Siamo grati per l'assistenza tecnica del Dr. Suchitra Swaminathan che gestisce il nucleo di Northwestern Feinberg School di medicina citometria a flusso. Finanziamento è stato fornito da DK101675 (NIH).

Tutto il lavoro animale fu approvato il IACUC nord-occidentale. Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità e rispetto di tutti i pertinenti orientamenti normativi e istituzionali. Per soggetti umani donazione di sangue, un consenso informato è stato presentato e firmato; Inoltre, tutti i soggetti umani in questo studio sono stati trattati in conformità con le linee guida istituzionali e federale per il benessere umano.
Nota: La procedura di protocollo sono elencati sotto le sottosezioni seguenti: (i) isolamento delle cellule del midollo osseo del Mouse; (ii) PMN isolamento da midollo osseo murino; (iii) PMN isolamento da sangue umano; (iv) MP isolamento da surnatanti PMN (dall'ultracentrifugazione); (v) caratterizzazione di MPs mediante Western Blotting; (vi) caratterizzazione di MPs da citometria a flusso; (viii) l'applicazione di MPs isolato per la guarigione della ferita di studio
1. isolamento delle cellule del midollo osseo Mouse
<ol style="margin-left: 40px;"><li>
Dissezione del femore e della tibia da piedini posteriori del mouse
	<ol>
<li>Preparare una scatola di eutanasia (ad esempio, una casella di punta vuota 1 mL) per inalazione dell'anestesia. Aggiungere poche gocce di isoflurane 100% su un panno sterile registrato all'interno di un coperchio di scatola di plastica. Secondo le nuove linee guida IACUC, animali non dovrebbe entrare in contatto diretto con isoflurano, così posto un titolare di punta tra il mouse e la garza contenente l'isoflurano. Nota: Isoflurane è un potente anestetico da inalazione e devono essere maneggiate con estrema cautela all'interno di una cappa aspirante.</li>
		<li>Eutanasia topi secondo la raccomandazione IACUC. Posizionare un mouse all'interno della scatola di eutanasia descritta al punto 1.1.1 per 1 – 5 min fino a quando non ha smesso di respirare. Garantire la morte dell'animale eseguendo una dislocazione cervicale.</li>
		<li>Sollevare la pelle addominale utilizzando acciaio inox, 12 cm curvata, pinzette 0,17 X 0,1 mm e tagliare la pelle a metà strada tra l'estremità superiore e inferiore. La buccia da qui alla sezione più distale del corpo del mouse compreso le estremità più basse. Con 10 cm di lunghezza, dritto di dissezione Forbici, rimuovere i muscoli dalle zampe posteriori e dislocare l'articolazione dell'anca, lasciando intatta la testa del femore.</li>
		<li>Usare le forbici per sezionare i muscoli dal femore e la tibia e separare il femore, dalla tibia. Assicurarsi che le estremità delle ossa rimangono intatte, in quanto contengono quantità significative di midollo osseo.</li>
		<li>Rimuovere tutta la carne rimanente facendo rotolare le ossa all'interno di un tovagliolo di carta. Posizionare le ossa pulite in una piastra Petri contenente Medium senza siero (SFM, cioè, esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM) senza siero o antibiotici).</li>
		<li>Sciacquare le ossa in etanolo al 70% e poi in SFM.</li>
		<li>Preparare 50 mL di SFM in una provetta conica da 50 mL. Caricare 10 mL di SFM in una siringa da 10 mL e allegarlo a un ago di calibro 25 e 5/8 di pollice.</li>
		<li>Tagliare le estremità delle ossa con le forbici, fino a un'apertura al midollo osseo (colore rossastro) è visibile.</li>
		<li>Lavare le cellule del midollo osseo in una nuova provetta da 50 mL. Utilizzare una siringa da 10 mL con un ago di calibro 26 e 5/8 di pollice con circa 3 mL/osso di SFM. Al termine di vampate di calore, risospendere le cellule nel tubo pipettando (punte di plastica monouso da 1 mL uso) per rompere aggregati cellulari.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PMN isolamento dal midollo osseo murino
<ol><li>
Lisi delle cellule rosse
	<ol>
<li>Pellet di midollo osseo raccolto mediante centrifugazione a 350 x g per 8 min a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di 0,2% NaCl per circa 20-30 s a lisare la frazione dell'eritrocito. Non superare 30 s come questo si tradurrà nella lisi PMN. Aggiungere 20 mL di 1,6% NaCl per ripristinare osmolalità. Nota: Questo passaggio può portare all'attivazione di PMN molto poco.</li>
		<li>Lavare le cellule con 2 mL di PBS e centrifugare come descritto al punto 2.1.1 sopra. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Procedere alla separazione PMNs centrifugazione in gradiente di densità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento dei neutrofili di centrifugazione in gradiente di densità
	<ol>
<li>Caldo polysucrose e sodio diatrizoate soluzioni, con densità di 1,119 g/mL e 1,077 g/mL (Vedi Tabella materiali), a temperatura ambiente (TA) prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare polysucrose e sodium diatrizoate gradienti freschi, immediatamente prima dell'applicazione delle cellule del midollo osseo di stratificazione lentamente 3 mL di soluzione densità 1,077 g/mL oltre 3 mL di soluzione di densità 1,119 g/mL in provette coniche da 15 mL. Nota: La preparazione della soluzione gradiente troppo lontano in anticipo si tradurrà in miscelazione degli strati e scarsa purezza del neutrofilo e recupero.</li>
		<li>Risospendere il pellet di cellule del midollo osseo in 1 mL di PBS ghiacciata e la sospensione cellulare risultante in cima il diatrizoate polysucrose e sodio di sovrapposizione sfumatura (lentamente, per evitare la miscelazione degli strati).</li>
		<li>Centrifuga per 30 min a 850 x g a 25 ° C a RT, senza freno. Conservare i reagenti a RT per separazione effettiva dei neutrofili dalle altre cellule presenti nel midollo osseo. Impostare la centrifuga in decelerazione lenta per consentire il gradiente deve essere efficiente formata e mantenuta dopo la fase di centrifugazione.</li>
		<li>Localizzare visivamente uno strato di cellule mononucleari all'interfaccia di PBS e soluzione di densità 1,077 g/mL (livello superiore). Rimuovere questo strato e il resto della soluzione densità senza disturbare la band PMN.</li>
		<li>Raccogliere un intero livello PMN e alcune delle polysucrose sottostante e soluzione di sodio diatrizoate 1,119 g/mL in provette da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento. Nota: La purezza dell'isolato PMNs dipenderà una rimozione completa dello strato superiore.</li>
		<li>Home page i tubi con filtrata PBS (filtrata attraverso un filtro di dimensione dei pori di 0.1 µm) e centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Lavare il pellettato PMNs con 2 mL di PBS utilizzando le condizioni di centrifugazione come descritto al punto 2.2.7.</li>
		<li>Risospendere in 1 mL di PBS filtrata e contare i PMNs isolato di un emocitometro. Nota: Per questo metodo di isolamento, la purezza PMN risultante ammonta a ~ 85-90%, come è stata valutata da citometria a flusso. Il restante contaminando le frazioni costituita principalmente da linfociti mononucleari.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimolazione di PMN di indurre il rilascio di MP Nota: PMNs possono essere stimolate a rilasciare MPs utilizzando varie condizioni d'attivazione, tra cui N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) o interferone gamma (IFNγ). Importante, prima della simulazione, PMNs dovrebbero essere tenuti su ghiaccio in ogni momento.<ol>
<li>PMNs pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) e risospendere in 0,1 µm filtrata soluzione soluzione (HBSS) salina bilanciata di Hank, contenente l'agente stimolante della scelta. Per stimolazione ottima, utilizzare 100 µ l di soluzione di stimolazione per 10 milioni PMNs per 20-30 min a 37 ° C in provette da 15 mL. Nota: Le seguenti concentrazioni di attivatori sono state utilizzate con successo nel nostro lavoro precedente: fMLF (0,5-1 µM per umani e 2-5 µM per mouse PMNs), PMA (200 nM) e IFNγ (100 ng/mL). Se è previsto il rilascio di MPs pre-etichettata, incubare PMNs non stimolate (1-5 x 106) con N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (Vedi Tabella materiali) (1 µM 100 µ l HBSS, 15 min, 37 ° C). Procedere con la procedura 2.3.1-2.3.3.</li>
		<li>Rotazione verso il basso a 850 x g per 5 min a 4 ° C, per rimuovere PMNs e trasferire senza cellula surnatanti a nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		<li>Per l'isolamento di MP da surnatanti senza cellula, continuare al punto 4.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PMN isolamento da sangue umano
<ol><li>
Reclutare volontari sani per l'estrazione di sangue secondo le linee guida istituzionali IRB.
	<ol>
<li>Raccogliere il sangue dall'avambraccio di un volontario sano nelle provette contenenti citrato di sodio a 5ml commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Pipettare 5 mL della soluzione di diatrizoate destrano e sodio (densità 1,113 g/ml, Vedi Tabella materiali) in provette sterili da 15 mL e lentamente strato 5 mL di sangue periferico umano appena isolato in cima esso.</li>
		<li>Centrifugare le provette per 50 min a 400 x g a temperatura ambiente (25 ° C) con bassa accelerazione e senza freno.</li>
		<li>Al termine della centrifugazione, rimuovere il plasma e cellule mononucleari (strato superiore) utilizzando una pipetta sterile di aspirazione in plastica.</li>
		<li>Trasferire lo strato inferiore (PMNs) in una nuova provetta conica sterile 50 mL.</li>
		<li>Aggiungere un volume equivalente di 0,45% NaCl di PMNs (mix bene e delicatamente ruotando il tubo).</li>
		<li>Centrifugare per 10 min 400 x g e a 25 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lisi delle cellule rosse
	<ol>
<li>Aggiungere 10 mL di acqua ghiacciata, sterile a pellettato cellule per 45 s seguita da 10 mL di gelida sterile 1,8% NaCl per ripristinare osmolalità. Nota: Tutti i passaggi seguenti per isolamento di PMN devono essere eseguiti sul ghiaccio per evitare l'attivazione di PMN e rilascio prematuro di MP. Il passo di lisi stessa provoca l'attivazione di PMN minore ma non significativo, tuttavia, è essenziale per l'isolamento di una popolazione di PMN pura per analisi funzionali.</li>
		<li>Centrifugare le cellule per 10 min a 250 x g a 4 ° C con decelerazione morbida.</li>
		<li>Ripeti punti 3.2.1 e 3.2.2.</li>
		<li>Risospendere PMNs in 5 mL di HBSS ghiacciata senza calcio o magnesio. Conteggio totale di cellule vive (USA un emocitometro e attuabilità macchiatura alla diluizione 1:2, Vedi Tabella materiali) prima di stimolazione. Nota: PMNs isolato dovrebbe essere usato per la stimolazione o altri esperimenti entro 2 h di isolamento per evitare cambiamenti funzionali e cellulari e morte cellulare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MP isolamento da surnatanti attivato PMN
Nota: Un simile protocollo viene utilizzato per l'isolamento di MPs da PMNs murine ed umane.
<ol><li>PMNs pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) e risospendere in 0,1 µm filtrata soluzione HBSS, contenente l'agente stimolante della scelta (per esempio 1 µM fMLF, vedere Nota: 2.3.1). Per stimolazione ottima utilizzare 100 µ l di soluzione di stimolazione per 10 milioni PMNs per 20-30 min a 37 ° C in provette da 15 mL.</li>
	<li>Dopo stimolazione, spin giù PMNs attivato a 600 x g per 5 min a 4 ° C e trasferire senza cellula surnatanti in nuove provette microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugare il supernatante PMN-cancellata a 13.000 x g, 10 min, 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari e trasferire il surnatante eliminato in una nuova provetta di ultracentrifuga.</li>
	<li>Centrifugare per 1 h a 100.000 x g, a 4 ° C. Rimuovere i surnatanti prima dello stoccaggio MP. Se necessario, archivio pellettato MPs in paraffina sigillato tubi ultracentrifuga a-80 ° C fino all'utilizzo negli esperimenti.</li>
</ol>5. esame dei PMN-MPs mediante Western Blotting
<ol><li>Aggiungere 1% SDS tampone (50-200 µ l con 100 millimetri Tris pH: 7,4) a MPs a pellet (dal punto 4.4), trasferimento a nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL e portare a ebollizione il lisato MPs per 5 min. Nota: Il numero di parlamentari e il volume di tampone di Lisi deve essere regolato e ottimizzato per ogni proteina di interesse.</li>
	<li>
Caricare gli importi uguali di PMN-MPs per corsia in tampone contenente β-mercapto-etanolo al 10% di carico. Nota: Con il nostro metodo carichiamo i parlamentari che sono stati isolati dallo stesso numero di PMN stimolato.<ol>
<li>Separare i lisati mediante SDS-PAGE su gel di poliacrilammide del 10% (utilizzare 50-100 V per 1-1,5 h) e il trasferimento di proteine totali sulle membrane di nitrocellulosa come descritto9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membrane per 1 h con 5% senza grassi del latte in 0.05% Tween-20 soluzione fisiologica tamponata di bloccare e viene quindi incubato con un appropriato primario (una notte a 4 ° C), seguito da anticorpi secondari coniugati a HRP.</li>
	<li>Visualizzare le bande aggiungendo soluzione di chemiluminescenza per la membrana e l'esposizione ad una pellicola di raggi x all'interno di una cassetta a prova di luce (1-24 h).</li>
</ol>6. l'esame dei PMN-MPs tramite flusso Cytometry
<ol><li>
Per la macchiatura dell'anticorpo, diluire gli anticorpi in modo appropriato nel buffer di FACS (PBS con 0,1 mM EDTA, 0,1% di sodio azide). Risospendere pellettato PMN-MPs (derivato da 1-3 x 106 PMNs/condizione) in 100 µ l di soluzione di anticorpo.
	<ol>
<li>Se la macchiatura per annessina V, risospendere pellettato PMN-MPs in tampone di Annexin V contenente 5 µ l di coniugato FITC Annessina V. Se co-macchiando con gli anticorpi, aggiungere gli anticorpi desiderati (per vedere un esempio Tabella materiali) direttamente alla soluzione di annessina V. Aggiungere il colorante fluorescente del lipido, N-(2-aminoethyl) maleimide (Vedi Tabella materiali), a 1 concentrazione µM in 100 µ l di tampone di FACS per etichettare e identificare MPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare la MPs nella macchiatura soluzione per almeno 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare il MPs dall'ultracentrifugazione (1h a 100.000 x g, a 4 ° C); scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere in FACS tampone ed eseguire gli esempi su un citometro a flusso designato dotato di un'unità elettronica aggiornata per una maggiore sensibilità (Vedi Tabella materiali).</li>
</ol>7. le domande di isolato PMN-MPs studiare la funzione PMN nella guarigione delle ferite
<ol><li>
Somministrazione in vivo di PMN-MPs a coliche ferite
	<ol>
<li>Anestetizzare topi tramite un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Confermare l'anestesia da pedale reflex (pizzico di punta costante) e regolare secondo necessità.</li>
		<li>Posizionare il mouse sul suo stomaco e utilizzando pinze da biopsia di 28 cm e un endoscopio dotato di una fotocamera ad alta risoluzione (ad esempio un endoscopio veterinario per piccoli animali utilizzare, Vedi Tabella materiali), generare 3-5 ferite superficiali lungo il lato dorsale della due punti. Al termine del ferimento, topi di ritorno per una gabbia inserito su una stuoia di temperatura (37 ° C) fino a quando non ha recuperato.</li>
		<li>Anestetizzare topi (come al punto 7.1.1). Utilizzare un endoscopio per acquisire immagini di ferite inflitte post-ferendone 24 h (giorno 1). Lasciate che i topi recuperare come descritto al punto 7.1.2.</li>
		<li>Allo stesso tempo (24 h post-ferimento), amministrare murino PMN-MPs derivato da 2 x 106 PMNs in 100 µ l di HBSS + direttamente in ogni luogo della ferita usando un microinjection basati sulla colonscopia (uso un ago 29 G)9. Tre giorni più tardi (4 ° giorno post-ferimento) anesthetize topi (come al punto 7.1.1) e utilizza un endoscopio per riacquisire immagini di guarigione delle ferite. Lasciate che i topi recuperare come descritto al punto 7.1.2.</li>
		<li>Utilizzando software di analisi di immagine preferita (Vedi Tabella materiali), aree della struttura visibile ferita in immagini acquisite, misura l'area della stessa ferita ai giorni 1 e 4 post-ferendo e calcolare la percentuale di chiusura della ferita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cellule umane epiteliali delle cellule in vitro guarigione della ferita
	<ol>
<li>BBe Caco-2 count o T84, cellule epiteliali intestinali umane di emocitometro e seme 5x105 cellule/pozzetto in piastre a 24 pozzetti coltura. Incubare le cellule in una camera standard di incubazione a 37 ° C e 5% CO2. Caco-2 BBe o T84 raggiungere confluency all'interno di 48 h9. Di cultura di cellule epiteliali, utilizzare DMEM e DMEM-F12 (50: 50) con i supplementi come precedentemente descritto9.</li>
		<li>Generare meccanica ai graffi ferite nello strato monomolecolare del utilizzando un puntale e bassa aspirazione come precedentemente descritto4,9. Acquisire immagini della ferita aree immediatamente dopo graffiare utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertita interferenza differenziale (uso 5x o 10x obiettivi), per essere utilizzato come un tempo = punto di riferimento 0.</li>
		<li>MPs (derivato da 2-4 X 106 PMNs) in strati monomolecolari della cellula epiteliale graffiato-ferito ed incubare per altre 24 h (48 h post-ferimento, a 37 ° C con 5% CO2). In questo momento ri-acquisire immagini delle ferite-zero.</li>
		<li>Utilizzare software di analisi di immagine preferita (vedere Tabella materiali) per misurare aree ferita a t = 0 e t = 48 h. calcola la percentuale di chiusura della ferita determinando la differenza nella zona della ferita presso i punti di tempo selezionato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+immunity:+the+host-pathogen+encounter+in+blood+vessels.">Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Butin-Israeli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+microparticles+by+neutrophils+onto+inflamed+epithelium:+a+new+mechanism+to+disrupt+epithelial+intercellular+adhesions+and+promote+transepithelial+migration.">Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration.</a> FASEB J. , (2016).</li><li>Gasser, O., Schifferli, J. 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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di qualsiasi natura in relazione alla presente comunicazione

Protocolli per l'isolamento e la caratterizzazione di PMN-derivato MPs sono descritti nella presente comunicazione. Parecchi punti critici chiave deve tener conto per il successo della procedura. In primo luogo, PMNs deve essere isolato fresco e usato negli esperimenti entro 2 h di isolamento per prevenire degranulazione e attivazione spontanea. Tutte le gestione di PMNs durante l'isolamento e fino al punto di stimolazione deve essere eseguita sul ghiaccio per impedire l'attivazione e prematuro MP versione<sup class="xre...

Recentemente, "microparticelle/microvescicole" provenienti dal cytosol delle cellule o della membrana plasmatica sono diventati di grande interesse scientifico, come i dati emergenti suggeriscono che queste strutture, che vanno da 50-1.000 nm di diametro, possono trasportare informazioni biologiche e servire come un metodo non-canonica di comunicazione cellulare. Immunitario cellule derivate MPs e specialmente quelli prodotti dai neutrofili polimorfonucleari (PMNs) sono di grande interesse, dato l'importante ruolo di PMNs in host defense1,2, le risposte infiammatorie3e guarigione 4. intrigante, finora, numerose segnalazioni hanno dimostrato sia pro-infiammatorie e anti-infiammatori funzioni di PMN-MPs5, suggerendo un potenziale contesto - malattia-, specie- e ruolo di organo-specific di MPs.
Protocolli descritti nella presente comunicazione forniscono un metodo conveniente, innovativo e adattabile per studiare la funzione di MPs nella salute e nella malattia. Sono applicabili a molti organismi modello, organi e condizioni di stimolazione. Essi consentono l'identificazione di diversi tipi di MPs e può essere utilizzati in futuro per affrontare le loro funzioni pro-infiammatorie e anti-infiammatori. Ad esempio, descritto qui è come studiare la funzione di PMN-MPs in arrotolata epiteliale guarigione in vitro e in vivo. Il protocollo presentato per l'isolamento del mouse PMNs derivate da midollo osseo è stato adattato con alcune modifiche da un metodo descritto in precedenza6.
Inoltre, protocolli descritti in questo studio consentono l'individuazione e la caratterizzazione di marcatori specifici che possono essere trovati su PMN-MPs con due metodi complementari: Western blot e citometria a flusso. Troviamo che immunoblotting di MPs utilizzando protocolli standard5 è semplice e affidabile, tuttavia, i recenti progressi nella sensibilità di flusso cytometry strumenti e una migliore rapporto segnale-rumore ora consentono per ulteriori analisi di MPs utilizzando questo metodo. Incorporano i protocolli descritti in questo studio gli avanzamenti recenti e consigli da articoli di ricerca originale, incluse le modifiche alla velocità di centrifugazione e ora, l'aggiunta dell'esempio filtraggio e congelamento/conservazione condizioni7 , 8e come ridurre il "rumore di fondo", migliorare il limite di rilevamento di PMN-MPs e discriminare tra diverse dimensioni di MPs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:968px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">DMEM</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">10-041-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
			<td style="width:181px;">Atlanta Biologics</td>
			<td style="width:181px;">S11150</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td style="width:181px;">GIBCO</td>
			<td style="width:181px;">15140</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:181px;">Fisher</td>
			<td style="width:181px;">BP2482</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:257px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">S9888</td>
			<td style="width:348px;">Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Sterile filtered Histopaque 1077</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Sterile filtered Histopaque 1119</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">11191</td>
			<td style="width:348px;">Density 1.119 g/ml.&#160; Solution of polysucrose and&#160; sodium diatrizoate. Bring to room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:181px;">Cellgro</td>
			<td style="width:181px;">210-40-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
			<td style="width:181px;">Decon labs</td>
			<td style="width:181px;">2701</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">HBBS</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">T8154&#160;SIGMA</td>
			<td style="width:348px;">Diluted 1:2 for cell viability counting</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Abbot</td>
			<td style="width:181px;">50033</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Anti-human CD11b-APC conjugated</td>
			<td style="width:181px;">Biolegend</td>
			<td style="width:181px;">301350</td>
			<td style="width:348px;">Clone ICRD44 (Final concetration: 1 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">BODIPY FL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B10250</td>
			<td style="width:348px;">N-(2-aminoethyl) maleimide&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Annexin V Binding Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422201</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Calibration Beads for Flow Cytometry</td>
			<td>BioCytex</td>
			<td>7803</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">FITC Annexin V</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>640906</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Polymorphprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td></td>
			<td style="width:348px;">Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:181px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">430053</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">50 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:181px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:181px;">352070</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">25 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229225B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">10 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229210B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">5 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229205B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Pasteur pipettes&#160;</td>
			<td style="width:181px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:181px;">357575</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:181px;">305122</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">100 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229485</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Vacutainer tubes</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:181px;">367251</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)</td>
			<td>BD</td>
			<td>(SORP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75007210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>(L8-80 M)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micro-centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;VV-17703-15 (Fresco 17)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;75004503 (Megafuge 40R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Biopsy forceps, 28 cm</td>
			<td>Storz</td>
			<td>27071zj</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Image J</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>Open source&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of neutrophil-derived microparticles for functional studies

Microparticelle neutrofili polimorfonucleate (PMN)-MPs) sono il doppio strato lipidico, microvescicole sferica con dimensioni che vanno da 50 – 1.000 nm di diametro. M/s sono una nuova evoluzione, parte importante della comunicazione cellula-cellula e segnalazione macchine. A causa della loro dimensione e la natura del loro rilascio, fino a poco tempo esistenza MP è stato trascurato. Tuttavia, con la migliore tecnologia e metodi analitici sta emergendo la loro funzione nella salute e nella malattia. I protocolli qui presentati mirano a isolare e caratterizzare PMN-MPs di immunoblotting e citometria a flusso. Inoltre, diversi esempi di implementazione sono dati. Questi protocolli per l'isolamento di MP sono veloci, basso costo e non richiedono l'uso di costosi Kit. Inoltre, essi consentono l'etichettatura di MPs dopo isolamento, così come pre-etichettatura delle cellule di origine prima del rilascio di MP, utilizzando un colorante fluorescente di membrana specifici per la visualizzazione e l'analisi di citometria a flusso. Questi metodi, tuttavia, hanno diverse limitazioni tra cui purezza di PMNs e MPs e la necessità di sofisticata strumentazione analitica. Un citometro a flusso High-end è necessario analizzare MPs e minimizzare letture false positive a causa di rumore o auto-fluorescenza in modo affidabile. I protocolli descritti possono essere utilizzati per isolare e definire la biogenesi di MP e caratterizzano i loro marcatori e variazione nella composizione sotto diverse condizioni stimolanti. Eterogeneità di dimensioni può essere sfruttata per indagare se il contenuto di particelle della membrana contro esosomi è diverso, e se essi soddisfano diversi ruoli nell'omeostasi del tessuto. Infine, può essere esplorate seguente isolamento e caratterizzazione di MPs, la loro funzione in risposte cellulari e vari modelli di malattia (tra cui, PMN-collegata di disordini infiammatori, quali le malattie infiammatorie intestinali o ferita acuta del polmone).

Analisi di cytometric di flusso rappresentativi dei parlamentari che sono stati isolati dall'essere umano e del mouse PMNs sono mostrati nella Figura 1. L'eterogeneità di dimensioni di PMN-MPs può essere valutato in confronto ai branelli di dimensioni conosciute come mostrato in Figura 1A, B per umano MPs. nota, sono state osservate differenze significative nella eterogeneità di dimensioni tra mouse e MPs uman...

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Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Nuovi protocolli sono descritti qui per isolare e caratterizzare microparticelle derivate dall'essere umano e del mouse neutrofili. Questi protocolli utilizzano ultracentrifugazione, citometria a flusso e tecniche di immunoblotting per analizzare il contenuto di microparticelle, e sono utilizzabili per studiare il ruolo delle microparticelle derivate da vari tipi di cellule nella funzione cellulare.

Isolamento e caratterizzazione delle microparticelle neutrofilo per studi funzionali

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

isolation-characterization-neutrophil-derived-microparticles-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  Northwestern University. Nuovi protocolli sono descritti qui per isolare e caratterizzare microparticelle derivate dall'essere umano e del mouse neutrofili. Questi protocolli utilizzano ultracentrifugazione, citometria a flusso e tecniche di immunoblotting per analizzare il contenuto di microparticelle, e sono utilizzabili per studiare il ruolo delle microparticelle derivate da vari tipi di cellule nella funzione cellulare.

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Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Analisi del danno epiteliale Prodotto da<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infezione

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

Isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.