Esta investigación fue financiada por la nacional Science Foundation Premio número 1237969, "Desenredando el heterocigoto, la composición alélica y variación en número de copias de la papa" y USDA especial beca 2014-34141-22266 (Universidad de Maine) a RV

Nota: Es importante incluir controles adecuados, generalmente en forma de tejido foliar de la misma ploidía como muestras experimentales. Esto es porque el pico de 2C de las muestras del tubérculo puede ser pequeñas y difíciles de identificar.
1. preparaciones
Nota: Las soluciones enumeradas aquí pueden preparadas antes de tiempo y almacenadas a 4 ° C pero las presentadas en los pasos posteriores deben ser frescas en el día de uso.
<ol><li>Hacer un volumen adecuado de solución de incubación plasmólisis (PIS) (15 mL/muestra): 0,55 M manitol, 2 mM CaCl2, 1 m m KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris buffer pH 7,5 (ajustado con ácido clorhídrico).</li>
	<li>Hacer un volumen adecuado de solución de lavado de plasmólisis (PWS) (15 mL/muestra) que es idéntico al PIS a excepción de la adición de 0,71 M manitol.</li>
	<li>Tomar 250 mL de citometría de flujo tampón11 (FCB de modificado Galbraith): 13,6 mM citrato de sodio (trisódico), TRAPEADORES de 8 mM, 18 mM de MgCl2, 0,4% v/v Triton X-100. Agitar durante al menos 30 minutos distribuir el Triton X-100.</li>
	<li>Filtro de esterilizar soluciones de PIS y PWS con un filtro de 0,22 μm asimétrico Polietersulfona (aPES). Usar unidades de filtración por vacío.</li>
	<li>
Preparación de filtros de malla de 106 μm para protoplastos sometidas a lisis. Preparar 1,5 mL tubos de microcentrífuga que pueden anidar directamente en los tubos de colección, sin embargo puede utilizarse cualquier método de suspensiones que pasan a través de un filtro de 106 μm. Nota: Estos no necesitan ser estériles.<ol>
<li>Si utiliza tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, corte 1 cm de la punta de cada tubo de microcentrífuga. Usando una placa caliente u otro calor de fuente de calor un 1 cm2 pieza 106 μm acero malla en un pedazo de papel de aluminio. Presione el extremo cortado del tubo en el acoplamiento hasta que han fusionado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar patatas a degustar, quitando todos los escombros y suelo. Nota: Edad y tamaño deben ser apropiados para los objetivos del experimento pero no parecen afectar la calidad de los resultados. Con éxito hemos aplicado este protocolo a tubérculos que han estado en almacenamiento en frío (4 ° C, 95% HR) hasta a 8 meses. Tubérculos con defectos (por ejemplo tuber fin rot, corazón hueco, áreas necróticas de color marrón) pueden ser sensibles, debe evitar, si es posible.</li>
</ol>2. día 1: Plasmolyze tejido de tubérculo
Nota: Las muestras de hojas de Control se pueden incluir aquí para producir protoplastos o en paso 5.2 si se prefieren los preparados crudos. Esto debe realizarse con instrumentos estériles en un ambiente aséptico como una campana de flujo laminar.
<ol><li>Superficie de esterilizar los tubérculos de patata mediante inmersión en etanol al 75% durante al menos 5 minutos.</li>
	<li>Retirar los tubérculos del etanol y secar al aire. Esto suele ~ 5 min, más si el tubérculo es mayor que 100 g.</li>
	<li>Preparar y tubos cónicos de etiqueta estéril 50 mL para cada muestra y una alícuota 15 mL de filtro esterilización PIS en cada uno.</li>
	<li>
Muestra de aproximadamente 1 cm3 del tejido deseado de tubérculos esterilizadas mediante bisturí esterilizado o perforador del corcho. Nota: Dependiendo del tejido que se muestra se puede usar cuchillo/escalpelo o un perforador del corcho esterilizada. Por ejemplo, si se desea la médula del perforador del corcho puede usarse para tomar una base de la apical al extremo distal del tubérculo y la fracción central del núcleo puede ser muestreada. Sin embargo, debido a la morfología interna asimétrica de tubérculos de patata, puede ser más precisa al parénquima muestra o corteza por reducir a la mitad el tubérculo y extirpando el tejido deseado. Vea la figura 1 para una descripción de la morfología del tubérculo interno.<ol>
<li>Picar tejido con un bisturí esterilizado en aprox. 3 mm3 piezas y transferencia de tejido en tubo cónico que contenga PIS. Incubar durante una noche a 4 ° C. Nota: Esto es para maximizar el área superficial para que el PIS, y más adelante la solución de enzima, puede impregnar completamente el tejido, dando como resultado una digestión más completa.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> Figura 1: morfología interna de un tubérculo de patata. La separación entre el núcleo (P) y parénquima perimedular (PM) está ilustrada con líneas negras. El anillo vascular, que separa el parénquima de la corteza (C) se denota con una flecha negra. El extremo del estolón (S) y ojos del tubérculo (E) se etiquetan así. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. día 2: Generar protoplastos de patata
Nota: Esto debe realizarse con instrumentos estériles en un ambiente aséptico como una campana de flujo laminar.
<ol><li>Preparar y filtro (filtro de 0.45 μm monos) una cantidad apropiada de solución de enzima (ES) (10 mL/muestra): 0,71 M manitol, 3 mM CaCl2, 1 m m KH2PO4, 1 mM MgCl2, celulasa Onozuka R-10 de 4%, 0.8% macerozyme R-10, 1% hemicululase, 10 tampón MES mM, pH 5.8. Garantizar que los filtros adecuados se utilizan en este paso; filtros con poros de tamaño inferior a 0.45 μm son propensos a la obstrucción mientras que una membrana de unión de baja proteína, como simios, minimiza la pérdida de la enzima durante la filtración.</li>
	<li>Aspirar el PIS de las muestras en tubos cónicos con una pipeta serológica estéril.</li>
	<li>Añadir 10 mL de CE para cada muestra e invierta 2 – 3 veces.</li>
	<li>Incubar las muestras durante la noche a 29 ° C con agitación horizontal de 180 rpm. Incubar las muestras durante al menos 16 h.</li>
</ol>4. día 3: Cosecha protoplastos y protoplastos de lavado
Nota: Las condiciones asépticas son no tiempo necesarias en este punto.
<ol><li>Extraer muestras de la coctelera y permitirles reposar aproximadamente 10 minutos.</li>
	<li>
Aspirar apagado como gran parte de la solución ES posible.
	<ol>
<li>Eliminar gran parte de la solución ES posible con una pipeta serológica, teniendo cuidado de evitar quitar el tejido digerido.</li>
		<li>Usando un micropipeta quitar cualquier residuo de la solución ES, otra vez evitando el tejido digerido. Esto se hace más fácilmente manteniendo el tubo en ángulo para que la solución ES fluye hacia la tapa, mientras que el tejido digerido queda en la parte inferior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 15 mL de PWS a cada muestra e inviértalo suavemente 2 a 3 veces. Permiten protoplastos a reposar 10 minutos.</li>
	<li>Quitar PWS con una pipeta serológica. Utilice una micropipeta para quitar cualquier líquido restante. Nota: Este paso es imprescindible para garantizar la integridad de los núcleos de la muestra durante la citometría de flujo. En la resolución de problemas, este paso fue encontrado para ser la fuente más probable de fracaso en una muestra.</li>
</ol>5. día 3: Preparar las muestras para citometría de flujo
Nota: Las muestras deben mantenerse sobre hielo desde aquí a menos que se indique lo contrario.
<ol><li>Preparar soluciones de RNasa y yoduro de propidio (propidio de 0,4 mg yoduro/mL FCB) (Rnasa A 0,8 mg / mL FCB) disolviendo cada uno en FCB. PRECAUCIÓN: El yoduro de propidio es altamente tóxico. Evite el contacto con la piel o los ojos. Usar el EPP adecuado.</li>
	<li>
Añadir 1,5 mL de hielo frío FCB para cada muestra. Brevemente sacudida o vortex cada muestra para romper agregados tejido. Es importante romper los grumos de tejido de tubérculo para que el FCB completamente puede penetrar las células y liberar los núcleos. Diferentes muestras pueden requerir más o menos agitación dependiendo del tejido y el genotipo. Nota: El FCB descompone mediante lisis los protoplastos, liberando los núcleos. Por lo tanto, la necesidad de mantener las muestras en hielo para evitar la degradación.<ol>
<li>Si no se incluyeron muestras de citometría de flujo de control en el paso de generación del protoplasto puede incluir aquí. Si un control debe ser agregado, picar una hoja pequeña (~ 3 cm2) en 1,5 mL de hielo frío FCB usando una cuchilla de afeitar. Muestras de control deben ser el mismo ploidía como las muestras experimentales, preferentemente el mismo genotipo. Plántulas in vitro tienden a dar picos limpiador de efecto invernadero o las plantas de producción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pasar 1 mL de la suspensión FCB y tejidos a través de un filtro de malla 106 μm. Utilizar un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con la punta cortada y malla de metal derretido en la parte inferior como se describe en el paso 1.5.1. Este tubo de microcentrífuga puede anidar directamente en un tubo de microcentrífuga de 2 mL y la muestra pasa directamente a través de. Si utiliza otro método de filtración, el filtrado puede recogido en una placa de Petri helada y luego se transfiere a un tubo de 2 mL. Nota: a veces los restantes agregados y detritos celulares pueden obstruir el filtro de malla. En este caso, basta con pinchar los dos tubos de microcentrífuga anidado un par de veces para desalojar los desechos.</li>
	<li>Añadir 250 μl de la solución de Rnasa a cada muestra. Invierta la placa e incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Nota: Este paso pretende eliminar RNA de las muestras, hacia menos ruido durante la citometría de flujo. Sin embargo, como los núcleos son de breve duración, los investigadores podrán disminuir el tiempo de incubación o realizar en hielo si están experimentando degradación severa de sus muestras.</li>
	<li>Añadir 125 μl de la solución de yoduro de propidio para cada muestra. Invierta la placa e incubar en hielo durante 30 minutos. Nota: Puede usarse muestras para citometría de flujo tan pronto como sea posible mientras que la degradación es evidente dentro de 2 h, incluso en el hielo.</li>
</ol>6. día 3: Citometría de flujo de los núcleos de tubérculo de patata
Nota: Software y operación del citómetro de flujo variará dependiendo del instrumento y el fabricante. Se proporcionarán instrucciones detalladas sobre el funcionamiento específico de la citometría de flujo en Guía del usuario del instrumento.
<ol><li>Crear dos parcelas de punto usando la escala logarítmica de forward scatter vs dispersión de lado y lado de vs (PI) el yoduro de propidio dispersión. También crear un histograma con PI en el eje x. Escala logarítmica es necesaria para que todos los eventos son en escala como núcleos pueden diferir enormemente en fluorescencia.</li>
	<li>
Cargar un tubo de muestra de control conocidos y ajustar la tensión de modo que todos los eventos son a escala. Utilizamos tejido foliar in vitro de un genotipo de muestra. Si ejecutar muestras de ploidías diferentes, debe incluir una muestra control para cada uno.
	<ol>
<li>Tome nota del canal del pico de 2 C en la muestra de control. Los picos de 2C de las muestras experimentales deben caer en el mismo lugar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carga una muestra experimental (tubérculo) y otra vez Asegúrese de que todos los eventos son a escala. Si los ajustes son requeridos, repita paso 6.2 para identificar el canal de C 2 picos.</li>
	<li>Manualmente la puerta los núcleos de protoplasto con la trama de vs PI la dispersión lateral.</li>
	<li>Ajuste del histograma de PI para mostrar sólo la región de los núcleos de protoplasto cerrada.</li>
	<li>Recoger el número de eventos de cada muestra. Con frecuencia los investigadores utilizan 10.000 eventos cerradas para citometría de flujo; sin embargo utilizamos 2.000 eventos para muestras de protoplasto tubérculo para acomodar más muestras y muestras con concentraciones bajas.</li>
	<li>Calcular IE de cada muestra de los histogramas de PI mediante la fórmula siguiente: IE =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> donde el porcentaje de núcleos que son 4C (que representa a una sola ronda de endoreduplication) 4C, 8C es el porcentaje 8C, y así sucesivamente. Ver figura 4 ejemplos de histogramas y valores de C de picos.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

El protocolo aquí presentado ofrece los investigadores un medio para evaluar endorreduplicación en tubérculos de papa, cuyo celular modificado contenido y mayor tamaño de la célula aparentemente excluye otras preparaciones de citometría de flujo. El protocolo se basa en la generación de protoplasto como un medio para reducir el ruido y la suciedad mientras que mantiene integridad nuclear. Previamente, los investigadores han descrito preparaciones similares para las muestras de citometría de flujo especialmente recalcitrante como utilizaron protoplastos de tubérculo para estudiar una variedad de temas como la patogenesia19,20. Sin embargo, a nuestro conocimiento, ningunos han combinado el uso de esos protoplastos de tubérculo con citometría de flujo con el fin de estudiar la endorreduplicación. Por otra parte, encontramos el uso de protoplastos más fiables de preparaciones típicas de crudo, así como la técnica utilizada en los dos solamente otros estudios para evaluar tubérculo endoreduplication6,7. Aquí discutimos las deficiencias del Protocolo, peligros potenciales en su ejecución y muestra la preparación y resultados de un experimento típico que lo emplea.
A pesar de la utilidad y la repetibilidad del Protocolo de citometría de flujo de tubérculo, que tiene algunas debilidades que deben ser discutidas. Para empezar, el protocolo es tiempo intensivo, que requieren dos incubaciones durante la noche. Además, el protocolo requiere algunos reactivos costosos, particularmente la celulasa y macerozyme. Además, las preparaciones son muy sensibles al tiempo, degradantes dentro de unas horas, que pueden limitar el rendimiento en un solo día, especialmente si se desean que los eventos. Por último, el protocolo, mientras que es confiable, es sensible a errores en la preparación de la muestra todos los cuales parecen resultar en daños a los núcleos y resultados de calidad inferiores. Por ejemplo, contaminación microbiana puede ocurrir durante la plasmólisis y protoplasto generación (1 – 3,4) debido a la inadecuada técnica aséptica. Contaminación de las muestras, mientras que no siempre el éxito de una muestra, parece disminuir considerablemente la calidad de los histogramas obtenidos, otra vez probablemente debido al daño a los núcleos.
Como se dijo anteriormente, los principales inconvenientes del protocolo son costos, tiempo y sensibilidad a los errores. Los investigadores deseen tomar medidas para mitigar cada uno de ellos. En cuanto a costo, los investigadores con la intención de aplicar el protocolo para muchas muestras pueden considerar modificar las concentraciones de enzima o duración de la etapa de digestión como diferentes tejidos y genotipos pueden variar en respuesta. Esto incluye la posibilidad de filtrar y reciclar el que previamente se ha demostrado pero no ES empleado aquí21. En cuanto a tiempo, en nuestra observación, es posible prescindir de la primera incubación (paso de plasmólisis) y todavía Extracto de protoplastos; sin embargo, verá afectada su integridad y abundancia, que afecta negativamente los resultados. Para reducir el deterioro de las muestras los investigadores pueden considerar que algunos métodos de citometría de flujo incluyen el uso de fijadores (p. ej., formaldehído) para preservar la integridad de muestra22. Esto puede ser un medio útil tanto evitar su deterioro y permitir muestra almacenamiento en lugar de protoplasto imposición y flujo cytometry que ocurren el mismo día tal como se presenta. Otra forma de prevenir el desgaste de los núcleos puede ser incluir un inhibidor de nucleasas en la CE y/o FBC; mientras que el 2-Mercaptoetanol había efectuada sin cambios durante el desarrollo, otros inhibidores no han sido probados en el presente.
En nuestra observación, el solo paso más crítico es paso 4.4, la extracción de solución de lavado plasmólisis todos antes de la adición del buffer de citometría de flujo (FCB). Si incluso un pequeño volumen (< 10 μl) restos, las muestras son mucho más propensos a ser degradados que pueden conducir a una muestra de pobre o incluso fracasada. Esto es probablemente debido a las impurezas en la solución de la enzima (e.g. nucleasas, proteasas)23,24 que degradan rápidamente los núcleos durante los períodos de incubación y el tiempo entre muestras, incluso a bajas concentraciones. Otra consideración importante es la duración de los pasos de incubación PI y Rnasa. Como se señala en el protocolo, las muestras no permanecen estables durante más de unas pocas horas después de adición de la FCB por lo que los investigadores pueden decidir reducir la duración de estas medidas para acomodar más muestras o citometría de flujo largo procedentes de núcleos baja concentraciones. Esto también requiere que el investigador a considerar el equilibrio entre el número de eventos por muestra y el número total de muestras para ejecutar o considerar el uso de fijadores según lo mencionado previamente.
Diferencias entre los tejidos y los genotipos
Para proporcionar a resultados representante del protocolo hemos diseñado dos experimentos simples para confirmar variación previamente divulgado por el tejido y examinar la influencia de la ploidía y el genotipo. Los resultados del experimento tejido demuestran que el protocolo produce resultados reproducibles, como tejido de médula una vez más fue encontrado para tener el IE más alto. Algo sorprendente tejido de parénquima, que previamente no había sido evaluado, tenía un valor de IE similar al tejido cortical y significativamente menor que la médula. Se trataba de imprevistos como las células del parénquima son típicamente más grandes que ya sea de médula o de células corticales, por lo menos en la madurez. Una posible explicación es que los tubérculos (90 – 130 g) eran demasiado inmaduros para las células del parénquima, que constituyen la mayoría del volumen del tubérculo en la madurez, han ampliado y alcanzó sus máximos valores de C25. Esto también puede explicar por qué el dihaploid (VT_SUP_19) y el dihaploid doblado (VT_SUP_19 4 x) demostró EI significativamente mayor que los tubérculos Superior de CV; mientras que de cada genotipo, se tomaron muestras de tubérculos de aproximadamente igual tamaño, el tamaño máximo de los tubérculos de VT_SUP_19 o tetraploide isogénicas es mucho más pequeño que el de la progenitora. Así, puede ser que muestre mayor IE simplemente porque eran más grandes en relación a su tamaño máximo alcanzable. Por otra parte, la diferencia puede ser una consecuencia del complemento genético que vt_sup_19 recibido de su progenitora tetraploide. Otra posibilidad es que la reducción genómica que ocurrió en la extracción de la dihaploid de la tetraploide puede haber desenmascarado a alelos deletéreos en tensión toda la planta, que también se ha demostrado que contribuyen a la elevada IE26. Sin embargo, esto demuestra que los investigadores de la consideración cuidadosa deben emplear al seleccionar tubérculos y tejidos para ser utilizado para la comparación de los valores de la IE, especialmente entre los genotipos.
Futuras aplicaciones
El protocolo descrito en este artículo ofrece a los investigadores una importante herramienta para comprensión endorreduplicación en Papa. Puede permitir los estudios en los componentes genéticos y ambientales de la endorreduplicación, el curso del tiempo de desarrollo a través de los tejidos del tubérculo y la evaluación de la variación natural. En última instancia, endorreduplicación puede hacer un objetivo prometedor para la mejora de la patata, la empresa que requiere un medio confiable de evaluación.

Endorreduplicación es el proceso por el cual una célula renuncia a ciclo celular típico y en cambio somete a un curso alternativo de desarrollo que consiste en reiteradas rondas de replicación de ADN sin división celular. La célula resultante habrá aumentado DNA tamaño contenido y nuclear que se cree que desempeñan un papel en la regulación celular, la expansión y especialización. Generalmente, una ronda de endorreduplicación (llamado un endocycle) y el correspondiente aumento en contenido de ADN se asocian con mayor volumen de la célula, una observación que precipitó la "teoría karyoplasmic" que incrementó el contenido de ADN es necesaria para bien regular un más grande, tal vez más complejo, celda1. Este fenómeno es común en las plantas superiores, que se ha observado en una amplia gama de tejidos, incluyendo los estructurales/defensivo (tricomas)2,3, nutritivo (endospermo de maíz)4,5y (fregadero/almacenamiento pericarpio de tomate; funciones de tubérculo de patata)6,7,8 . En la fruta, se ha sugerido que eso endoreduplication desempeña un papel en facilitar la rápida expansión del pericarpio evidenciada por la relación negativa entre la endorreduplicación y fruto del desarrollo período9. Por ejemplo células con contenido hasta C 512 (512 veces el genoma haploide) se han observado en el pericarpio de tomate8de ADN. Además Chevalier et al (2014) demostró que alteraciones en la expresión de genes del ciclo celular pueden conducir a aumentos en niveles de endorreduplicación dentro del pericarpio que entonces se traduce en frutas más grandes10. Así, alteración de genes promoviendo endoreduplication proporciona una diana potencial para la mejora de la biomasa o la producción a través de fitomejoramiento o manipulación genética. Sin embargo, tal mejora está condicionada a una mayor comprensión de las causas y consecuencias de la endorreduplicación.
Endorreduplicación más a menudo se mide por citometría de flujo por el núcleo, en preparaciones de tejido crudo11, se incuba con un fluoróforo de unión al ADN, tales como yoduro de propidio12 (PI). Las muestras filtradas pasan luego por el láser de un citómetro de flujo donde se pueden observar longitudes de onda de emisión específicos para el fluoróforo. La intensidad de fluorescencia en cada caso (es decir, núcleo) está directamente relacionada con el contenido de ADN de la partícula. Así, por comparación con un estándar conocido, puede calcularse el contenido de ADN relativo y absoluto de las células en una muestra determinada. Índices de endorreduplicación (IE) se determinan estableciendo el número promedio de endocycles por la célula dentro de una muestra, observando el contenido celular de ADN (valor C) donde C 1 es el contenido de ADN de una célula haploide (fórmula presentada en el paso 6.7 del Protocolo). Por ejemplo, en un organismo diploide, el contenido base de ADN de las células somáticas es 2C. Si una muestra tiene algunas células con 4C, correspondiente a una sola ronda de endorreduplicación, o mayor tendría un EI cerca de 0; sin embargo si casi todas las células son 4C IE sería aproximadamente 1. Sin embargo, como múltiples rondas de endorreduplicación son comunes en plantas observados IE los valores más altos puede ser mucho mayores. Mientras calcula índices de endorreduplicación puede relativamente sencilla, que requiere que la abundancia relativa de núcleos C valores confiablemente determinar, que está impedido en ciertas especies y tejidos (incluyendo tubérculos de papa). Es probable que las diferencias en el celular la pared celular, la química o la anatomía composición13 causan estas muestras ser recalcitrante para las preparaciones típicas utilizando una cuchilla de afeitar para liberar los núcleos directamente en buffers adecuados que se utilizan con tejidos como el pericarpio de tomate, un modelo de endorreduplicación estudios8.
En Papa, el examen de endorreduplicación dentro el tubérculo sigue siendo limitado a los estudios un par, tal vez debidos en parte a la falta de un protocolo confiable como las mencionadas preparaciones crudas resultados inconsistentes. Si bien estos enfoques funcionan bien para las muestras de tubérculo experimentan severa degradación y una abundancia de ruido en forma de residuos, haciendo diferenciación de picos conformada por núcleos con valores C diferentes casi imposibles de hojas. Esto es quizás debido a diferencias en la composición celular y una profusión de detritos celulares dentro de las células del tubérculo (e.g. amyloplasts almacenamiento de almidón). Para superar este obstáculo, recientemente desarrollamos un protocolo más fiable para la adquisición de picos distinguibles en citometría de flujo de tubérculos de papa. La frecuencia de células dentro de cada pico puede utilizarse para calcular niveles de endorreduplicación precisa para diferentes genotipos o diferentes tejidos que componen un tubérculo. El protocolo, que emplea un antecedente de protoplasto modificado extracción método14,15 descrito previamente flujo cytometry11, mostró una variación considerable dentro de parientes de patatas, variedades y tejidos16 . Aquí presentamos el protocolo en detalle mediante la evaluación de la IE en los contextos de ploidía, tejido y tamaño del tubérculo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10k</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid XP (autopipettor)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.22&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>564-0020</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.45&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>172590250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>194854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (hexahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423922500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>17263-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borers with punch</td>
			<td>American Scientific</td>
			<td>2093-02</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-31</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-920B</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>106um stainless steel mesh or other seive of same pore size</td>
			<td>New Jersey Wire Mesh Co.</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts

Endorreduplicación, la replicación del genoma nuclear de la célula sin citocinesis posterior, produce células con mayor contenido de ADN y se asocia con la especialización, desarrollo y aumento de tamaño celular. En las plantas, endoreduplication parece facilitar el crecimiento y expansión de ciertos tejidos y órganos. Entre ellos se encuentra el tubérculo de papa (Solanum tuberosum), que se somete a expansión celular considerable en el cumplimiento de su función de almacenamiento de hidratos de carbono. Por lo tanto, endorreduplicación puede jugar un papel importante en cómo los tubérculos son capaces de dar cabida a esta abundancia de carbono. Sin embargo, los desechos celulares resultantes de los métodos de aislamiento nuclear crudo de tubérculos, métodos que pueden utilizarse eficazmente con las hojas, impide la estimación del índice de endorreduplicación de tubérculo (IE). Este artículo presenta una técnica para evaluar la endorreduplicación del tubérculo por el aislamiento de protoplastos y demostrando resultados representativos obtenidos de diferentes genotipos compartimentados los tejidos del tubérculo. Las limitaciones principales del protocolo son los costos de tiempo y reactivos necesarios para la preparación de la muestra así como la relativamente corta vida útil de las muestras después de lisis de los protoplastos. Mientras que el protocolo es sensible a la variación técnica, representa una mejora sobre los métodos tradicionales de aislamiento nuclear de estas grandes células especializadas. Se proponen posibilidades de mejoras en el protocolo como reciclaje de enzima, el uso de fijadores y otras alteraciones.

Producción de protoplastos
La generación de protoplastos es necesaria para lograr resultados de citometría de flujo repetible de tubérculos de papa, la morfología general de los que se muestra en la figura 1. Los investigadores deseen asegurar protoplastos de alta calidad se han producido antes de la adición de la FCP, especialmente en el caso de que resolución de problemas es necesario. La mayoría de los protoplastos debe ser esférica con salientes mínimo (figura 2) y puede variar grandemente en tamaño, que tal vez es un reflejo de las diferencias en IE.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> Figura 2: Representante protoplastos de hojas y tubérculos adquiridos a paso 4.4 protocolo de. Protoplastos aislados deben ser esférica y simétrica con membrana plasmática intacta. Tenga en cuenta la diferencia de tamaño entre hojas (A-c) y protoplastos de tubérculo (D, E) así como las diferencias en tamaño dentro de un tejido que puede indicar diferentes niveles de endorreduplicación. Protoplastos de hojas contienen cloroplastos mientras que amyloplasts son visibles dentro de los protoplastos de tubérculo. Barras de escala = 1.000 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Evaluación de resultados de la citometría de flujo
El éxito o fracaso de un experimento puede evaluarse de la anchura de los picos y su separación en los histogramas de citometría de flujo. Como endoreduplication medición requiere calcular la abundancia relativa de núcleos en cada pico, mera presencia o ausencia de picos no es suficiente si hay demasiado ruido para dibujar límites significativos entre ellos. Figura 3 muestra la variación en los resultados, los investigadores pueden encontrar en el flujo cytometry diagramas de dispersión e histogramas. Posibles causas de muestras se presentan dentro de la discusión.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> Figura 3: resultados representativos obtenidos de citometría de flujo de los núcleos del protoplasto de intacto y degrada las muestras de médula. Núcleos intactos (A) Mostrar limpia separación entre picos para cuantificar la abundancia relativa de las células en cada usando el software apropiado Considerando que picos en muestras degradadas (B) muestran bases de cambiado de puesto, amplia y superpuestas. En los diagramas de dispersión de intacto (C) y degradados (D) muestras, cajas negras indican evento nuclear gating de histogramas y el agrupamiento de eventos se refleja en la anchura de los picos del histograma. Eventos fuera de las puertas indican residuos núcleos severamente degradados y otros agregados. PI-H corresponde a la intensidad de la fluorescencia que es medida en unidades arbitrarias. Métodos de solución de problemas para evitar la degradación de la muestra se discuten en el texto. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Endorreduplicación diferencias entre los tejidos
Hemos divulgado previamente que tubérculo médula tejido tiene significativamente mayores niveles de endorreduplicación de corteza tejido16. Para confirmar y ampliar en este analizamos niveles de endorreduplicación de tres tejidos diferentes en CV Superior: médula parénquima perimedular y corteza, replicado por triplicado con 2.000 eventos cerradas por muestra. Nuestros resultados confirman nuestra observación anterior que tejido de médula tiene IE significativamente mayor que el tejido cortical con medios de endocycles 1.79 y 1.12 por celda, respectivamente (p = 0.018; De prueba t de Student). Sorprendentemente, el tejido de parénquima demostró un perfil similar a la corteza y también fue significativamente diferente del tejido de la médula (media = 1,14; p = 0.013; De prueba t de Student). Estos resultados se resumen en la figura 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> Figura 4: endorreduplicación en tres tejidos de CV Superior. Histogramas de hoja (A), (B) de la corteza del tubérculo, parénquima (C) y los tejidos de la médula (D) se muestran junto con el valor EI calculado a partir de los histogramas. Diferencias en la abundancia relativa de núcleos que comprende cada pico son evidentes, especialmente entre los tejidos de la hoja y tubérculo. También se muestran valores de C para cada pico. PI-H corresponde a la intensidad de la fluorescencia que es medida en unidades arbitrarias. Significa que las comparaciones de la IE de los tejidos del tubérculo aparecen en E donde el asterisco indica diferencia significativa (p < 0,05) y barras de error indican la desviación estándar. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Influencia del tamaño del tubérculo y ploidía
Hemos divulgado previamente que, para un genotipo dado, tubérculos de diferentes tamaños pero similar madurez no muestran una diferencia correspondiente en IE16. El objetivo fue confirmar este resultado, así como evaluar la relación entre la ploidía y endorreduplicación. Para este experimento, se utilizaron tres repeticiones de tejido de parénquima de tres genotipos diferentes: CV Superior (x 4), VT_SUP_19 (2 x) que es un dihaploid extraen de CV Superior por prickle polinización17y VT_SUP_19 4 x que es una doble dihaploid 18 isogénicas a VT_SUP_19. Se incluyeron un conjunto de réplicas para grande (90 – 130 g) y pequeño (< 35 g) tubérculos para CV Superior mientras que tubérculos para los otros dos genotipos fueron de 90 a 130 g. Los tubérculos fueron extraídas de invernadero cultivado plantas en plena madurez, es decir, las puntas de las plantas tenían senescentes. Se observó una diferencia significativa entre VT_SUP_19 y su progenitor Superior (p = 0,04); sin embargo, no hubo diferencias significativas entre VT_SUP_19 y VT_SUP_19 x 4 (p = 0,69). Esto indica que mientras que hay un probable componente genético a la endorreduplicación, como desenmascarado por la reducción genómica, no obedece a ploidía, al menos en este contexto. Por último, una vez más no observamos ninguna diferencia significativa entre CV. grandes y pequeños tubérculos Superior como se muestra en la figura 5.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> Figura 5: endorreduplicación en dos tamaños de tubérculos de la variedad Superior y diploide (VT_Sup_19) y tetraploide (VT_Sup_19 x 4) derivados. El gráfico de barras muestra la media de pequeño (< 35 g) y tubérculos Superior de CV grande (90 – 130 g) así como tubérculos grandes (90 – 130 g) de la dihaploid VT_SUP_19 y el dihaploid doblado isogénicas VT_SUP_19 4 x. Diferencias significativas (p < 0,05) se indican en el informe de carta conexión. Barras de error representan la desviación estándar. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endorreduplicación medición por citometría de flujo de protoplastos aislados de tubérculos

El protocolo descrito aquí es un método para medir la endorreduplicación en tubérculos de papa (Solanum tuberosum). Incluye plasmólisis y protoplasto pasos de extracción para disminuir el ruido y la suciedad en análisis cytometric del flujo aguas abajo.

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

measuring-endoreduplication-flow-cytometry-isolated-tuber

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K vistas.  Virginia Tech. El protocolo descrito aquí es un método para medir la endorreduplicación en tubérculos de papa (Solanum tuberosum). Incluye plasmólisis y protoplasto pasos de extracción para disminuir el ruido y la suciedad en análisis cytometric del flujo aguas abajo.

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Investigación

Biología

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

La medición cuantitativa de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática por citometría de flujo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

La inmunodetección de la membrana externa proteínas por Citometría de Flujo de mitocondrias aisladas

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...