Questo lavoro è stato supportato dal NIH (AI119813), lo start-up presso la University of Arkansas e il premio dall'Arkansas Biosciences Institute.

1. mutagenesi del Gene Target
Nota: MDH è espresso sotto promotore T7 nel vettore pCDF-1 con l'origine di CloDF13 e un numero di copia di 20 a 4034.
<ol><li>Introdurre il codone di stop ambra nella posizione 140 nel gene di primer (forward primer: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG e reverse primer: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), seguendo le istruzioni del kit di mutagenesi sito-diretta.</li>
	<li>Amplificare il plasmide di modello che contiene il gene della deidratasi di selvaggio-tipo malate e inserire la mutazione del codone di arresto dalla reazione della polimerasi reazione a catena (PCR). Nella miscela di reazione, sono 12,5 µ l della miscela enzima di 2 X DNA polimerasi, 1.25 µ l di 10 µM Forward primer, 1.25 µ l di primer Reverse di 10 µM, 1 µ l di DNA campione (20 ng / µ l) (pCDF-1 plasmide contenente il gene di tipo selvatico MDH) e 9 µ l di acqua priva di nucleasi.<ol>
<li>Utilizzare parametri di reazione di PCR come segue: iniziale denaturazione a 98 ° C per 30 s; 25 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 3 min a 72 ° C; estensione finale a 72 ° C per 3 min. Dopo la PCR, aggiungere il materiale amplificato direttamente al mix enzima chinasi-ligasi-DpnI dal kit per 1 h a temperatura ambiente per rimozione circularization e modello. Nota: La miscela di reazione contiene 1 µ l di prodotto PCR, 5 µ l di tampone di reazione: 2x, 1 µ l di miscela di enzima 10 X chinasi-ligasi-DpnI e 3 µ l di acqua priva di nucleasi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di miscela di reazione per il tubo di 25 µ l scongelati competente Escherichia coli cellule DH5α dal kit. Attentamente a scatti la provetta per mescolare e mettere il composto sul ghiaccio per 30 min. scossa di calore la miscela a 42 ° C per 30 s e posto in ghiaccio per ulteriori 5 minuti.<ol>
<li>Pipettare 600 µ l di temperatura ottimale Super brodo con media di repressione (SOC) dei cataboliti dal kit nella miscela, incubare a 37 ° C per 60 min con agitazione a 250 giri/min, sviluppa 100 µ l su una piastra di agar del brodo (LB) di Lisogenesi con l'antibiotico corrispondente e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prendere 4-6 singole colonie in media LB fresco 6 mL con l'antibiotico corrispondente e incubare a 37 ° C per una notte con agitazione a 250 giri/min. Estrarre i plasmidi dall'ogni cultura durante la notte con il kit di purificazione del plasmide, seguendo il manuale del produttore, quindi invia plasmidi per la sequenza di DNA in base al protocollo del prestatore per confermare la mutazione del codone di arresto alle posizioni corrette.</li>
	<li>Conservare il ceppo con la corretta sequenza a-80 ° C mescolando 1 mL coltura durante la notte e 300 µ l 100% DMSO.</li>
</ol>2. espressione della proteina acetilata
<ol><li>Inserire i geni di ottimizzato acetyllysyl-tRNA sintetasi33 e ottimizzato tRNAPyl 32 nel plasmide pTech . Luogo del gene di tRNA sintetasi sotto il promotore costitutivo lpp . Posto del gene tRNA sotto il promotore costitutivo proK 34.<ol>
<li>Co-trasformare il vettore di espressione34 contenente il gene mutato contenenti TAG del malato deidrogenasi e il plasmide che harboring il sistema di incorporazione di acetyllysine ottimizzato, in 25 µ l competente scongelati e. coli BL21 (DE3) cellule di shock termico a 42 ° C per 10 s e posto in ghiaccio per ulteriori 5 minuti.</li>
		<li>Pipettare 600 µ l di temperatura media SOC in miscela, incubare a 37 ° C per 60 min con agitazione a 275 giri/min, sviluppa 100 µ l in un piatto con 100 µ g/mL di streptomicina e cloramfenicolo di 50 µ g/mL e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 275 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pick up una singola Colonia dalla piastra e inoculare in media LB freschi 15ml con 100 µ g/mL di streptomicina e cloramfenicolo 50 µ g/mL in una provetta da 50 mL durante la notte a 37 ° C con agitazione alla velocità di 250 giri/min. Trasferire la cultura notte 15 mL media LB fresco 300 mL con antibiotici in un pallone da 1 L e incubare a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.</li>
	<li>Sciogliere acetyllysine con acqua per fare la soluzione di riserva di 100 mM, conservare a 4 ° C. Aggiungere acetyllysine di 5 mM e 20 mM nicotinammide (inibitore delle deacetilasi) ai media crescita quando assorbanza raggiunge 0,5 a 600 nm.<ol>
<li>Crescere le cellule per un ulteriore 1 h a 37 ° C, agitando a 250 giri/min, poi aggiungere 0,5 mM IPTG per l'espressione della proteina e far crescere cellule a 25 ° C durante la notte, con agitazione a 180 giri/min. Nota: Le condizioni di espressione possono bisogno di ottimizzazione per diverse proteine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g a 4 ° C per 15 min, scartare il surnatante e lavare palline delle cellule con il tampone fosfato salino (PBS) buffer (10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl). Raccogliere cellule lavate a 10.000 x g a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante e archiviare palline delle cellule a-80 ° C.</li>
</ol>3. la purificazione della proteina acetilata
<ol><li>Scongelare il pellet di cellule congelate su ghiaccio e risospendere con 15 mL di tampone di lisi (50mm tris (idrossimetil) amminometano (Tris) a pH 7,8, 300 mM NaCl, imidazolo di 20 mM e 20 mM nicotinammide), 5 µ l di β-mercaptoetanolo e nucleasi di 1 µ l Benzonase (250 unità).</li>
	<li>Rompere le cellule di sonicazione 40 kHz a 70% potenza di uscita con 10 cicli di 10 brevi raffiche di s, seguite da intervalli di 30 s per il raffreddamento estratto grezzo di forma. Centrifuga del greggio estratto a 20.000 x g per 25 min a 4 ° C. Filtrare il surnatante con il filtro a membrana da 0,45 µm e caricare in una colonna contenente 1 mL di nichel-nitrilotriacetico acido resina (Ni-NTA) equilibrata con 20 mL di acqua e 20 mL di tampone di lisi. Nota: Cellule detergenti delicati, potrebbero essere interrotta anche se sonicazione non è disponibile.</li>
	<li>Lavare la colonna con 20 mL di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, imidazolo di 50 mM e 20 mM nicotinammide) e quindi eluire con 2 mL di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, imidazolo di 150 mM e 20 mM nicotinammide).</li>
	<li>Dissalare la frazione di eluizione con desalificazione buffer (25 mM Tris pH 7,8 e 10 mM NaCl) dalla colonna PD-10, seguendo il manuale del produttore. Misurare la concentrazione della proteina eluita seguendo le istruzioni del reagente di analisi della proteina di Bradford. La proteina dissalata è pronta per ulteriori esperimenti. Nota: Fare magazzino di glicerolo di 50% della proteina e mantenere a-80 ° C per la conservazione.</li>
</ol>4. Descrizione biochimica della proteina acetilata
<ol><li>
Analisi di spettrometria di massa e SDS-PAGE.
	<ol>
<li>Denaturare le proteine con il sodio dodecil solfato (SDS) tampone del campione (campione di proteina 5 µ l con 2 µ l 4 X tampone campione SDS) in una provetta da 2 mL a 105 ° C per 5 min, centrifugare la miscela a 2000 x g per 10 s, carico sui 4-20% sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide electroph gel di oresis (SDS-PAGE) ed eseguire a 200 V per 30 min.</li>
		<li>Lavare il gel con acqua distillata e agitare delicatamente per 5 min, ripetendo il processo 3 volte. Eliminare l'acqua e macchia il gel con la macchia blu di Coomassie per 1 h con agitazione delicata. De-macchia il gel con acqua distillata, agitare delicatamente per 30 min e ripetere questo de-macchia 3 volte.</li>
		<li>Tagliare la banda al kDa 33 sul gel di SDS-PAGE di Coomassie blu-macchiato e inviarlo a: Servizi di spettrometria di massa o aziende per confermare che il acetyllysine è stato incorporato nella posizione progettata. Nota: Il protocollo di analisi di spettrometria di massa ha seguito il precedente esperimento34.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Macchiarsi occidentale
	<ol>
<li>Esegua il gel di SDS-PAGE con lo stesso protocollo al punto 4.1. Dopo il gel di eseguire, immergere il gel con il buffer di trasferimento (25 mM Tris, glicina 192 mM, pH 8.3 e 20% metanolo) per 15 min.</li>
		<li>Attivare un 0,2 µm, membrana di 7 x 8,5 cm polivinilidene difluoruro (PVDF) con metanolo per 1 min e sciacquare con tampone di trasferimento prima di preparare il panino di trasferimento. Nota: Il metanolo è pericoloso in caso di contatto con la pelle, contatto con gli occhi, ingestione o inalazione. Sovresposizione severa può provocare la morte.</li>
		<li>Fare il panino di trasferimento dal catodo all'anodo (spugna, carta da filtro, SDS-PAGE gel, PVDF membrana, carta da filtro e spugna). Mettere la pila in carro armato di trasferimento, eseguito a corrente costante di 350 mA per 45 min. Nota: Tempo di trasferimento potrebbe bisogno di ottimizzazione.</li>
		<li>Lavare la membrana PVDF con 25 mL Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0.1% Tween-20, pH 7.6) buffer per 5 minuti con agitazione delicata. Bloccare la membrana con 5% di albumina di siero bovino (BSA) nel buffer TBST per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare la membrana con acetyllysine-anticorpo HRP-coniugato con una concentrazione finale di 1 µ g/mL diluito con 5% BSA in TBST a 4 ° C durante la notte con agitazione delicata. Nota: Per risultati più veloci, questo passaggio potrebbe essere eseguita a temperatura ambiente per 1 h. La diluizione dell'anticorpo può avere bisogno di ottimizzazione.</li>
		<li>Lavare la membrana con 20 mL di tampone TBST per 5 minuti con agitazione delicata, ripetere il passo 4 volte. Applicare il substrato di chemiluminescenza per la membrana seguendo le istruzioni del produttore. Catturare il segnale con un imager di macchina fotografica a base di charge coupled device (CCD).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+and+reprogramming+the+genetic+code+of+cells+and+animals.">Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals.</a> Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).</li><li>O'Donoghue, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-cognate+suppression+of+amber,+opal+and+quadruplet+codons+competes+with+aminoacyl-tRNAPyl+for+genetic+code+expansion.">Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion.</a> FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).</li><li>Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+amino+acid+composition+of+proteins+within+an+expanded+genetic+code.">Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code.</a> Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+method+for+genetic+incorporation+of+multiple+noncanonical+amino+acids+into+one+protein+in+Escherichia+coli.">A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli.</a> Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).</li><li>Venkat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+thioacetyl-lysine+as+a+nondeacetylatable+analog+of+lysine+acetylation+in+Escherichia+coli.">Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli.</a> FEBS Open. , (2017).</li><li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysyl-tRNA+synthetase:+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool.">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li><li>Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+the+histone+deacetylase+family:+functional+implications+of+phylogenetic+analysis.">Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis.</a> J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).</li><li>Weinert, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-phosphate+is+a+critical+determinant+of+lysine+acetylation+in+E.+coli.">Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli.</a> Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La costituzione genetica degli aminoacidi noncanonical (ncAAs) si basa sulla soppressione di un codone assegnato, per lo più la fermata ambra codone UAG36,37,38,39, dal tRNA ncAA-pagano contenente l'anticodone corrispondente. Come è noto, il codone UAG viene riconosciuto dalla release factor-1 (RF1) nei batteri, e può anche essere soppressa da vicino cognate tRNAs da host praticati da aminoacidi canoniche (cAAs) come la lisina e la tirosina40,41. Così, l'efficienza dell'incorporazione di ncAA al codone UAG dipende la competizione tra carica ncAA tRNAs e RF1, mentre la purezza dell'incorporazione di ncAA si basa sulla competizione tra tRNAs ncAA-carica e carica di cAA vicino tRNAs cognate. Bassa resa e purezza della proteina bersaglio acetilato può essere causati dall'efficienza di incorporazione bassa della coppia ortogonale introdotta in cellule dell'ospite. Questo problema potrebbe essere risolto aumentando la concentrazione di acetyllysine nei media, e utilizzando recentemente ottimizzato sistemi di incorporazione di acetyllysine, che sono aumentate la soppressione di codone UAG 58 volte32,33, entrambi sarà migliorate l'efficienza e la purezza dell'incorporazione di acetyllysine. Come illustrato nella Figura 1 e confrontando i rendimenti della proteina, l'efficienza di incorporazione di acetyllysine era circa il 50% e non c'era nessun rilevabile della proteina purificata dalle cellule che harboring il sistema di incorporazione di AcK e il gene mutante di MDH, ma senza AcK in media di crescita, che ha indicato l'elevata purezza della incorporazione di acetyllysine. Inoltre, analisi di spettrometria di massa anche non hanno mostrato alcun cAAs posizione 140 di MDH, che indica l'omogeneità di incorporazione del acetyllysine.
Ci sono due principali limitazioni di questo approccio. In primo luogo, a causa della concorrenza di tRNA acetyllysine-addebitato con entrambi RF1 e carica di cAA vicino cognate tRNAs descritto in precedenza, attualmente, il numero massimo dei residui di acetyllysine che possono essere incorporate simultaneamente in una singola proteina è tre 33,42. In secondo luogo, le cellule hanno altri tipi di deacetilasi, che resistono nicotinammide e possono deacetilano determinate proteine bersaglio. Così, quelle proteine non possono raggiungere il 100% acetilazione in siti specifici. Recentemente, abbiamo istituito un sistema di incorporazione di thio-acetyllysine che può essere utilizzato come un analogo non-deacetylable di acetyllysine43, così questo sistema potrebbe essere un buon approccio alternativo in questo caso.
Come accennato prima, l'approccio classico per caratterizzare biochimicamente acetilazione di lisina è mediante mutagenesi sito-diretta. Glutamina è usata come un mimo di acetyllysine e arginina è utilizzata come un mimo di lisina non-acetilati. Tuttavia, entrambi imita non è veri isosteri e non sempre danno i risultati attesi30. La strategia di espansione del codice genetico potrebbe generare in modo omogeneo acetilati proteine ai residui di lisina specifico, che è il modo più rigoroso per caratterizzare le proteine acetilati.
Il sistema di costituzione genetica per acetyllysine è stato derivato dalla coppia di pyrrolysyl-tRNA sintetasi varianti e loro cognate tRNA da specie Methanosarcinaceae , che sono anche conosciute per essere ortogonali in eucarioti44. Studi precedenti hanno dimostrato che questo sistema potrebbe essere applicato in cellule di mammifero e certi animali per proteina acetilazione studi39, così il presente protocollo potrebbe essere esteso a cellule di mammiferi e persino animali per applicazioni più ampie nel settore medicale ricerca e industria. Inoltre, questo protocollo è anche essenzialmente lo stesso protocollo utilizzato per incorporare diversi tipi di ncAAs, rendendo necessaria una semplice modifica alla coppia ortogonale introdotta in cellule dell'ospite.
Lisina deacetilasi (KDACs) rimuovere il gruppo acetile dal residuo di lisina acetilato in proteine45. Il sirtuin-tipo CobB è il deacetylase soltanto ben noto in e. coli, che può essere inibito da nicotinammide27. Così, per evitare la deacetilazione della proteina acetilata generata durante la crescita delle cellule e purificazione della proteina, nicotinamide 20 a 50 mM dovrebbe essere aggiunto in entrambi i mezzi di crescita e purificazione buffer. Una volta purificato, acetilazione dei residui di lisina è relativamente stabile a causa della mancanza di deacetilasi. In secondo luogo, per abbassare lo sfondo di acetilazione aspecifico presso altri residui di lisina della proteina, la BL21 (DE3) ceppo è stato usato come il ceppo di espressione, a causa del livello significativamente più basso di acetilazione di proteine rispetto ai ceppi K12-derivati comunemente utilizzati46 . Come illustrato nella Figura 2, il selvaggio-tipo MDH espresso dalle cellule BL21 (DE3) non avuto nessun acetilazione rilevabile mediante western blotting. Questo è un altro fattore importante per aumentare la purezza dell'acetilazione nella proteina bersaglio.

Modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine si verificano dopo il processo di traduzione e derivano da covalente aggiunta di gruppi funzionali ai residui dell'amminoacido, giocando ruoli importanti in quasi tutti i processi biologici, tra cui gene trascrizione, risposta allo stress, differenziazione cellulare e metabolismo1,2,3. Ad oggi, circa 400 distintivo PTMs sono state identificate4. La complessità del genoma e del proteoma è amplificata in grande misura dalla proteina PTMs, come essi regolano la localizzazione e l'attività della proteina e influenzare l'interazione con altre molecole come proteine, acidi nucleici, lipidi e cofattori5.
Acetilazione della proteina è stato all'avanguardia di PTMs studi nell'ultimo ventennio6,7,8,9,10,11,12. Acetilazione di lisina in primo luogo è stato scoperto in istoni più di 50 anni fa13,14, ha stato bene esaminato ed è conosciuta per esistere in più di 80 fattori di trascrizione, regolatori e varie proteine15, 16,17. Studi sull'acetilazione della proteina hanno non solo ci ha fornito una comprensione più profonda dei suoi meccanismi di regolamentazione, ma anche trattamenti per un certo numero di malattie causate da disfunzionale acetilazione18,19, guidati 20 , 21 , 22 , 23. si credeva che l'acetilazione lisina accade solo negli eucarioti, ma recenti studi hanno dimostrato che acetilazione di proteina svolge anche ruoli chiave in fisiologia batterica, tra cui chemiotassi, resistenza agli acido, attivazione e stabilizzazione di Isole di patogenicità e altri virulenza relative proteine24,25,26,27,28,29.
Un metodo comunemente usato per caratterizzare biochimicamente acetilazione di lisina è mediante mutagenesi sito-diretta. Glutamina è usata come un mimo di acetyllysine a causa delle sue dimensioni simili e la polarità. Arginina è utilizzata come un mimo di lisina non-acetilati, poiché esso conserva la sua carica positiva in condizioni fisiologiche, ma non può essere acetilato. Tuttavia, entrambi imita non è veri isosteri e non sempre danno i risultati attesi30. L'approccio più rigoroso è quello di generare in modo omogeneo acetilati proteine ai residui di lisina specifico, che è difficile o impossibile per i più classici metodi a causa della bassa stechiometria di acetilazione di lisina in natura7,11. Questa sfida ha stata svelata dalla strategia di espansione di codice genetico, che impiega una derivati dal pyrrolysyl-tRNA-sintetasi variante da Methanosarcinaceae specie di addebitare tRNAPyl con acetyllysine, utilizza l'host traslazionale macchinari per sopprimere l'UAG codone nel mRNA di arresto e dirige l'incorporazione di acetyllysine in posizione progettata della proteina bersaglio31. Recentemente, abbiamo ottimizzato questo sistema con una migliore EF-Tu-associazione tRNA32 e un aggiornato acetyllysyl-tRNA sintetasi33. Inoltre, abbiamo applicato questo sistema avanzato incorporazione negli studi di acetilazione di malato deidrogenasi34 e tyrosyl-tRNA sintetasi35. Qui, dimostriamo il protocollo per la generazione di proteine puramente acetilati dalla clonazione molecolare per l'identificazione biochimica utilizzando la malato deidrogenasi (MDH), che abbiamo studiato estesamente come esempio dimostrativo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bradford protein assay</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">5000006</td>
			<td style="width:167px;">Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610747</td>
			<td style="width:167px;">SDS sample buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Coomassie G-250 Stain</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610786</td>
			<td style="width:167px;">SDS-PAGE gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">4-20% SDS-PAGE ready gel</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561093</td>
			<td style="width:167px;">Protein determination</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ac-K-100 (HRP Conjugate)</td>
			<td style="width:113px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">6952</td>
			<td style="width:167px;">Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:113px;">CHEM-IMPEX</td>
			<td style="width:119px;">194</td>
			<td style="width:167px;">Expression inducer</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">N&#949;-Acetyl-L-lysine</td>
			<td style="width:113px;">CHEM-IMPEX</td>
			<td style="width:119px;">5364</td>
			<td style="width:167px;">Noncanonical amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">PD-10 desalting column</td>
			<td style="width:113px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17085101</td>
			<td style="width:167px;">Desalting</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:113px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E0554</td>
			<td style="width:167px;">Introducing the stop codon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">BL21 (DE3) cells</td>
			<td style="width:113px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">C2527</td>
			<td style="width:167px;">Expressing strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:113px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27106</td>
			<td style="width:167px;">Extracting plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ni-NTA resin</td>
			<td style="width:113px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">30210</td>
			<td style="width:167px;">Affinity purification resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">nicotinamide</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3376</td>
			<td style="width:167px;">Deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td style="width:167px;">Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">BugBuster Protein Extraction Reagent</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">70584</td>
			<td style="width:167px;">Breaking cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E1014</td>
			<td style="width:167px;">DNase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td style="width:167px;">Chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Premixed LB Broth</td>
			<td style="width:113px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97064</td>
			<td style="width:167px;">Cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:113px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97061-416</td>
			<td style="width:167px;">western blots blocking</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a facile protocol to generate site-specifically acetylated proteins in escherichia coli

Modificazioni post-traduzionali che si verificano alle posizioni specifiche delle proteine hanno dimostrati di svolgere un ruolo importante in una varietà di processi cellulari. Fra loro, acetilazione reversibile lisina è uno dei più ampiamente distribuita in tutti i domini della vita. Sebbene siano stati condotti numerosi studi basati sulla spettrometria di massa acetylome, ulteriore caratterizzazione di questi bersagli putativi acetilazione è stato limitato. Una possibile ragione è che è difficile generare proteine puramente acetilati alle posizioni desiderate dalla maggior parte degli approcci biochimica classica. Per superare questa sfida, la tecnica di espansione del codice genetico è stata applicata per utilizzare la coppia di una variante di derivati dal pyrrolysyl-tRNA sintetasi e sue cognate tRNA da specie Methanosarcinaceae , per dirigere l'incorporazione di cotranslational di acetyllysine presso il sito specifico della proteina di interesse. Dopo la prima applicazione nello studio di acetilazione dell'istone, questo approccio ha facilitato gli studi di acetilazione su una varietà di proteine. In questo lavoro, abbiamo dimostrato un protocollo facile per produrre proteine site-specifically acetilati utilizzando il batterio Escherichia coli di modello come host. La malato deidrogenasi è stata utilizzata come un esempio di dimostrazione in questo lavoro.

La resa di proteina acetilata di MDH era 15 mg al cultura L 1, mentre quello di selvaggio-tipo MDH era 31 mg / cultura 1 L. Le proteine purificate sono state analizzate da SDS-PAGE, come illustrato nella Figura 1. Il selvaggio-tipo MDH è stato usato come un controllo positivo34. La proteina purificata dalle cellule che harboring il sistema di incorporazione di acetyllysine (AcK) e il gene mutante mdh , ma senza AcK in mezzi di sviluppo, è stata utilizzata come controllo negativo. Acetilazione di lisina delle proteine purificate è stato rilevato usando macchiante occidentale l'anticorpo acetyllysine come mostrato in Figura 2. L'acetilazione del residuo di lisina 140 nella malato deidrogenasi è stata confermata dall'analisi di spettrometria di massa tandem come mostrato nella Figura 3.
La sequenza della proteina della proteina MDH (il frammento per analisi MS tandem è in grassetto):
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
La sequenza della proteina di ottimizzato acetyllysyl-tRNA sintetasi33:
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
La sequenza del gene del tRNA ottimizzatoPyl 32:
GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC ACGTTTCCGCCA
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57061/57061fig1.jpg"> Figura 1 : The Coomassie blu-macchiato gel di SDS-PAGE di MDH full-length purificata e la sua variante AcK-contenente. Gli stessi volumi di eluizione frazioni sono state caricate su SDS-PAGE gel. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57061/57061fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57061/57061fig2.jpg"> Figura 2 : Il western blot di MDH purificata di tipo selvatico e la sua variante contenenti AcK. Sono stati caricati gli stessi volumi di frazioni di eluizione. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57061/57061fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57061/57061fig3.jpg"> Figura 3 : Analisi LC-MS/MS di variante di AcK-contenente MDH. Lo spettro massa tandem di peptide (residui 135-142) AGVYDKACNK da variante acetilata purificata di MDH. KAC denota AcK incorporazione. La sequenza parziale del peptide contenente l'AcK può essere letto dalla serie dello ione y o b con annotazioni. Abbinati cime erano in rosso. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57061/57061fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Codice genetico espansione serve come un potente strumento per studiare una vasta gamma di processi biologici, compreso l'acetilazione della proteina. Qui dimostriamo che un protocollo facile sfruttare questa tecnica per la generazione in modo omogeneo acetilato proteine in siti specifici in cellule di Escherichia coli .

Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

a-facile-protocol-to-generate-site-specifically-acetylated-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

6.8K Views.  University of Arkansas. Codice genetico espansione serve come un potente strumento per studiare una vasta gamma di processi biologici, compreso l'acetilazione della proteina. Qui dimostriamo che un protocollo facile sfruttare questa tecnica per la generazione in modo omogeneo acetilato proteine in siti specifici in cellule di Escherichia coli .

Video: A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

Un protocollo Infettare<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Con<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Non invasiva Modello di neuropatogeno<em&gt; Escherichia coli</em&gt; L&#39;infezione neonatale nel ratto

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

Un passo negativo cromatografica Purificazione di<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In modalità batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In risposta al trattamento antibiotico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse