We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

Il sangue umano è stato raccolto da volontari sani con il previo consenso informato scritto e approvazione da parte del Institutional Review Board della National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan. 1. Espressione ricombinante HP-NAP in E. coli <ol><li> Preparare il plasmide pET42a-NAP che contiene la sequenza di DNA di HP-NAP da H. pylori 26695 ceppo come descritto in precedenza 16. Preparare i plasmidi contenenti la sequenza di DNA di HP-NAP con le mutazioni puntiformi desiderati come descritto (vedi protocollo, punto 8). </li><li> Trasformare 10 ng dei plasmidi di DNA sopra in E. coli BL21 (DE3) cellule competenti di shock termico per 45 secondi a 42 ° C, striscia le celle brodo lisogenia (LB) piastre di agar contenenti 50 mg / ml kanamicina, e incubare le piastre a 37 ° C per 16 ore. </li><li> Seminare singole colonie in tubi singoli contenenti 5 ml di brodo LB con 50 ug / ml kanamicina e crescere come precultures a 37 ° C per 16 ore con agitazione a 170 giri al minuto. </li><li> Seminare 2 ml di cellule pre-coltura sopra in 200 ml di brodo LB contenente 50 ug / ml kanamicina in un pallone da 1 L. Incubare la pallone di coltura inoculato a 37 ° C per 2 ore con agitazione a 170 rpm fino l&#39;assorbanza a 600 nm raggiunge circa 0,4-0,5 rilevati mediante UV / VIS. </li><li> Aggiungere 80 ml di 1 M isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) nella cultura sopra ad una concentrazione finale di 0,4 mM di indurre l&#39;espressione di HP-NAP. Incubare la coltura per 3 ore finché l&#39;assorbanza a 600 nm raggiunge circa 1,6-1,7. </li><li> Centrifugare le cellule a 6000 xga 4 ° C per 15 minuti per rimuovere il surnatante. Conservare il pellet cellulare a -70 ° C fino purificazione. </li></ol> 2. Preparazione della frazione proteica solubile contenenti HP-NAP Nota: Tutti i seguenti passaggi vengono effettuati a 4 ° C. <ol><li> Risospendere 50 ml della cellula pEllet preparata nel protocollo punto 1.6 in 20 ml di 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl contenente 0.13 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 0,03 mM N-alpha-tosil-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK), e 0,03 mM N-tosil-L-fenilalaninil-chloromethylketone (TPCK) a 4 ° C come descritto in precedenza 16. </li><li> Frantumare le cellule dei batteri facendo passare la sospensione batterica attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione azionata ad una gamma di 15.000 a 20.000 psi per 7 volte a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il lisato cellulare a 30.000 xg a 4 ° C per 1 ora per separare le frazioni proteiche solubili e insolubili utilizzando un&#39;ultracentrifuga. Trasferire il surnatante come frazione proteica solubile in un becher. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine ​​della frazione proteina solubile con il metodo di Bradford utilizzando un kit commerciale con siero albumina bovina (BSA) come standard secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Aggiungere 177,6 ml di HCl 1 N in 20 ml di thfrazione proteica solubile e ottenuto dal protocollo punto 2.3 per regolarne il valore di pH da pH 9,0 a pH 8,0. </li><li> Aggiungere 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl alla soluzione proteica sopra per effettuare la concentrazione proteica finale sia 0,5 mg / ml. </li></ol> 3. Purificazione di ricombinante HP-NAP Da E. coli da Negativo cromatografia modalità batch con resine a scambio ionico DEAE <ol><li> Preparare 15 ml di resine DEAE. <ol><li> Pesare 0,6 g di polvere secca di resine DEAE e sospensione in 30 ml di 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl a temperatura ambiente per almeno 1 giorno. </li><li> Centrifugare la resina a 10.000 x ga 4 ° C per 1 min. </li><li> Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 15 ml di 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl. </li><li> Ripetere i passaggi protocollo 3.1.2 a 3.1.4 quattro volte di più. </li><li> Conservare i 15 ml di resina regolate (50% slurry in 30 ml di tampone Tris) a 4 ° C per un uso successivo. Nota: Tutti i seguenti steps è condotta a 4 ° C. </li></ol></li><li> Aggiungere 45 ml di proteine ​​solubili preparati nel protocollo punto 2.6 a 15 ml della resina e mescolare la poltiglia proteine ​​/ resina con un agitatore magnetico a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Versare la poltiglia proteine ​​/ resina in una colonna plastica o vetro, dotata di rubinetto. Lasciare che la resina di stabilirsi per gravità. </li><li> Aprire il rubinetto per consentire alla soluzione proteica per eseguire attraverso la colonna flusso per gravità fino a che il livello del liquido nella colonna è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso la frazione non legata, che contiene il purificato HP-NAP. </li><li> Aggiungere 15 ml di ghiaccio freddo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl nella colonna. </li><li> Aprire il rubinetto per consentire al tampone di lavaggio per eseguire attraverso la colonna flusso per gravità fino a che il livello del liquido nella colonna è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso la frazione di lavaggio. </li><li> Ripetere i passaggi protocollo 3.5 a 3.6 quattro volte di più per raccogliere le frazioni di lavaggio aggiuntivi. </li><li> Aggiungere 15 ml di ghiaccio freddo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl in una colonna. </li><li> Aprire il rubinetto per consentire al tampone di eluizione a correre attraverso la colonna flusso per gravità fino a che il livello del liquido nella colonna è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso la frazione di eluizione. </li><li> Ripetere i passaggi protocollo 3.8 a 3.9 quattro volte di più per raccogliere le frazioni di eluizione aggiuntivi. </li></ol> 4. Scambio Buffer e rimozione di endotossina HP-NAP Purificato da Negative cromatografia modalità batch con DEAE Resine Nota: Il purificato HP-NAP espresso in E. coli deve essere sottoposto al buffer di scambio e la rimozione di endotossina prima stimolare neutrofili. <ol><li> Eseguire dialisi per modificare il buffer del purificato HP-NAP di tampone fosfato salino di Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C utilizzando tubo di dialisi con molecolare cutoff peso di 14 kDa come descritto in precedenza 24. </li><li> Filtrare il HP-NAP dializzata attraverso un SyringFiltro e con una carica positiva, la membrana idrofila attaccato ad una siringa monouso da 20 ml a portate da 2,5 a 4 ml / minuto a 4 ° C per rimuovere endotossine. </li></ol> 5. caratterizzazione delle proprietà molecolari del purificata ricombinante HP-NAP di dodecil solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE), Western Blotting, nativo-PAGE, gel filtrazione Cromatografia e Circular Dicroismo Spettroscopia <ol><li> Analizzare il purificato ricombinante HP-NAP mediante SDS-PAGE e western blotting con sovranatanti di coltura di ibridomi contenenti anticorpo monoclonale murino Mab 16F4 25 come descritto in precedenza 24. </li><li> Analizzare la purificato HP-NAP da nativo-PAGE e cromatografia su gel di filtrazione per esaminare lo stato oligomerico come descritto in precedenza 26. </li><li> Analizzare il purificato ricombinante HP-NAP mediante spettroscopia di dicroismo circolare per esaminare la sua struttura secondaria come descritto in precedenza 26. </li></ol> 6. Valutazione della purezza di HP-NAP da Silver colorazione di un gel SDS-PAGE <ol><li> Preparare la soluzione di fissaggio, sensibilizzazione soluzione, soluzione d&#39;argento, soluzione di sviluppo, stop soluzione, e la soluzione di lavaggio secondo le istruzioni di un kit d&#39;argento colorazione del produttore. </li><li> Eseguire colorazione d&#39;argento di un gel SDS-PAGE secondo le istruzioni di un kit di colorazione d&#39;argento del produttore. </li><li> Acquisire l&#39;immagine del gel con un sistema di imaging. </li></ol> 7. Misura del ROS di produzione dai neutrofili indotta da HP-NAP <ol><li> Isolare neutrofili umani da sangue eparinizzato umano mediante sedimentazione destrano seguita da centrifugazione in gradiente di densità come descritto in precedenza 24. </li><li> Misura della produzione di ROS da neutrofili stimolati con HP-NAP utilizzando un saggio di chemiluminescenza luminol-dipendente. <ol><li> Attivare un lettore di piastre e impostare la temperatura a 37 ° C. Inserire unfondo piatto vuoto piatto a 96 pozzetti bianca all&#39;interno della camera di lettore di piastre, permettendo così di riscaldare a 37 ° C. </li><li> Preparare le miscele di stimolo in D-PBS, pH 7,2, contenente 0,9 mM CaCl 2, 0.5 mM MgCl 2 e 13,3 pM 5-ammino-2,3-diidro-1,4-phthalazinedione (luminol) con la presenza e assenza di 0,67 micron endotossine-rimosso HP-NAP preparata dal protocollo passo 4.2. </li><li> Regolare la concentrazione di neutrofili umani preparati protocollo punto 7.1 a 2 x 10 6 cellule / ml in D-PBS, pH 7,2, contenente 5 mM di glucosio. </li><li> Aggiungere 50 ml di sospensione di neutrofili in ciascun pozzetto della 96-bene mentre plate. </li><li> Aggiungere 150 microlitri della miscela stimolo preparati con protocollo punto 7.2.2 nei neutrofili e contenenti un intervallo di tempo di 5 secondi per pozzetto. </li><li> Misurare le emissioni di chemiluminescenza per 5 sec per oltre un periodo di tre ore utilizzando un lettore di piastre. </li></ol></li></ol> 8.La costruzione del DNA plasmidi ospitare HP-NAP Mutants da Polymerase Chain Reaction (PCR) a base di mutagenesi sito-diretta Nota: mutagenesi sito-diretta PCR-based è stato generato essenzialmente come descritto in precedenza 27, tranne che i siti di restrizione &quot;silenziose&quot; sono state introdotte per i primer di mutagenesi sito-diretta dal mutagenesi (SDM) software -Assistere 28. <ol><li> Eseguire la PCR reazione. <ol><li> Aggiungere 10 ng di plasmide pET42a-NAP, 1 mM di mutagenesi coppie di primer elencati nella tabella 1, 200 micron di trifosfati deossinucleosidici (dNTP), e 3 unità di alta fedeltà mix enzima PCR in una provetta PCR contenenti acqua deionizzata, dando una finale volume di 25 microlitri. </li><li> Avviare i cicli di PCR a 95 ° C per 10 minuti per denaturare il DNA stampo, e seguire con 12 cicli di amplificazione a 95 ° C per 1 minuto, T M No -5 ° C per 1 minuto, e 72 ° C per 6 min. </li><li> Finire i cicli di PCR conuna fase di ricottura a T m pp -5 ° C per 1 minuto ed una fase di estensione a 72 ° C per 30 min. </li></ol></li><li> Trattare 15 ml di prodotto di PCR con 0,4 ml di Dpn I restriction enzyme a 37 ° C per 2 ore e quindi analizzare 2 microlitri del prodotto PCR Dpn I trattati mediante elettroforesi su gel di agarosio. </li><li> mutanti schermo. <ol><li> Trasforma 2 ml di prodotto di PCR in E. coli DH5α cellule competenti di shock termico per 45 sec a 42 ° C. </li><li> Distribuire le cellule trasformate su una piastra di LB contenente 50 ug / ml kanamicina e incubare la piastra a 37 ° C per 16 ore. </li><li> Isolare il DNA plasmidico dalle colonie batteriche utilizzando un kit commerciale lisi alcalina secondo il protocollo del produttore. </li><li> Trattare il DNA plasmide isolato nel protocollo passo 8.3.3 con XhoI enzima di restrizione per verificare la presenza delle mutazioni silenti desiderati secondo il protocollo del produttore. </li><li> sequenza ilplasmide DNA verificato da protocollo passo 8.3.4 con T7 promotore primer per confermare la correzione delle sequenze codificanti di mutanti HP-NAP secondo il protocollo del produttore. </li></ol></li></ol>

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HWF and YCY are inventors of patents TW I 432579 and US 8,673,312 for the method of one-step purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. All materials described in the manuscript will be available for research purposes. The authors confirm that this does not alter their adherence to all of the JoVE's policies on sharing data and materials.

La modalità di cromatografia lotto negativo con resine a scambio anionico DEAE qui presentata è adatto per la purificazione di ricombinante HP-NAP sovraespresso in E. coli. I valori di pH dei tamponi usati nelle fasi di lisi cellulare e purificazione sono molto critici per assicurare la solubilità di HP-NAP in E. lisati coli e efficiente separazione dei ricombinante HP-NAP dalle impurità cellula ospite, rispettivamente. Le cellule batteriche devono essere lisati a pH 9,0, e la purificazione negativo devono essere eseguite a pH 8.0 per ottenere HP-NAP in alto rendimento e di elevata purezza. Il recupero di HP-NAP è del 90%, e la tipica purezza è 95% 24. Poiché HP-NAP è presente nella frazione non legata, una quantità minima ma sufficiente della resina deve essere utilizzato per ottenere la capacità massima di assorbire le impurità. Nel nostro caso, il carico massimo è di 1,5 mg di proteine ​​solubili da E. lisati coli per resina millilitro. il Proviprotocollo ded è stato progettato per la purificazione di ricombinante HP-NAP da un ml E. 50 cultura coli. La resa di HP-NAP è di circa 15 mg. Il processo di purificazione può essere sia in scala ridotta o in scala-up di conseguenza. Ad esempio, i due ricombinanti HP-NAP Y101H e HP-NAP mutanti E97GY101H sono stati purificati da un ml E. 1 cultura coli utilizzando questo negativo cromatografia modalità batch. Entrambi i mutanti HP-NAP con purezza superiore al 95% sono stati ottenuti raccogliendo la frazione libera (Figura 4). Questa negativo cromatografia modalità batch sono stata applicata anche per purificare ricombinante HP-NAP da un ml E. 860 cultura coli. Il recupero del gradino utilizzando DEAE negativo cromatografia modalità batch ha raggiunto il 97% di purezza superiore al 90%. HP-NAP espresso in Bacillus subtilis (B. subtilis), è stato anche purificato con successo da questo DEAE modalità negativa cromatografia lottiin un solo passaggio 26. Nel nostro B. sistema di espressione subtilis, il livello di espressione di HP-NAP è basso. HP-NAP rappresenta solo circa il 5% delle proteine ​​solubili totali da lisati batterici. Anche se HP-NAP mirato per purificazione è presente in piccola quantità, HP-NAP con purezza superiore al 90% può essere ottenuto riducendo il rapporto tra la quantità di proteine ​​da lisati cellulari caricati sulla resina per rimuovere efficacemente quasi tutto il endogena proteine ​​da B. subtilis 26. Così, questo metodo può essere applicato anche per purificare ricombinante HP-NAP espressa in altri ospiti batterici. Diversi metodi sono stati riportati per la purificazione di ricombinante HP-NAP nella sua forma nativa 14-16. Tuttavia, un passo ulteriore cromatografia gel filtrazione è necessaria per ottenere HP-NAP a elevata purezza. Questa purificazione cromatografica negativo può produrre in modo efficiente funzionale ricombinante HP-NAP con elevata purezza in un unico passaggio. in additiil passo di desalinizzazione non è necessario a causa della bassa concentrazione di sale nella frazione non legata. La purificazione modalità batch potrebbe ovviare alla necessità di una colonna. Così, questo negativo cromatografia modalità batch utilizzando resina DEAE offre un metodo semplice ed efficace per purificare HP-HAP, nella sua forma nativa con alta resa e purezza. HP-NAP purificato mediante questo metodo potrebbe essere ulteriormente utilizzato per lo sviluppo di vaccini, nuovi farmaci e diagnostica per H. pylori -related malattie o per altre nuove applicazioni terapeutiche.

Helicobacter pylori (H. pylori) è una delle principali cause di gastrite e ulcera peptica. Questo batterio è stato classificato come sostanza cancerogena per l&#39;uomo dall&#39;Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro, che fa parte dell&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità, nel 1994. E &#39;stato stimato che la prevalenza di H. pylori è del 70% nei paesi in via di sviluppo e il 30-40% nei paesi industrializzati 1. Anche se il tasso di infezione di H. pylori è in calo nei paesi industrializzati, il tasso di infezione di H. pylori nei paesi in via di sviluppo è ancora alto 2. Il trattamento standard per sradicare H. pylori consiste nella somministrazione di un inibitore della pompa protonica, PPI, e due antibiotici, claritromicina più amoxicillina o metronidazolo 3. Tuttavia, l&#39;aumento della resistenza agli antibiotici in H. pylori -related terapia dell&#39;ulcera sollecita lo sviluppo di nuove strategie per prevenire or curare l&#39;infezione. Sviluppo di vaccinazione preventiva e / o terapeutico contro H. pylori potrebbe fornire un approccio alternativo per controllare H. pylori. Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine ​​(HP-NAP), un importante fattore di virulenza di H. pylori, è stato identificato in estratti di acqua di H. pylori con la possibilità di attivare neutrofili di aderire alle cellule endoteliali e produrre specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) 4. Infiltrazione dei neutrofili della mucosa gastrica si trovano in H. pylori pazienti infettati con gastrite attiva possono provocare infiammazione e danni ai tessuti dello stomaco. Così, HP-NAP può giocare un ruolo patologico attivando neutrofili per indurre infiammazione gastrica, che provoca ulteriore ulcera o H. pylori -associated malattie gastriche. Tuttavia, HP-NAP è un potenziale candidato per le applicazioni cliniche 5,6. A causa della pro immunogenica e immunomodulanteprietà di HP-NAP, questa proteina potrebbero essere utilizzati per sviluppare vaccini, agenti terapeutici, e strumenti diagnostici. Uno studio clinico è stato condotto per l&#39;utilizzo ricombinante HP-NAP come uno dei componenti di un vaccino contro H. proteine pylori. Questo vaccino è costituito da ricombinante HP-NAP, cytotoxin associata gene A (CagA), e le proteine ​​vacuolizzante citotossina A (VacA) formulato con idrossido di alluminio ed è stato ulteriormente dimostrato di essere sicuro ed immunogenico negli esseri umani 7. Inoltre, HP-NAP agisce come un potente immunomodulatore per innescare T helper di tipo 1 (Th1) -polarized risposte immunitarie per la terapia del cancro 8 e per regolare le risposte immunitarie Th2-mediate indotte da reazioni allergiche e infezioni parassitarie 9,10. Per quanto riguarda la diagnostica, ricombinante ELISA HP-NAP-based è stata applicata per rilevare gli anticorpi sierici contro HP-NAP in H. pylori -infected pazienti 11. Uno studio ha mostrato che il livello di anticorpi specifici per HP-NAP nei sieri di H. pylori -infected pazienti con cancro gastrico è risultata significativamente più alta di quella di pazienti con gastrite cronica 12. Un altro studio ha anche dimostrato che gli anticorpi sierici contro HP-NAP sono associati con la presenza di non-cardias adenocarcinoma gastrico 13. Così, ricombinante ELISA HP-NAP-based può essere applicata per rilevare anticorpi contro HP-NAP per la prognosi del cancro gastrico in H. pylori -infected pazienti. Nel loro insieme, la HP-NAP purificata potrebbe essere ulteriormente utilizzato per la prevenzione, il trattamento e la prognosi di H. pylori -associated malattie e terapia del cancro. Tra i vari metodi utilizzati per la purificazione di ricombinante HP-NAP espresso in Escherichia coli (E. coli), nella sua forma nativa, presentate finora, una cromatografia di gel-filtrazione seconda fase di purificazione che coinvolge è necessario per ottenere elevata purezza HP-NAP 14-16 . Qui, un metodo che utilizza negativo cromatografia modalità batch condietilamminoetil (DEAE) resine a scambio ionico è descritto per la purificazione di HP-NAP sovraespresso in E. coli con alto rendimento e di elevata purezza. Questa tecnica di purificazione è stata basata sul legame di proteine ​​della cellula ospite e / o impurezze diverse HP-NAP alla resina. A pH 8,0, quasi senza altre proteine ​​tranne HP-NAP vengono recuperati dalla frazione non legata. Questo approccio purificazione mediante DEAE cromatografia a scambio ionico in modalità negativa è semplice e risparmio consentendo purificazione ricombinante HP-NAP tramite one-step cromatografia attraverso la raccolta della frazione libera tempo. Oltre ad HP-NAP, diverse altre biomolecole, come virus 17, Immunoglobulina G (IgG) 18, emoglobina 19, proteina fosfatasi 20, e fattore di virulenza flagellin 21, sono stati segnalati anche ad essere purificata dalla cromatografia a scambio ionico in negativo modalità. La modalità negativa è preferito per cromatografia a scambio ionico se impurità sono il minorecomponenti presenti nel campione sottoposto da depurare 22. L&#39;applicazione della cromatografia negativo purificazione di biomolecole naturali o ricombinanti è stato recentemente rivisto 23. Il presente rapporto fornisce un passo per passo il protocollo per l&#39;espressione ricombinante HP-NAP in E. coli, la lisi delle cellule, e purificazione di HP-NAP utilizzando modalità negativa cromatografia batch con resine a scambio ionico DEAE. Se una proteina desiderata per purificazione è adatto per cromatografia a scambio ionico in modo negativo, il protocollo descritto potrebbe anche essere adattato come punto di partenza per lo sviluppo di un processo di purificazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET42a-NAP&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&#160; 
			https://www-sciencedirect-com.remotexs.ntu.edu.sg/science/article/pii/S0006291X08018317</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>MD Biomedical Inc</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&#38;supplier=search&#38;name =IPTG%20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7254</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4376</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate</td>
			<td>Bio&#8208;Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>for protein quantitation 
			http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5619&#160;</td>
			<td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE&#8211;Sephadex &#160;A-25 chloride form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A25120</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum/Por dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132720</td>
			<td>with molecular weight cutoff of 14 kDa 
			http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc&#174; units with Mustang&#174; E membrane</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MSTG25E3</td>
			<td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min 
			http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&#160; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA 
			https://www-sciencedirect-com.remotexs.ntu.edu.sg/science/article/pii/S0264410X10017585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28989335</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne silver staining kit, protein</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1150-01</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well white plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>236108</td>
			<td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>protected from light 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand &#160;long template PCR system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td>source of High Fidelity PCR enzyme mix 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xho I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Product Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin Inc</td>
			<td>C315320</td>
			<td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi Koki Co</td>
			<td>90106401</td>
			<td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates 
			http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>18-1900-26</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td>
			<td>Aviv Biomedical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 imaging system</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>discontinued and replaced 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>1420-018</td>
			<td>for chemiluminescence detection 
			http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine ​​(HP-NAP) è un importante fattore di virulenza di Helicobacter pylori (H. pylori). Essa svolge un ruolo fondamentale in H. pylori indotta infiammazione gastrica attivando diversi leucociti innate tra neutrofili, monociti e mastociti. Le proprietà immunogeniche e immunomodulanti di HP-NAP lo rendono un candidato potenziale diagnostico e vaccino per H. pylori e un nuovo candidato farmaco per la terapia del cancro. Per ottenere quantità sostanziali di purificato HP-NAP utilizzato per le sue applicazioni cliniche, un metodo efficace per purificare questa proteina con alta resa e purezza deve essere stabilito. In questo protocollo, abbiamo descritto un metodo per un passo negativo purificazione cromatografica ricombinante HP-NAP sovraespresso in Escherichia coli (E. coli) utilizzando dietilamminoetil (DEAE) resine a scambio ionico (per es., Sephadex) imodalità batch n. Ricombinante HP-NAP costituisce quasi il 70% delle proteine ​​totali in E. coli ed è quasi completamente recuperato nella frazione solubile upon lisi cellulare a pH 9,0. A condizione ottimale a pH 8,0, la maggioranza di HP-NAP viene recuperato nella frazione non legata mentre le proteine ​​endogene da E. coli sono efficacemente rimossi dalla resina. Questo metodo di purificazione mediante cromatografia modalità negativa batch con resine a scambio ionico DEAE produce funzionale HP-NAP da E. coli nella sua forma nativa con alta resa e purezza. L&#39;HP-NAP purificata potrebbe essere ulteriormente utilizzato per la prevenzione, il trattamento e la prognosi di H. pylori -associated malattie e terapia del cancro.

Lo schema della procedura sperimentale di purificazione negativo ricombinante HP-NAP espressa in E. coli mediante resine a scambio ionico DEAE in modalità batch è mostrato in Figura 1. Questa tecnica di purificazione è basato sul legame di proteine ​​della cellula ospite e / o impurezze diverse HP-NAP alla resina. A pH 8,0, quasi senza altre proteine ​​tranne HP-NAP nella sua forma nativa vengono recuperati dalla frazione libera (Figura 2A e B). Il purificato HP-NAP della frazione non legata è stata immunodetected dagli anticorpi contro HP-NAP (Figura 2C), e la sua purezza era superiore al 97% come confermato mediante colorazione argento (Figura 2D). Inoltre, il purificato ricombinante HP-NAP mantenuto sua forma oligomerica come analizzato da nativo-PAGE (Figura 2B) e la cromatografia per gel filtrazione (Figura 3A). Circolare spectroscop dicroismoanalisi ic ha mostrato che la proteina purificata è composto principalmente da alfa-eliche (Figura 3B). Inoltre, il purificato HP-NAP era in grado di stimolare neutrofili umani per produrre ROS (Figura 3C). Così, il ricombinante HP-NAP purificato mediante questo approccio è nella sua forma nativa con attività biologica. Inoltre, questo negativo cromatografia modalità batch può essere usata per purificare ricombinante HP-NAP con mutazioni puntiformi in un unico passaggio. Come mostrato in figura 4, le due ricombinanti mutanti HP-NAP Y101H e HP-NAP E97GY101H, che imitano HP-NAP di H. pylori NCTC 11639 e NCTC 11.637 casi ceppi rispettivamente, sono stati purificati da questa modalità negativa cromatografia batch con purezza superiore al 95%. Per eseguire negativo cromatografia modalità batch utilizzando resine DEAE per purificare HP-NAP, il valore pH del tampone utilizzato per la purificazione deve essere regolata a 8.0per assicurare che la maggior parte di HP-NAP è presente nella frazione non legata. Minore quantità di HP-NAP era presente nelle frazioni non associati quando il valore pH del tampone è superiore o inferiore a 8,0 (Figura 5). Anche se la purezza di HP-NAP presente nelle frazioni non legato è stata aumentata solo un po &#39;come pH aumentato da 7.0 al 9.0, la quantità di HP-NAP presente nelle frazioni non legato era il più alto quando il valore pH del tampone era pH 8,0 (Figura 5). La quantità di proteine ​​solubili da lisati cellulari caricati sulla resina è un altro fattore importante per questa purificazione. Qui, il rapporto è di 1,5 mg di proteine ​​alla resina millilitro per conseguire la massima capacità della resina di assorbire le impurità da E. coli (Figura 6). Inoltre, la purezza e resa di HP-NAP ottenuto da questo negativo cromatografia modalità batch possono essere notevolmente aumentata aumentando la quantità di HP-NAP presente nella frazione solubileE. coli lisati. Ricombinante HP-NAP fu quasi completamente recuperato nella frazione solubile upon lisi cellulare a pH 9,0 (Figura 7). Anche se la solubilità ricombinante HP-NAP in E. coli lisati era marcatamente aumentata quando le cellule sono state lisate in tampone con pH superiore a 7,5 (figura 7), meno del 90% di HP-NAP era presente come proteina solubile quando le cellule sono state lisate in tampone con pH inferiore a 9,0. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig1.jpg" /> Figura 1:. Schema Schema della Purificazione negativa di HP-NAP dalla DEAE Resine in modalità batch La purificazione inizia con una procedura batch vincolante. La frazione proteica solubile contenente HP-NAP ottenuto da lisati batterici viene aggiunto alla resina DEAE pre-equilibrata con Tris-tampone a pH 8,0. Le proteine ​​/ fanghi resina vengono poi incubate a 4 ° C per 1 ora con dolce mixing. Durante l&#39;incubazione, le proteine ​​della cellula ospite legano alla resina. HP-NAP presente nella frazione non legata è ottenuto da una raccolta del surnatante dopo la centrifugazione o dalla frazione flusso continuo da una colonna gestito da flusso di gravità. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig2.jpg" /> Figura 2:. Risultato Esempi di Purificazione di HP-NAP di Negative Cromatografia modalità batch con resine a scambio ionico DEAE L&#39;intero lisato cellulare (W) e frazione proteina solubile (S) di E. coli BL21 (DE3) che esprime HP-NAP e la frazione non legata (U) contenente HP-NAP da DEAE cromatografia a scambio ionico sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (A), nativo-PAGE (B), e Western blotting (C). Il frac non legatozione con la quantità indicata di proteine ​​che vanno da 1 mg a 10 mg è stato analizzato su un gel SDS-PAGE silver-tinto (D). masse molecolari (M) in kDa sono indicati sulla sinistra dei gel colorati e la macchia. (Adattato da riferimento 24) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig3.jpg" /> Figura 3: strutturale e caratterizzazione funzionale di ricombinante HP-NAP purificata da E. coli di Negative cromatografia modalità batch. (A) Il profilo assorbanza UV è stato registrato per HP-NAP eluito dalla colonna di gel-filtrazione. Le masse molecolari delle proteine ​​marker sono stati indicati sul cromatogramma. (B) L&#39;lontano UV dicroismo circolare SPECTrum di HP-NAP è stato registrato presso la gamma di lunghezze d&#39;onda di 195 a 260 nm. (C) neutrofili umani (1 x 10 5 cellule) sono stati trattati con 0,5 mM HP-NAP e D-PBS, pH 7,2, come controllo negativo a 37 ° C. Il contenuto di ROS generati dai neutrofili è stata misurata in continuo mediante un saggio di chemiluminescenza luminolo-dipendente. I dati sono stati rappresentati come media ± deviazione standard di un esperimento in triplicato. (Adattato da riferimento 24) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig4.jpg" /> Figura 4: Purificazione di ricombinanti Mutanti HP-NAP Espresso in E. coli da Negativo cromatografia modalità batch. Le frazioni proteiche solubili di E. coli BL21 (DE3) che esprime due ricombinanti HP-NAP Y101H e HP-NAP mutanti E97GY101H e wild-type HP-NAP sono stati purificati dal cromatografia modalità negativa con resine DEAE. Le frazioni non legate sono stati analizzati mediante SDS-PAGE. Masse molecolari (M) in kDa sono indicati sul lato sinistro dei gel colorati. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig5.jpg" /> Figura 5: Effetto del pH tampone sulla Purificazione di ricombinante HP-NAP Espresso in E. coli di Negative cromatografia modalità batch. La frazione solubile di E. coli BL21 (DE3) che esprime HP-NAP lisate a pH 9,0 sono stati adeguati al pH indicato vanno da 7.0 a 9.0 e una concentrazione proteica di 0,3 mg / ml. questi regolatafrazioni, indicate come carico, sono stati poi caricati su resine DEAE per purificare ricombinante HP-NAP da negativo cromatografia modalità batch a 4 ° C. Il coniugato, lavaggio, e le frazioni di eluizione sono stati analizzati mediante SDS-PAGE. masse molecolari (M) in kDa sono indicati sulla sinistra del gel macchiati. (Adattato da riferimento 24) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig6.jpg" /> Figura 6: Effetto della quantità di proteine ​​caricato su DEAE Resine per purificare ricombinante HP-NAP Espresso in E. coli. Le frazioni proteiche solubili di E. coli BL21 (DE3) che esprime HP-NAP sono stati caricati su resine DEAE in base alla il rapporto indicato di proteine ​​mg per millilitro di resine per purificare recombinant HP-NAP dal negativo cromatografia modalità batch a pH 8,0. Le proteine ​​solubili, indicati come carico (L), la frazione non legata (A), frazione di lavaggio (B), e la frazione di eluizione (C) sono stati analizzati mediante SDS-PAGE. masse molecolari (M) in kDa sono indicati sulla sinistra del gel macchiati. (Da riferimento 24) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54043/54043fig7.jpg" /> Figura 7: Effetto del pH sulla solubilità di HP-NAP in E. coli lisati. (A) E. coli BL21 (DE3) che esprime HP-NAP è stata sospesa in tampone Tris-HCl ghiacciata al pH indicato vanno da 7.0 e 9,5. Le cellule sono state lisate e lisati cellulari poi interi (W) sono stati centrifugati to separare le frazioni solubili (S) e pellets insolubili (I). Le proteine ​​sono stati analizzati mediante SDS-PAGE. masse molecolari (M) in kDa sono indicati sulla sinistra del gel macchiati. (B) La percentuale di solubilità ricombinante HP-NAP in tutta lisato cellulare ad ogni pH è stato calcolato dalla intensità della banda di HP-NAP su gel SDS per la frazione solubile (S) diviso che per il lisato cellula intera (W ). I dati sono stati rappresentati come media ± deviazione standard di almeno due esperimenti. (Da riferimento 24) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54043/54043tbl1.jpg" /> Tabella 1: primer utilizzati per la mutagenesi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54043/54043tbl1large.jpg" target="_blank">Si prega di cl</a>ick qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

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One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Un metodo ad alto rendimento per un solo passaggio di purificazione negativo ricombinante Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine ​​(HP-NAP) sovraespresso in Escherichia coli utilizzando resine dietilamminoetil in modalità batch è descritta. HP-NAP purificata da questo metodo è utile per lo sviluppo di vaccini, farmaci, o diagnostica per H. pylori -associated malattie.

Un passo negativo cromatografica Purificazione di<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In modalità batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

9.6K Views.  National Tsing Hua University.  Un metodo ad alto rendimento per un solo passaggio di purificazione negativo ricombinante Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine ​​(HP-NAP) sovraespresso in Escherichia coli utilizzando resine dietilamminoetil in modalità batch è descritta. HP-NAP purificata da questo metodo è utile per lo sviluppo di vaccini, farmaci, o diagnostica per H. pylori -associated malattie. 

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Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Non invasiva Modello di neuropatogeno<em&gt; Escherichia coli</em&gt; L&#39;infezione neonatale nel ratto

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Ad alta risoluzione microscopia elettronica del<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag secrezione di tipo IV Sistema Pili Prodotto in diverse condizioni di Ferro Disponibilità

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Purificazione di una proteina di massa molecolare elevata in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...