentata nel passaggio 6.7 del protocollo). Per esempio, in un organismo diploide, contenuto di base del DNA delle cellule somatiche è 2 C. Se un campione ha poche cellule con 4C, corrispondente a un singolo round di endoreduplicazione o maggiore avrebbe un EI vicino a 0; Tuttavia se quasi tutte le cellule sono 4C EI sarebbe circa 1. Tuttavia, come più Arrotonda di endoreduplicazione è comuni a più alti valori osservati di EI piante può essere molto maggiore. Durante il calcolo di indici endoreduplicazione può essere relativamente semplice, che richiede che le abbondanze relative dei nuclei C-valori essere attendibilmente accertato, che è precluso in determinate specie e tessuti (tra cui tuberi di patata). È probabile che le differenze nella composizione di anatomia, chimica o parete cellulare cellulare13 causano questi campioni ad essere recalcitrante ai tipici preparati utilizzando una lama di rasoio per rilasciare i nuclei direttamente nel buffer appropriato che sono comunemente usati con tessuti come pericarpo di pomodoro, un modello per endoreduplicazione studi8.
Patata, l'esame della endoreduplicazione entro il tubero rimane limitata agli studi solo un paio, forse dovuti in parte alla mancanza di un protocollo affidabile come il sopraccennato preparazioni grezze producono risultati incoerenti. Mentre tali approcci funzionano bene per foglie i campioni di tubero esperienza grave degrado e un'abbondanza di rumore sotto forma di detriti, rendendo la differenziazione delle cime composto da nuclei con differenti valori di C quasi impossibili. Questo è forse dovuto le differenze nella composizione cellulare e una profusione di detriti cellulari all'interno delle cellule di tubero (ad es. amido-immagazzinare amiloplasti). Per superare questo ostacolo, recentemente abbiamo sviluppato un protocollo più affidabile per l'acquisizione di picchi distinguibili in citometria a flusso di tuberi di patata. La frequenza delle cellule all'interno di ogni picco quindi può essere utilizzata per il calcolo accurato endoreduplicazione livelli per genotipi diversi o diversi tessuti che compongono un tubero. Il protocollo, che impiega un antecedente di15 14,di protoplasti modificate estrazione metodo descritto in precedenza flusso cytometry11, ha mostrato una notevole variazione all'interno di parenti di patata, cultivar e tessuti16 . Qui vi presentiamo il protocollo nel dettaglio valutando EI in contesti di ploidia, tessuto e dimensione del tubero.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10k</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid XP (autopipettor)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.22&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>564-0020</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.45&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>172590250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>194854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (hexahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423922500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>17263-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borers with punch</td>
			<td>American Scientific</td>
			<td>2093-02</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-31</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-920B</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>106um stainless steel mesh or other seive of same pore size</td>
			<td>New Jersey Wire Mesh Co.</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts

Endoreduplicazione, la replicazione del genoma nucleare di una cellula senza citochinesi successiva, produce cellule con maggiore contenuto di DNA ed è associato con specializzazione, lo sviluppo e l'aumento nella dimensione del cellulare. Nelle piante, endoreduplicazione sembra facilitare la crescita e l'espansione di determinati tessuti e organi. Fra loro è il tubero di patata (Solanum tuberosum), che subisce una notevole espansione cellulare nell'adempiere la sua funzione di deposito di carboidrati. Così, endoreduplicazione può svolgere un ruolo importante in quanto sono in grado di ospitare questa abbondanza di carbonio tuberi. Tuttavia, i detriti cellulari derivanti da metodi di isolamento nucleare grezza di tuberi, metodi che possono essere utilizzati efficacemente con foglie, preclude la stima dell'indice endoreduplicazione tubero (EI). Questo articolo presenta una tecnica per la valutazione endoreduplicazione tubero attraverso l'isolamento di protoplasti mentre dimostrando risultati rappresentativi ottenuti da diversi genotipi e compartimenti stagni tessuti tubero. Le principali limitazioni del protocollo sono i costi di tempo e reagenti necessari per la preparazione del campione, come pure la durata relativamente breve dei campioni dopo la lisi dei protoplasti. Mentre il protocollo è sensibile alla variazione di tecnica, rappresenta un miglioramento rispetto ai tradizionali metodi di isolamento nucleare da queste grandi cellule specializzate. Possibilità di miglioramenti al protocollo come riciclaggio degli enzimi, l'uso di fissativi e altre alterazioni sono proposti.

Produzione dei protoplasti
La generazione dei protoplasti è necessaria per conseguire risultati di citometria a flusso ripetibile da tuberi di patata, la morfologia generale dei quali viene visualizzata in Figura 1. I ricercatori potrebbero voler garantire protoplasti di alta qualità sono state prodotte prima dell'aggiunta di FCP, soprattutto nel caso in cui è necessaria la risoluzione dei problemi. La maggior parte dei protoplasti dovrebbe essere sferica con minime sporgenze (Figura 2) e può differire notevolmente in dimensioni, che forse sono riflettente delle differenze in EI.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> Figura 2: rappresentante protoplasti del tubero e della foglia, acquistati presso passo 4.4 del protocollo. Protoplasti isolati dovrebbero essere sferica e simmetrica con membrana plasmatica intatta. Si noti la differenza di dimensioni tra foglia (A-C) e protoplasti di tubero (D, E), nonché le differenze nella dimensione all'interno di un tessuto che può indicare diversi livelli di endoreduplicazione. Protoplasti foglia contengono cloroplasti mentre amiloplasti sono visibili all'interno i protoplasti di tubero. Scala bar = 1.000 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Valutazione dei risultati di citometria a flusso
Il successo o il fallimento di un esperimento può essere desunta dalla larghezza dei picchi e la loro separazione negli istogrammi di citometria a flusso. Come misura endoreduplicazione richiede un calcolo relativa abbondanza dei nuclei in ogni picco, mera presenza o assenza di picchi è insufficiente se c'è troppo rumore per disegnare i confini significativi tra di loro. Figura 3 Visualizza la variazione nei risultati i ricercatori possono verificarsi sia nel flusso cytometry grafici a dispersione e istogrammi. Possibili cause per campioni non riusciti sono presentate nella discussione.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> Figura 3: risultati rappresentativi ottenuti da citometria a flusso dei nuclei di protoplasti di intatto e degradato campioni di midollo. Nuclei intatti (A) mostrano la netta separazione tra i picchi di quantificare l'abbondanza relativa delle cellule in ogni utilizzando il software appropriato, mentre picchi nei campioni degradati (B) Visualizza basi spostate, vasta e sovrapposte. In scatterplot intatto (C) e degradate (D) campioni, scatole nere indicano evento nucleare gating per istogrammi e il raggruppamento degli eventi si riflette nella larghezza dei picchi istogramma. Eventi fuori dai cancelli indicano detriti, i nuclei gravemente degradati o altri aggregati. PI-H corrisponde all'intensità della fluorescenza che viene misurata in unità arbitrarie. Metodi di risoluzione dei problemi per prevenire il degrado del campione sono discussi all'interno del testo. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Endoreduplicazione differenze tra tessuti
Precedentemente abbiamo segnalato che tessuto di midollo di tuberi ha livelli significativamente maggiori di endoreduplicazione di corteccia tessuto16. Per confermare ed espandere su questo abbiamo guardato endoreduplicazione livelli di tre diversi tessuti in CV. Superior: midollo, parenchima perimidollari e corteccia, replicato in triplice copia con 2.000 eventi gated per campione. I nostri risultati hanno confermato la nostra osservazione precedente che tessuto di midollo ha EI significativamente maggiore di tessuto corticale con mezzi di endocycles 1.79 e 1,12 per cella, rispettivamente (p = 0,018; Test t di Student-). Abbastanza sorprendentemente, il tessuto di parenchima ha dimostrato un profilo simile alla corteccia e inoltre era significativamente differente dal tessuto di midollo (dire = 1,14; p = 0,013; Test t di Student-). Questi risultati sono riassunti nella Figura 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> Figura 4: endoreduplicazione in tre tessuti di CV Superior. Gli istogrammi di foglia (A), corteccia di tubero (B), parenchima (C) ed in tessuti di midollo (D) sono mostrati insieme al valore EI calcolato da quelli istogrammi. Differenze in abbondanza relativa dei nuclei che comprende ogni picco sono immediatamente evidenti, soprattutto tra i tessuti del tubero e della foglia. C-valori per ogni picco vengono anche visualizzati. PI-H corrisponde all'intensità della fluorescenza che viene misurata in unità arbitrarie. Dire i confronti di EI tessuti tubero vengono visualizzati in E dove l'asterisco indica differenza significativa (p < 0,05) e barre di errore indicano deviazione standard. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Influenza della dimensione del tubero e della ploidia
Precedentemente abbiamo segnalato che, per un dato genotipo, tuberi di dimensioni diverse ma simili maturità non hanno visualizzato una differenza corrispondente all'EI16. Abbiamo mirato a confermare questo risultato, nonché di valutare la relazione tra ploidia ed endoreduplicazione. Per questo esperimento, abbiamo utilizzato tre replicati del tessuto parenchima da tre diversi genotipi: CV. Superior (4x), VT_SUP_19 (2x) che è un dihaploid estratte da CV. Superior di pungiglione impollinazione17e VT_SUP_19 x 4 che è un dihaploid raddoppiato 18 isogeniche per VT_SUP_19. Abbiamo incluso un set di repliche per grandi (90 – 130 g) e piccole (< 35 g) tuberi per CV Superior mentre tuberi per gli altri due genotipi erano 90 – 130 g. I tuberi sono stati tutti raccolti dalla serra piante coltivate a piena maturità, cioè le cime delle piante avevano senesced. Abbiamo osservato una differenza significativa tra il VT_SUP_19 e il suo progenitore Superior (p = 0,04); Tuttavia, non c'era differenza significativa tra VT_SUP_19 e VT_SUP_19 x 4 (p = 0,69). Questo indica che mentre c'è una componente genetica probabile a endoreduplicazione, come smascherato dalla riduzione genomica, esso non è dettato dalla ploidia, almeno in questo sfondo. Infine, abbiamo ancora una volta non osservato nessuna differenza significativa tra grandi e piccoli CV. Superior tuberi come dimostrato nella Figura 5.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> Figura 5: endoreduplicazione in due dimensioni di tuberi CV. Superior diploide (VT_Sup_19) e tetraploide (VT_Sup_19 x 4) derivati. Il grafico a barre Mostra la media per le piccole (< 35g) e tuberi superiore di grandi dimensioni (90 – 130 g) CV, nonché tuberi di grandi dimensioni (90 – 130 g) di dihaploid VT_SUP_19 e il dihaploid raddoppiato isogeniche VT_SUP_19 4x. Differenze significative (p < 0,05) sono indicati nella relazione di lettera comunicanti. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplicazione tramite flusso Cytometry di tubero isolato protoplasti di misura

Il protocollo descritto nel presente documento è un metodo per la misurazione endoreduplicazione all'interno di tuberi di patata (Solanum tuberosum). Include passaggi di estrazione Plasmolisi e protoplasti per diminuire il rumore e detriti in analisi cytometric di flusso a valle.

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

measuring-endoreduplication-flow-cytometry-isolated-tuber

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Views.  Virginia Tech. Il protocollo descritto nel presente documento è un metodo per la misurazione endoreduplicazione all'interno di tuberi di patata (Solanum tuberosum). Include passaggi di estrazione Plasmolisi e protoplasti per diminuire il rumore e detriti in analisi cytometric di flusso a valle.

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: Immunoprecipitazione rilevato mediante citometria di flusso

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Thermo flusso LED - La combinazione Optogenetics con citometria a flusso

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...