Wir sind dankbar für die technische Hilfeleistung des Dr. Suchitra Swaminathan, die den nordwestlichen Feinberg School der Medizin Flow Cytometry Kern läuft. Finanzierung sorgte (NIH) DK101675.

Alle tierische Arbeit wurde von der nordwestlichen IACUC genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien abgeschlossen. Für Probanden Blut zu Spenden wurde eine Einverständniserklärung vorgelegt und unterzeichnet; Darüber hinaus wurden alle Probanden in dieser Studie nach den institutionellen und Bundesrepublik Leitlinien für menschliches Wohlergehen behandelt.
Hinweis: Die Protokoll-Schritte sind unter den folgenden Abschnitten aufgeführt: (i) Maus Knochenmark Zelle isoliert; (Ii) PMN Isolation aus Maus Knochenmark; (Iii) PMN Isolation aus menschlichem Blut; (iv) MP Isolation von PMN Überstände (durch Ultrazentrifugation); (V) Charakterisierung der MPs durch Western Blot; (vi) Charakterisierung der MPs durch Durchflusszytometrie; (Viii) Anwendung der isolierten MPs auf Studie Wundheilung
1. Maus Knochenmark Zelle isoliert
<ol style="margin-left: 40px;"><li>
Dissektion des Femur und Tibia von den Hinterbeinen Maus
	<ol>
<li>Inhalation der Narkose eine Euthanasie-Box (z.B., ein Tipp-Feld leer 1 mL) vorbereiten. Fügen Sie ein paar Tropfen 100 % Isofluran auf ein steriles Tuch, mit Klebeband an der Innenseite der Deckel Kunststoff-Box. Gemäss neuen IACUC Richtlinien sollten Tiere nicht kommen in direkten Kontakt mit Isofluran, somit die Platzhalter ein Tipp zwischen Maus und die Gaze mit der Isofluran. Hinweis: Isofluran ist eine leistungsstarke inhalativer Anästhetikum und sollte mit äußerster Vorsicht in einer Dampfhaube gehandhabt werden.</li>
		<li>Einschläfern Sie Mäuse gemäß IACUC Empfehlung. Legen Sie eine Maus in der Euthanasie-Box im Schritt 1.1.1 für 1 – 5 min beschrieben, bis es nicht atmen mehr. Tod des Tieres durch Ausführen einer zervikalen Dislokation zu gewährleisten.</li>
		<li>Heben Sie die Verwendung von Edelstahl, 12 cm gebogen, Bauchhaut 0,17 mm X 0,1 mm Pinzette und schneiden Sie die Haut auf halbem Weg zwischen der oberen und unteren Extremitäten. Schälen Sie die Haut von hier aus zu den distalsten Teil der Maus Körper einschließlich der unteren Extremitäten. Mit 10 cm lang gerade Präparierscheren, entfernen Sie die Muskeln von den Hinterbeinen und verrücken Sie des Hüftgelenks Femur Kopf intakt.</li>
		<li>Mit einer Schere sezieren die Muskeln von Femur und Tibia und Femur von der Tibia zu trennen. Stellen Sie sicher, dass die Enden der Knochen intakt bleiben, da sie erhebliche Mengen an Knochenmark enthalten.</li>
		<li>Entfernen Sie alle verbleibenden Fleisch durch Walzen die Knochen in einem Papiertuch. Legen Sie die sauberen Knochen in einer Petrischale mit serumfreien Medium (SFM, d.h.Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ohne Serum oder Antibiotika).</li>
		<li>Spülen Sie die Knochen in 70 % igem Ethanol und dann in SFM.</li>
		<li>50 mL SFM in einem 50 mL konische Röhrchen vorzubereiten. In einer 10 mL Spritze laden Sie 10 mL SFM und verbinden Sie es mit einem 25 und 5/8 Zoll-Gauge-Nadel.</li>
		<li>Schneiden Sie das Ende der Knochen mit einer Schere, bis eine Öffnung an das Knochenmark (rötliche Farbe) sichtbar ist.</li>
		<li>Spülen Sie die Knochenmarkzellen in eine neue 50 mL Tube. Verwenden Sie eine 10 mL Spritze mit einer 26 und 5/8 Zoll-Gauge-Nadel mit ca. 3 mL/Knochen von SFM. Wenn fertig, Spülung, Aufschwemmen der Zellen in der Röhre durch Pipettieren (Verwendung Einweg 1 mL Kunststoff-Tipps) Zelle Aggregate zu brechen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) PMN Isolation aus Maus Knochenmark
<ol><li>
Lyse der Erythrozyten
	<ol>
<li>Pellet-gesammelten Knochenmarks durch Zentrifugieren bei 350 X g für 8 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL 0,2 % NaCl für ca. 20-30 s zur lyse des Erythrozyten-Anteil. Nicht mehr als 30 s als das PMN-Lyse führen. Geben Sie 20 mL von 1,6 % NaCl, Osmolalität wiederherzustellen. Hinweis: Dieser Schritt kann zu sehr wenig PMN Aktivierung führen.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS und Zentrifuge wie in Schritt 2.1.1 oben. Den Überstand zu entfernen.</li>
		<li>Fahren Sie mit isolierenden PMNs durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolierung der Neutrophilen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
	<ol>
<li>Warme Polysucrose und Natrium Diatrizoate Lösungen, mit dichten 1,119 g/mL und 1,077 g/mL (siehe Tabelle der Materialien), auf Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch.</li>
		<li>Bereiten Sie Polysucrose und Natrium Diatrizoate Gradienten frisch, unmittelbar vor dem Knochenmark Zelle durch langsam Schichtung 3 mL der 1,077 g/mL Dichte Lösung über 3 mL der Lösung 1,119 g/mL Dichte in 15 mL konische Röhrchen vor. Hinweis: Vorbereitung der gradient Lösung zu weit im Voraus wird in Vermischung der Schichten und schlechte Neutrophilenzahl Reinheit und Erholung führen.</li>
		<li>Das Knochenmark Zelle Pellet in 1 mL eiskaltem PBS Aufschwemmen und überlagern die resultierende Zellsuspension auf die Polysucrose und Natrium Diatrizoate gradient (langsam, um zu vermeiden, Mischen der Schichten).</li>
		<li>Zentrifuge für 30 min bei 850 X g bei 25 ° C bei RT, ohne Bremse. Halten Sie die Reagenzien bei RT für wirksame Trennung von der Neutrophilen aus anderen Zellen im Knochenmark. Festlegen der Zentrifuge bei langsam Verzögerung für den Farbverlauf effizient gebildet und nach dem Zentrifugieren Schritt gewartet werden.</li>
		<li>Suchen Sie visuell mononukleären Zellschicht an der Schnittstelle von PBS und 1,077 g/mL Dichte Lösung (obere Schicht). Entfernen Sie diese Schicht und der Rest der Dichte Lösung ohne zu stören die PMN-Band.</li>
		<li>Sammeln Sie eine ganze PMN-Ebene und einige der zugrunde liegenden Polysucrose und Natrium Diatrizoate 1,119 g/mL Lösung in 15 mL Röhrchen mit einer Transferpipette. Hinweis: Eine vollständige Entfernung der obersten Hautschicht wird die Reinheit der isolierten PMNs abhängen.</li>
		<li>Top die Rohre mit gefilterten PBS (gefiltert durch einen 0,1 µm Pore Größe Filter) und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Waschen Sie die gebeizte PMNs mit 2 mL PBS mit Zentrifugation Bedingungen wie in Schritt 2.2.7.</li>
		<li>In 1 mL der gefilterten PBS Aufschwemmen und isolierten PMNs von Hemocytometer zählen. Hinweis: Für diese Isolierung-Methode, die sich daraus ergebenden PMN Reinheit beläuft sich auf ~ 85-90 %, wie Durchflusszytometrie bewertet wurde. Die übrigen Fraktionen verunreinigen besteht hauptsächlich aus mononukleären Lymphozyten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PMN Stimulation induzieren MP Version Hinweis: PMNs können freizugebende MPs mit diversen aktivierende Bedingungen, einschließlich N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), Phorbol-12-Myristate-13-Acetat (PMA) oder Interferon-Gamma (IFNγ) angeregt werden. Wichtig ist, sollte vor der Simulation, PMNs auf Eis zu allen Zeiten gehalten werden.<ol>
<li>Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) und in 0,1 µm Aufschwemmen gefiltert Hank es ausgewogene Lösung (HBSS) Salzlösung, enthält das stimulierende Mittel der Wahl. Verwenden Sie für optimale Stimulation 100 µL Stimulation Lösung pro 10 Millionen PMNs für 20-30 min bei 37 ° C in 15 mL-Tuben. Hinweis: Die folgenden Konzentrationen von Aktivatoren wurden erfolgreich im Einsatz in unserer bisherigen Arbeit: fMLF (0,5-1 µM für Mensch und von 2-5 µM für Maus PMNs), PMA (200 nM), und IFNγ (100 ng/mL). Wenn die Freigabe der vorher markierten MPs gewünscht wird, brüten unstimulierte PMNs (1-5 x 106) mit N-(2-aminoethyl) Maleimide-FITC (siehe Tabelle der Materialien) (1 µM in 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Führen Sie Schritte 2.3.1-2.3.3.</li>
		<li>Spin-down bei 850 X g für 5 min bei 4 ° C, entfernen PMNs und zellfreie Überstände auf neue 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.</li>
		<li>Fahren Sie für MP-Isolation von zellfreien Überstände mit Schritt 4.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PMN Isolation aus menschlichem Blut
<ol><li>
Gesunde Probanden für Blut Extraktion nach institutionellen IRB Richtlinien zu rekrutieren.
	<ol>
<li>Sammeln Sie Blut aus dem Unterarm eines gesunden Freiwilligen in handelsüblichen 5 mL Natriumcitrat-haltige Rohre (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Pipette 5 mL Dextran und Natrium-Diatrizoate-Lösung (Dichte von 1,113 g/mL, siehe Tabelle of Materials) in sterilen 15 mL-Tuben und langsam Schicht 5 mL frisch isolierte periphere Menschenblut oben drauf.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Rohre für 50 min bei 400 x g bei RT (25 ° C) mit geringer Beschleunigung und keine Bremse.</li>
		<li>Am Ende der Zentrifugation entnehmen Sie Plasma und mononukleären Zellen (obere Schicht) mit einer sterilen Kunststoff Saug Pipette.</li>
		<li>Übertragen Sie die Unterschicht (PMNs) in eine neue sterile 50 mL konische Rohr.</li>
		<li>Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,45 % NaCl, PMNs (Mischung gut und sanft durch das Rohr drehen).</li>
		<li>Zentrifuge für 10 min bei 400 X g bei 25 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lyse der Erythrozyten
	<ol>
<li>Gebeizte Zellen für 45 10 mL eiskaltem, sterilen Wasser hinzufügen s gefolgt von 10 mL eiskaltes sterile 1,8 % NaCl, Osmolalität wiederherzustellen. Hinweis: Alle folgenden Schritte für PMN Isolierung sollte auf dem Eis zur Vermeidung von PMN Aktivierung und vorzeitige MP Version durchgeführt werden. Die Lyse Schritt selbst führt zu kleinen, aber nicht signifikant PMN-Aktivierung, jedoch ist es wichtig für die Isolierung von einer reinen PMN Bevölkerung für funktionelle Assays.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 min bei 250 X g bei 4 ° C mit weich abbremsen.</li>
		<li>Wiederholen Sie 3.2.1 und 3.2.2.</li>
		<li>Aufschwemmen PMNs in 5 mL eiskaltes HBSS ohne Kalzium und Magnesium. Insgesamt lebenden Zellen zu zählen (verwenden Sie einen Hemocytometer und Lebensfähigkeit Färbung bei 1:2 Verdünnung, siehe Tabelle of Materials) vor der Stimulation. Hinweis: Isolierte PMNs sollte für Stimulation oder andere Experimente innerhalb 2 h nach Isolierung verwendet werden, um funktionelle und zellulären Veränderungen und Zelltod zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MP Isolation von aktivierte PMN Überstände
Hinweis: Ein ähnliches Protokoll wird für die Isolierung von MPs von murinen und menschlichen PMNs verwendet.
<ol><li>Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) und in 0,1 µm Aufschwemmen gefiltert HBSS Lösung enthält das stimulierende Mittel der Wahl (für Beispiel 1 µM fMLF, siehe Hinweis: 2.3.1). Verwenden Sie für optimale Stimulation 100 µL Stimulation Lösung pro 10 Millionen PMNs für 20-30 min bei 37 ° C in 15 mL-Tuben.</li>
	<li>Folgenden Stimulation, spin-down aktivierten PMNs 600 X g für 5 min bei 4 ° C und zellfreie Überstände auf neue 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.</li>
	<li>Zentrifugieren des PMN geclearte Überstands bei 13.000 x g, 10 min, 4 ° C Zelle Schutt zu entfernen und den geräumten Überstand in ein neues Ultrazentrifugen Rohr übertragen.</li>
	<li>Zentrifuge für 1 h bei 100.000 x g bei 4 ° C. Überstände vor MP Speicher zu entfernen. Je nach Bedarf, pelleted Store MPs in Paraffin versiegelt Ultrazentrifugen Rohre bei-80 ° C bis zur Verwendung in Experimenten.</li>
</ol>5. Prüfung der PMN-MPs durch westliche Beflecken
<ol><li>Fügen Sie 1 % SDS Puffers (50-200 µL mit 100 mM Tris pH: 7,4), MPs pellet (aus Schritt 4.4), Transfer zum neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und lysierten MPs für 5 min kochen. Hinweis: Die Anzahl der Abgeordneten und der Lyse Puffervolumen muss angepasst und optimiert für jedes Protein des Interesses.</li>
	<li>
Laden Sie gleiche Mengen von PMN-m/s pro Lane im Ladepuffer enthalten 10 % β-Mercapto-Ethanol. Hinweis: Mit unserer Methode laden wir MPs, die aus der gleichen Anzahl von stimulierten PMNs isoliert wurden.<ol>
<li>Trennen der Lysates durch SDS-PAGE auf 10 % Polyacrylamid-Gel (verwenden Sie 50-100 V für 1-1,5 h) und total Proteinen auf Nitrocellulose-Membranen als beschriebenen9übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membranen für 1 h mit 5 % fettfreie Milch in 0,05 % Tween-20 Tris gepufferte Kochsalzlösung zu blockieren, und mit einer entsprechenden primären (über Nacht bei 4 ° C), gefolgt von HRP-konjugierten Sekundärantikörper inkubieren.</li>
	<li>Visualisieren Sie die Bänder durch die Membran und der Exposition gegenüber einem Röntgenfilm in einem lichtdichten Kassette (1-24 h) Chemoluminescence-Lösung hinzufügen.</li>
</ol>6. Prüfung von PMN-MPs durch Durchflusszytometrie
<ol><li>
Verdünnen Sie für Antikörper Färbung Antikörper entsprechend in FACS Puffer (PBS mit 0,1 mM EDTA, 0,1 % Natriumazid). Aufschwemmen pelleted PMN-MPs (abgeleitet von 1-3 x 106 PMNs/Zustand) in 100 µL Antikörper-Lösung.
	<ol>
<li>Wenn Annexin v Färbung, Aufschwemmen Sie gebeizte PMN-MPs in Annexin V-Puffer mit 5 µL FITC konjugiert Annexin V. Wenn mit Antikörpern Co Färbung, die gewünschten Antikörper (für ein Beispiel siehe Tabelle of Materials) direkt die Annexin V Projektmappe hinzufügen. Fügen Sie fluoreszierende Lipid Farbstoff, N-(2-aminoethyl) Maleimide (siehe Tabelle der Materialien), bei 1 µM-Konzentration in 100 µL der FACS-Puffer zu kennzeichnen und identifizieren von MPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MPs in Färbelösung für mindestens 20 min bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen der MPs durch Ultrazentrifugation (1 h bei 100.000 x g bei 4 ° C); verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Im FACS Puffer Aufschwemmen und laufen die Proben auf einem ausgewiesenen Durchflusszytometer, ausgestattet mit einer aktualisierten elektronischen Einheit für erhöhte Empfindlichkeit (siehe Tabelle der Materialien).</li>
</ol>7. Anträge auf isolierte PMN-MPs, PMN-Funktion bei der Wundheilung zu studieren
<ol><li>
In Vivo Verabreichung von PMN-MPs an Kolon Wunden
	<ol>
<li>Betäuben Sie Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg). Bestätigen Sie Betäubung durch Pedal Reflex (feste Zehe Prise) und passen Sie bei Bedarf.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Bauch und mit 28 cm Biopsiezangen und ein Endoskop mit einer hochauflösenden Kamera ausgestattet (z. B. ein Veterinär Endoskop für die Verwendung von kleinen Tieren, siehe Tabelle der Materialien), generieren von 3-5 oberflächliche Wunden an der dorsalen Seite des die Kolon. Nach Abschluss der Verwundung Rückkehr Mäuse zu einem Käfig platziert auf einer kontrollierter Temperatur (37 ° C) Matte bis erholt.</li>
		<li>Mäuse (wie in Schritt 7.1.1) zu betäuben. Verwenden Sie ein Endoskop Bilder zugefügten Wunden 24 h (Tag 1) Post-Verwundung zu erwerben. Mäuse wie in Schritt 7.1.2 erholen zu lassen.</li>
		<li>Zur gleichen Zeit (24 h nach Verwundung) verabreichen Sie murinen PMN-m/s 2 x 106 PMNs in 100 µL HBSS + direkt in jede Wunde mit einer Koloskopie-basierte Mikroinjektion System (Verwendung einer 29-G-Nadel)9abgeleitet. Drei Tage später (4. Tag nach Verwundung) Mäuse (wie in Schritt 7.1.1) zu betäuben und verwenden Sie ein Endoskop, um Bilder der Wundheilung zurückzukaufen. Mäuse wie in Schritt 7.1.2 erholen zu lassen.</li>
		<li>Bevorzugte Bildanalyse-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), sichtbare Wunde Gliederungsbereiche im erworbenen Bilder, Maßnahme der Bereich der gleichen Wunde an Tag 1 und 4 nach Verwundung und berechnen den Prozentsatz der Wundverschluss.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Menschliche epithelialen Zellen in Vitro Wundheilung
	<ol>
<li>Graf Caco-2 BBe oder T84, menschlichen intestinalen Epithelzellen durch Hemocytometer und Samen 5 x 105 Zellen/gut in Kultur 24-Well-Platten. Inkubieren Sie die Zellen in einer Kammer standard Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2. Caco-2 BBe oder T84 erreichen Konfluenz innerhalb 48 h9. Zu Kultur Epithelzellen, DMEM und DMEM-F12 (50: 50) mit Ergänzungen wie zuvor beschrieben,9.</li>
		<li>Mechanische kratzen Wunden in der Monolage mit einer Pipettenspitze generieren und niedrige Saugleistung wie oben beschrieben4,9. Abrufen von Bildern der Wunde Bereiche unmittelbar nach Kratzen mit einem invertierten Phasenkontrast-differential Interferenz Mikroskop (Einsatz 5 X oder 10 X Ziele), verwendet werden als eine Zeit = 0 Bezugspunkt.</li>
		<li>Zerkratzt-verwundet Epithelzelle Monolagen Abgeordneten (abgeleitet von 2-4 X 106 PMNs) hinzu, und inkubieren Sie für weitere 24 h (48 h nach Verwundung, bei 37 ° C mit 5 % CO2). Zu diesem Zeitpunkt neu erwerben Sie Bilder von Grund auf neu-Wunden.</li>
		<li>Bevorzugte Bildanalyse-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) messen Wunde Bereiche bei t = 0 und t = 48 h. berechnen den Prozentsatz der Wundverschluss durch die Bestimmung des Unterschied im Wundbereich zu ausgewählten Zeitpunkten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+immunity:+the+host-pathogen+encounter+in+blood+vessels.">Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Butin-Israeli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+microparticles+by+neutrophils+onto+inflamed+epithelium:+a+new+mechanism+to+disrupt+epithelial+intercellular+adhesions+and+promote+transepithelial+migration.">Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration.</a> FASEB J. , (2016).</li><li>Gasser, O., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+polymorphonuclear+neutrophils+disseminate+anti-inflammatory+microparticles+by+ectocytosis.">Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis.</a> Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586 (2013).</li><li>Shet, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+blood+microparticles:+technical+aspects+and+challenges.">Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges.</a> Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).</li><li>Dey-Hazra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+microparticles+by+flow+cytometry:+influence+of+centrifugation,+filtration+of+buffer,+and+freezing.">Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing.</a> Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).</li><li>Slater, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Microparticles+Deliver+Active+Myeloperoxidase+to+Injured+Mucosa+To+Inhibit+Epithelial+Wound+Healing.">Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing.</a> J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).</li><li>Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-maleimide+as+a+generic+stain+for+detection+and+quantitation+of+microparticles.">Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles.</a> Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).</li><li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis.">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Sci Transl Med. 7 (315), (2015).</li><li>Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+expression+of+fMet-Leu-Phe+receptors+on+human+neutrophils.+Correlation+to+changes+in+the+cytosolic+free+Ca2++level+and+action+of+phorbol+myristate+acetate.">Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate.</a> J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).</li></ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt jeglicher Art im Zusammenhang mit dieser Mitteilung

Protokolle für die Isolierung und Charakterisierung von PMN-abgeleitete MPs werden in dieser Mitteilung beschrieben. Mehrere wichtige kritische Punkte müssen für den Erfolg des Verfahrens berücksichtigt werden. Erstens muss PMNs frisch isoliert und in Experimenten innerhalb 2 h der Isolation verwendet, um zu verhindern, dass die spontane Aktivierung und Degranulation. Alle Behandlung der PMNs während Isolierung und bis zu dem Punkt der Stimulation muss auf Eis, Aktivierung und vorzeitige MP Version...

Vor kurzem, "Mikropartikel/Microvesicles" aus dem Zytosol der Zelle oder Plasmamembran geworden von großem wissenschaftlichen Interesse, da neue Daten deuten darauf hin, dass diese Strukturen, angefangen bei 50-1.000 nm im Durchmesser, biologische Informationen enthalten können und als eine nicht-kanonische Methode der zellulären Kommunikation dienen. Immune Zelle abgeleitet MPs und besonders die von polymorphkernigen Neutrophilen (PMNs) sind von großem Interesse angesichts der wichtigen Rolle von PMNs in Host Verteidigung1,2, Entzündungsreaktionen3und Wundheilung 4. faszinierend, so weit, haben zahlreiche Berichte Pro-inflammatorischen und Anti-inflammatory Funktionen von PMN-MPs5, was auf einen möglichen Kontext-, Krankheit - Arten- und Organ-spezifischen Rolle des m/s gezeigt.
In dieser Mitteilung beschriebenen Protokolle bieten eine kostengünstige, innovative und flexible Methode, um die Funktion des MPs in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. Sie sind auf vielen Modellorganismen, Organe und Stimulation Bedingungen anwendbar. Sie ermöglichen die Identifizierung von mehreren Arten von m/s und können in Zukunft verwendet werden, um ihre Pro-inflammatorischen und Anti-inflammatory Funktionen. Als ein Beispiel beschrieben hier ist, wie man die Funktion von PMN-MPs in epithelialen Wunde heilen in Vitro und in Vivozu untersuchen. Die vorgestellten Protokoll zur Isolierung der Maus Knochenmark stammenden PMNs wurde mit einigen Änderungen von einem zuvor beschriebenen Methode6angepasst.
Darüber hinaus Protokolle in dieser Studie beschriebenen ermöglichen die Erkennung und Charakterisierung von spezifischen Marker, die auf PMN-MPs durch zwei komplementäre Methoden finden: Western blot und flow Cytometry. Wir finden, dass Immunoblotting der MPs mit Standardprotokollen5 ist einfach und zuverlässig, jüngste Fortschritte in der Empfindlichkeit der Flow Cytometry Instrumente und verbesserte Rauschsignal-Verhältnis jetzt können jedoch zur weiteren Analyse des MPs mit dieser Methode. Die beschriebenen Protokolle in dieser Studie zu integrieren, die jüngsten Fortschritte und Empfehlungen von original Forschungsartikel, einschließlich Änderungen an Zentrifugation Geschwindigkeit und Zeit, die Zugabe von Probe Filter- und Einfrieren/Lagerung Bedingungen7 , 8, und wie man das "Hintergrundrauschen" reduzieren, verbessern die Nachweisgrenze von PMN-MPs und unterscheiden können zwischen verschiedenen Größen der MPs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:968px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">DMEM</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">10-041-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
			<td style="width:181px;">Atlanta Biologics</td>
			<td style="width:181px;">S11150</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td style="width:181px;">GIBCO</td>
			<td style="width:181px;">15140</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:181px;">Fisher</td>
			<td style="width:181px;">BP2482</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:257px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">S9888</td>
			<td style="width:348px;">Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Sterile filtered Histopaque 1077</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Sterile filtered Histopaque 1119</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">11191</td>
			<td style="width:348px;">Density 1.119 g/ml.&#160; Solution of polysucrose and&#160; sodium diatrizoate. Bring to room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:181px;">Cellgro</td>
			<td style="width:181px;">210-40-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
			<td style="width:181px;">Decon labs</td>
			<td style="width:181px;">2701</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">HBBS</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">T8154&#160;SIGMA</td>
			<td style="width:348px;">Diluted 1:2 for cell viability counting</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Abbot</td>
			<td style="width:181px;">50033</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Anti-human CD11b-APC conjugated</td>
			<td style="width:181px;">Biolegend</td>
			<td style="width:181px;">301350</td>
			<td style="width:348px;">Clone ICRD44 (Final concetration: 1 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">BODIPY FL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B10250</td>
			<td style="width:348px;">N-(2-aminoethyl) maleimide&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Annexin V Binding Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422201</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Calibration Beads for Flow Cytometry</td>
			<td>BioCytex</td>
			<td>7803</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">FITC Annexin V</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>640906</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Polymorphprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td></td>
			<td style="width:348px;">Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:181px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">430053</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">50 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:181px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:181px;">352070</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">25 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229225B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">10 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229210B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">5 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229205B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Pasteur pipettes&#160;</td>
			<td style="width:181px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:181px;">357575</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:181px;">305122</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">100 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229485</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Vacutainer tubes</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:181px;">367251</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)</td>
			<td>BD</td>
			<td>(SORP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75007210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>(L8-80 M)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micro-centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;VV-17703-15 (Fresco 17)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;75004503 (Megafuge 40R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Biopsy forceps, 28 cm</td>
			<td>Storz</td>
			<td>27071zj</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Image J</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>Open source&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of neutrophil-derived microparticles for functional studies

Polymorphkernigen Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel (PMN)-m/s) sind Lipid Bilayer, sphärische Microvesicles mit Größen von 50 – 1.000 nm im Durchmesser. M/s sind eine sich neu entwickelnden, wichtiger Bestandteil der Zell-Zell-Kommunikation und Signalisierung Maschinen. Wegen ihrer Größe und der Art ihrer Freisetzung wurde bis vor kurzem MP Existenz übersehen. Allerdings ist ihre Funktion in Gesundheit und Krankheit mit verbesserter Technik und analytischen Methoden jetzt entstehen. Die hier vorgestellten Protokolle richten sich an Isolierung und Charakterisierung von PMN-MPs durch Durchflusszytometrie und Immunoblotting. Darüber hinaus sind einige Umsetzungsbeispiele gegeben. Diese Protokolle für MP Isolierung sind schnelle, kostengünstige und nicht den Einsatz von teuren Kits erfordern. Darüber hinaus sorgen sie für die Kennzeichnung von MPs nach Isolierung, sowie Pre-Kennzeichnung der Quellzellen vor MP Version mit einem Membran-spezifische Fluoreszenzfarbstoff zur Visualisierung und Analyse von Durchflusszytometrie. Diese Methoden haben jedoch mehrere Einschränkungen einschließlich Reinheit von PMNs und m/s und die Notwendigkeit für anspruchsvolle analytische Instrumentierung. Ein High-End-Durchflusszytometer muss zuverlässig analysieren MPs und minimieren falsche positive liest wegen Lärm oder Auto-Fluoreszenz. Die beschriebenen Protokolle können verwendet werden, zu isolieren und MP Biogenese definieren und charakterisieren ihre Markierungen und Variation der Zusammensetzung unter anderen stimulierenden Bedingungen. Größe Heterogenität kann ausgenutzt werden, um zu untersuchen, ob der Inhalt der Membran Partikel versus Exosomen anders ist, und ob sie unterschiedliche Rollen im Gewebe Homöostase zu erfüllen. Zu guter Letzt können folgende Isolierung und Charakterisierung von MPs, ihre Funktion im zellulären Reaktionen und verschiedenen Krankheitsmodelle (einschließlich, PMN-assoziierten entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. entzündliche Darmerkrankungen oder akuten Lungenversagen) erkundet werden.

Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse von MPs, das wurden isoliert von Mensch und Maus PMNs sind in Abbildung 1dargestellt. Die Größe Heterogenität der PMN-MPs im Vergleich zu bekannten großen Perlen wie in Abbildung 1A, B für menschliche MPs. Note bewertet werden kann, wurden keine signifikanten Unterschiede in Größe Heterogenität zwischen Maus und Mensch MPs beobachtet. Ebenso kann mit Durchf...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies at JoVE.com

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Neue Protokolle werden hier beschrieben, zu isolieren und zu charakterisieren Mikropartikel abgeleitet von Mensch und Maus Neutrophile. Diese Protokolle nutzen Ultrazentrifugation, Durchflusszytometrie und Immunoblotting Techniken Mikropartikel Inhalte zu analysieren, und sie können zur Untersuchung der Rolle von Mikropartikeln aus verschiedenen Zelltypen in zelluläre Funktion abgeleitet.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel für funktionelle Studien

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

isolation-characterization-neutrophil-derived-microparticles-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Aufrufe.  Northwestern University. Neue Protokolle werden hier beschrieben, zu isolieren und zu charakterisieren Mikropartikel abgeleitet von Mensch und Maus Neutrophile. Diese Protokolle nutzen Ultrazentrifugation, Durchflusszytometrie und Immunoblotting Techniken Mikropartikel Inhalte zu analysieren, und sie können zur Untersuchung der Rolle von Mikropartikeln aus verschiedenen Zelltypen in zelluläre Funktion abgeleitet.

Serie: Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

Isolierung, Charakterisierung und funktionelle Untersuchung des Zahnfleisch Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.