Gli autori ringraziano il generoso sostegno della James Madison University Dipartimento di biologia e la microscopia luce James Madison University e Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele per consigli utili per quanto riguarda la preparazione di tessuti postnatale giovane, e d. ssa Justin W. Brown e Corey L. Cleland per generoso coordinamento dei materiali chirurgici e spazio. Questa ricerca è stata finanziata in parte da una sovvenzione di ricerca collaborativa da 4-VA, una partnership di collaborazione per far progredire il Commonwealth della Virginia (G.S.V.) e da un Virginia Accademia di scienza piccolo progetto Research Grant (G.S.V.). Supporto è stato generosamente fornito da una dotazione di Betty Jo amorevole Butler 58 per borsa di ricerca dello studente non laureato (a K.M.B.), una borsa di ricerca di estate di Farrell (a K.M.B.), un James Madison University secondo secolo Scholarship (a K.M.B.), un James Madison University Centennial borsa di studio (C.J.H.), una James Madison University Lucy Robinson cerca 30 Memorial Scholarship (a Z.L.H.) e a James Madison University College di Scienze e matematica facoltà assistenza Grant (a G.S.V.).

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Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Qui, presentiamo la combinazione dell'elettroporazione in utero con Cre ricombinasi nei topi floxed per generare tessuto cerebrale mosaico. Un vantaggio di questo approccio è che una nuova linea di mouse non ha bisogno di essere generata ogni volta un diverso sottotipo cellulare deve essere mirata: elettroporazione in utero può essere utilizzato per indirizzare i neuroni eccitatori, neuroni inibitori o glia a seconda del periodo e la posizione di elettroporazione15,16,17,18,19,20,21,34. Nel nostro approccio, targeting della corteccia cerebrale è coerente e riproducibile perché usiamo elettrodi di elettroporazione del diametro di 5 mm che possono essere posizionati su una vasta area del telencefalo in via di sviluppo. Per impostare come destinazione siti alternativi nel cervello (per esempio diencefalo, retina), o per un targeting più specifico delle regioni all'interno della corteccia cerebrale, le procedure e gli elettrodi progettati esplicitamente per questo scopo possono essere usato15, 16. Forniamo anche un singolo costrutto che fornisce brillante etichettatura e garantisce che ogni neurone con etichetta fluorescente contiene Cre ricombinasi. Uno svantaggio di usare un singolo costrutto per realizzare etichette brillante è che la popolazione con etichetta può essere troppo densa (Figura 2), ma questo può essere risolto mediante imaging cellule alla periferia della zona con etichetta (Figura 2D). In alternativa, espressione di un costrutto fluorescente può essere progettato a dipendere da Cre ricombinasi espressione17, ma i livelli di espressione bassa possono richiedere immunostaining per il marcatore fluorescente. Questa limitazione è affrontata con il sistema "Supernova" di Cre-dipendente marcatore fluorescente espressione (Figura 3A)23,24.
Oltre alla combinazione di ricombinazione Cre-lox con elettroporazione in utero , offriamo diversi miglioramenti per la riproduzione ottimale di femmine gravide cronometrato. È importante tenere i topi in una stanza di detenzione che è esente da rumori e vibrazioni causate da apparecchiature quali cappe a flusso laminare. Arricchire l'ambiente con igloo plastica, materiale, di incastramento e integratori alimentari come semi di girasole (Vedi elenco dei materiali). Oltre a considerazioni di carattere ambientale, abbiamo notato che la prima cucciolata di una donna in genere ha il più basso tasso di sopravvivenza. Così, il nostro protocollo suggerisce attendere la seconda gravidanza della femmina per eseguire nell'utero elettroporazione. Mentre questa strategia aumenta la sopravvivenza della cucciolata, inoltre tende ad aumentare la dimensione della lettiera, che può allungare il tempo chirurgico e abbassare così il successo della chirurgia. Pertanto, se incontrando un numero particolarmente elevato di embrioni (ad es. più di 8), vi consigliamo di ignorare l'elettroporazione su alcuni degli embrioni, soprattutto gli embrioni più vicini alle ovaie e cervice, dove il tessuto è più incline al pregiudizio. Inoltre, utilizzando la stessa strategia di arricchimento ambientale cui sopra (plastica igloo, integratori dietetici, materiale di nidificazione) tende ad aumentare la sopravvivenza delle cucciolate dopo la nascita. È anche importante notare che estro può accadere nella femmina un paio d'ore dopo il parto della prima cucciolata. In questo caso, permettere la donna a partorire sua seconda cucciolata, quindi separare dopo lo svezzamento al fine di tentare a tempo accoppiamento. Quando alla ricerca di tappi vaginali, è consigliabile separare la femmina anche se non si trova una spina, soprattutto se la femmina è in estro la sera prima. Spine in alcuni ceppi sono difficili da individuare, e concezione potrebbe essersi già verificato.
Un'altra area di miglioramento è nella produzione di pipette di microiniezione adeguata per elettroporazione nell'utero . Tirando le pipette per l'iniezione di DNA nei ventricoli laterali è un passo fondamentale. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'impostazione di pipette con una dimensione di coerente punta e bordo di estremità ruvida. Altri metodi includono rottura indietro la punta con un bisturi lama15 o pizzicamento largo della punta con forcipe16,17. Si noti che se i puntali per pipette sono troppo piccoli, essi saranno correttamente perforare la parete uterina ma portate di iniezione sarà troppo basse, allungando il tempo in cui è presentata la pipetta nel cervello embrionale. Se i puntali per pipette sono troppo grandi, potrebbero danneggiare la parete uterina e cervello embrionale. Se i puntali per pipette sono troppo lisce, causeranno una piota grande alla parete uterina e/o embrionale cranio prima di sfondare, possibilmente danneggiare l'embrione. Pratica di creazione di un'interruzione di grezza per produrre una punta di 20-25 µm e controllare punte sotto un microscopio chiaro semplice (ad esempio con un obiettivo 10x) fino ad ottenere un risultato uniforme. Test di quel liquido può essere dispensato ad un prezzo ragionevole (ad es. ~0.5 µ l/s) con un assemblaggio di tubo aspiratore è un altro metodo per garantire che il formato di punta è all'interno di un intervallo accettabile. Poiché le pipette di iniezione sono calibrate e laureate, è noto l'esatta quantità di DNA consegnato al ventricolo laterale. Questo è il punto più critico per il raggiungimento di un desiderato sparseness riproducibile a un ordine di grandezza. In altre parole, una data concentrazione dovrebbe produrre etichettatura entro un determinato intervallo, ad esempio 10 a 100 neuroni con etichettati.
Il passo più importante nel protocollo è la procedura di elettroporazione nell'utero . Essere estremamente delicata mentre esponendo l'utero. Quando si tira fuori l'ultimi embrioni dalla cavità addominale, assicurarsi di non tirare le ovaie o la cervice. Usando il pollice e l'indice durante la microiniezione ed elettroporazione consente delicato, abile manipolazione degli embrioni per rivelare il ventricolo laterale e gli embrioni essere spinto delicatamente contro la parete uterina. Un tocco estremamente delicato è fondamentale quando si maneggia l'utero e gli embrioni. Se è difficile raggiungere un tocco delicato, è possibile utilizzare pinze anello con una vite di finecorsa incorporato per impedire le pinze di bloccaggio su un embrione o utero, causando danni ai tessuti. Un'ulteriore considerazione è quello di amministrare il carprofen e la buprenorfina immediatamente prima della chirurgia, una pratica che sembra fornire efficace del dolore durante l'intervento chirurgico in utero senza colpire la sopravvivenza embrionale prezzo35 .
Seguendo la nostra procedura semplificata istologico, diversi passaggi sono fondamentali. Dopo che irrora sperimentali cervelli con fissativo, mantenere il cervello intatto nel cranio per proteggere il tessuto cerebrale da danno durante la post-fissazione. Mentre è possibile memorizzare il cervello in PFA per giorni, settimane, notare quello fluorescenza diminuirà come la soluzione PFA polimerizza l'1%. Affettare 100 µm sezioni coronali è in genere abbastanza sottile per permettere la microscopia confocale attraverso l'intera sezione pur conservando gran parte della morfologia dendritica e assonale. Se la fissazione verificato correttamente, cervelli da animali più vecchi di P13 possono essere montati sul microtomo vibra semplicemente con la colla del cianoacrilato. Tuttavia, se il cervello è troppo flessibile mentre venga tagliato dal microtomo vibra, colla giù una piccola agar o un blocco di agarosio dietro al cervello per impedire di piegatura mentre esso è essere sezionato. Se il problema non viene risolto, è possibile incorporare il cervello in agar per formare un blocco da tagliare con il microtomo vibra, come suggerito per i più giovani cervelli postnatali (punto 5.8).
Questo metodo associa il sistema di ricombinazione di Cre-lox con elettroporazione nell'utero al fine di generare mosaici che possono essere utilizzati per studiare la funzione delle cellule-autonoma dei geni nei neuroni. Questo metodo potrebbe anche essere configurato per supportare nell'utero elettroporazione del gene editing costrutti (es. CRISPR/Cas9)6o altri ricombinasi site-specific(p.es. Flp/FRT o Dre/rox24), che potrebbero essere tutti progettato per produrre il tessuto cerebrale mosaico. Una tecnica alternativa promettente che poteva essere utilizzata per produrre tessuti di mosaico è virale consegna via l'iniezione intraventricolare a topi neonatali36. Unito con l'iniezione intraventricolare alle età embrionale come dimostrato qui e altrove15,16,17,18,19,20, 21,22,37, vettori virali che codifica per la Cre ricombinasi potrebbe essere consegnato prima della nascita di infettare le cellule progenitrici floxed presso la zona ventricolare. Una considerazione critica sarebbe quello di garantire che i vettori virali sono diluiti sufficientemente per raggiungere l'asportazione sparsa e l'etichettatura. Tuttavia, questo comporterebbe anche a basso numero di copie del costrutto recapitato, includendo marcatori fluorescenti essenziale per neuroanatomical osservazioni (ad es. delle spine dendritiche o arborization)24. Per contrastare questo trabocchetto, nuovi costrutti utilizzando la stessa strategia come i costrutti di "Supernova" dimostrati qui potrebbero essere utilizzati per realizzare etichette sparse senza una corrispondente diminuzione della luminosità delle cellule con etichetta24. Un'altra considerazione critica con consegna virale è garantire che costrutti consegnati hanno promotori specifici per la popolazione delle cellule in fase di studio (ad es. eccitatorio neuroni piramidali). L'iniezione intraventricolare di vettori virali provoca infezione di tutto il tessuto che circonda i ventricoli, tra cui non solo la zona ventricolare del telencefalo dorsale dove vengono generati i neuroni eccitatori corticali e ippocampali, ma anche mediale e laterali eminenze gangliare dove molti interneuroni corticali sono nato34. Un'altra caratteristica dell'elettroporazione in utero rispetto a virale consegna dei costrutti è una finestra relativamente stretta tempo di consegna. Virus iniettato nei ventricoli laterali può persistere dopo l'intervento chirurgico, continuando ad infettare le cellule che allineano la zona ventricolare. Al contrario, elettroporazione avviene in pochi secondi, un insieme molto più specifico delle cellule di targeting. Questo può essere un vantaggio o uno svantaggio per l'investigatore, a seconda la sottopopolazione delle cellule per essere studiato.
Il nostro approccio supporta ricombinazione Cre-lox di introduzione di un singolo costrutto o costrutti "Supernova". Nel caso i costrutti di "Supernova", esortiamo gli investigatori per acquisire familiarità con i vantaggi e le limitazioni di utilizzo di questa strategia. Ad esempio, i tempi di cancellazione Cre ha dimostrato di verificarsi entro 2 giorni in neuroni eccitatori del II/III di strato della corteccia cerebrale24. Pertanto, è plausibile che l'asportazione Cre potrebbe verificarsi più dei 48 h seguendo l'elettroporazione, piuttosto che segue immediatamente l'elettroporazione. Pertanto, altre forme di corroborare la temporizzazione e la posizione dell'asportazione di Cre (ad es. usando una linea di topo reporter Cre) dovrebbero essere utilizzate per integrare l'uso di questa nuova tecnica, specialmente negli studi dove l'asportazione di Cre entro un lasso di tempo piccolo è un critico considerazione. Un altro trabocchetto potenziale è che una piccola percentuale di cellule senza etichetta in un esperimento di "Supernova" poteva esprimere la Cre ricombinasi. Ad esempio, in Figura 3, abbiamo co-individulamente due plasmidi: un'alta concentrazione di CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE e una concentrazione bassa di TRE-Cre. Poiché TRE è un promotore che perde, Cre ricombinasi potrebbero essere espresso in cellule che hanno ricevuto il plasmide di TRE-Cre ma non il plasmide loxP-fermata-loxP-EGFP-tTA, anche se questo sarebbe un avvenimento raro. In un esperimento dove è essenziale che tutte le celle senza etichetta non hanno alcuna asportazione di Cre-mediata qualunque, un esperimento di "Supernova" potrebbe essere necessario essere completati con un esperimento di controllo nel quale Cre espressione ricombinasi di fuori di etichettato neuroni è valutato con altri mezzi (ad es. Cre ricombinasi immunoistochimica).
In sintesi, il nostro protocollo è facilmente modificato per accogliere questi nuovi costrutti, rendendo nell'utero elettroporazione un metodo ancora più utile e adattabile per analisi di mosaico. Così, nell'utero elettroporazione può essere combinato con il potere di ricombinazione genetica in più modi per studiare mosaico cervello tessuto in vivo.

Generando un mosaico genetico è un classico paradigma sperimentale per comprendere la funzione di un gene di interesse. Per determinare se un gene è necessario per un fenotipo cellulare, l'approccio più semplice è causando una perdita di funzione del gene in tutto l'organismo (ad es. ad eliminazione diretta). Tuttavia, per determinare se un gene è necessaria in particolare in un determinato tipo di cellula, knockout del gene in tutto l'organismo non è un approccio valido. Al contrario, è necessario un metodo che causerà la perdita di funzione di un gene in una determinata cella mentre è circondato da tessuto wildtype (cioè geneticamente imperturbata) — in altre parole, creare mosaico tessuto. Se la cellula mutante Mostra un fenotipo mutante, ma non di cellule wildtype circostanti, le funzioni del gene in maniera autonoma delle cellule. L'analisi del tessuto del mosaico, in cui le cellule mutanti sono circondate da tessuto wildtype, è ideale per la comprensione delle cellule autonome funzioni dei geni, in particolare nel cervello dove i neuroni e cellule gliali formano una vasta rete interconnessa di tessuto.
Diverse forme di tessuto cerebrale mosaico hanno fornito modelli potenti per indagare le funzioni delle cellule-autonoma di geni. Studi incentrati su trapianto neuronale1, mosaicismo femminile legato al X2,3,4, ed endogeno mosaicism somatico5,6 hanno attirato loro conclusioni basate su mosaico tessuto cerebrale. Eliminazione condizionale di un gene attraverso il sistema di ricombinazione di Cre-lox è un metodo che sfrutta al meglio la grande disponibilità di linee di topi transgenici. In questo metodo, vengono introdotti due siti loxP su entrambi i lati di una necessaria sequenza di un gene (ad esempio di un esone), lasciandola affiancato da siti loxP che entrambi si affacciano nella stessa direzione ("floxed"). Cre ricombinasi accise la sequenza tra i siti loxP7. Ricombinazione cre-mediata può essere ottenuta da incrocio floxed topi a un'altra linea di mouse che esprimono Cre ricombinasi insieme con un marcatore fluorescente in un sottogruppo di cellule ("Cre reporter linea"). Questo è stato dimostrato in una varietà di modi per scoprire le funzioni di un gene in sottoinsiemi di cellule, quali i neuroni eccitatori o astrociti8. Linee di cre reporter possono esprimere CreERT2 per consentire la ricombinazione Cre-mediata di essere farmaco-inducibile (singoli neuroni etichettatura con knockout inducibile Cre-mediata, o SLICK)9. Un'altra strategia chiamato analisi di mosaico con doppio marker (MADM)10,11, ricombinazione di interchromosomal Cre-mediata consente un omozigote mutante deve essere creato a fianco del tessuto eterozigotico. In questi approcci, una nuova linea di topi deve essere prodotta ogni volta per ogni gene candidato o sottotipo cellulare che viene testato. In alternativa, Cre ricombinasi possono essere introdotto dopo la nascita tramite ionoforesi12 o tramite vettori virali (ad es. virus adeno-associato13 o lentivirus14 trasporto cellulari sottotipo-specifici promotori). Questa strategia crea etichettatura forte e postnatale. Per indirizzare lo sviluppo di neuroni corticali cerebrali scarsamente e prenatally, una strategia ideale è nell'utero elettroporazione di Cre ricombinasi con un marcatore fluorescente.
Oltre alla ricombinazione di Cre-lox attraverso elettroporazione nell'utero per produrre la combinazione del mosaico del tessuto in vivo, vi presentiamo diversi adattamenti alle procedure da altri protocolli pubblicati15,16, 17,18,19,20,21. Forniamo informazioni per migliorare il successo nel tempo-incinta femmine riproduttrici. Descriviamo anche i nostri due strategie per introdurre l'etichettatura dei neuroni nel tessuto corticale sparse e brillante: una strategia consiste nel titolo i livelli di un singolo costrutto che codifica per la Cre ricombinasi e un marcatore fluorescente22. Un'altra strategia consiste nell'utilizzare il sistema di "Supernova", progettato specificamente per questi parametri in mente23,24. Inoltre, offriamo miglioramenti sulla produzione coerente microiniezione pipette e semplificazioni per la chirurgia di elettroporazione nell'utero . Infine, abbiamo delineare fasi critiche in una preparazione istologica semplificata che consente l'analisi delle spine dendritiche e pergole dentritici ed axonal, senza ulteriore colorazione o immunohistochemistry.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>See &#34;1. Mouse set-up&#34; (step 1.1, &#34;wildtype mice&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP.Cre empty vector</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#20781</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker&#34;). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#69138</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;Supernova&#34; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#69136</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;Supernova&#34; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#85006</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;Supernova&#34; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#12362</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.3 &#34;endotoxin-free plasmid purification kit&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue powder, BioReagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6146-5G</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;trypan blue&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286-2.5KG</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;NaCl&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, ACS, 500 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#97061-566</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;KCl&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876-100G</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;Na2HPO4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100G</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;KH2PO4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;HCl&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.1 &#34;glass capillary puller&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.0 mm wide trough filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FT330B</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.1 &#34;glass capillary puller&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries, 4&#34;, 1 / 0.75 OD/ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.1.1 &#34;glass capillary&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5&#34;</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>LW-8148</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.2.1 &#34;single-ply task wipe&#34;); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#14140</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;Graefe forceps&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#503708-12</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;iris scissors&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#503728-12</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;Hartman mosquito forceps&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Non-Woven Sponges, 2&#34; x 2&#34;, 4-ply</td>
			<td>Medrepexpress</td>
			<td>#2204-c</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;non-woven gauze sponges&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#503203</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;ring-tipped forceps&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes complete, O.D. &#215; H 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3160102-12EA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;Petri dishes&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8&#34; x 9-3/4&#34; x 5/8&#34;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B007SHGAHA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;stainless steel tray&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 5 mm</td>
			<td>BTX</td>
			<td>#45-0489</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.3 and 4.16 &#34;tweezer-type electrodes&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Foot Pedal</td>
			<td>BTX</td>
			<td>#45-0211</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.3 and 4.17 &#34;foot pedal&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Generator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>#45-0052</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.3 &#34;generator&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>#72-6468</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.4 and 4.6 &#34;nose cone&#34;, step 4.4 &#34;induction chamber&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td>
			<td>#0536108691</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.7 &#34;veterinary ophthalmic ointment&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Space Gel (AIMS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#95059-640</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.8 &#34;sealed pouch filled with supersaturated salt solution&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula</td>
			<td>Veet</td>
			<td>#062200809951</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.9 &#34;depilatory cream&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk)</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>TSP-10LKIT</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.12 &#34;sterile 10 &#181;L micropipette tip&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.15 &#34;aspirator tube assembly&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27&#34;</td>
			<td>Medrepexpress</td>
			<td>MV-J397</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.19 &#34;absorbable sutures&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;LiquiVet Rapid&#8221; Tissue Adhesive</td>
			<td>Medrepexpress</td>
			<td>VG3</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.20 &#34;tissue adhesive&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z551546-100EA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.21 &#34;1 mL syringe&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192392-100EA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.21 &#34;26G, &#189;&#8221; needle&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestlets Nesting Material</td>
			<td>Ancare</td>
			<td>NES3600</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.24 &#34;nesting materials&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile</td>
			<td>Bio-Serv</td>
			<td>S5137</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.24 &#34;sunflower seeds&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.1.1 &#34;PFA&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#501976</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.5 &#34;tweezers&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#10752</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.8.1 &#34;agar&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edge razor blades, #9 blade</td>
			<td>Stanley Tools</td>
			<td>#11-515</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.9 &#34;single-edge razor blade&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc S D 50 mm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#14046327404</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.9 &#34;vibrating microtome specimen disc&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer tray S assembly</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#1404630132</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;buffer tray&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1000 S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#14047235612</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;vibrating microtome&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Razor Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;blade&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife Holder S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#14046230131</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;knife holder&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0089KU6XE</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.1 &#34;fine tipped paintbrush&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>#71869-11</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.1 &#34;microscope slide&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.3-5.12.4 &#34;mountant&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS1415-10</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.4 &#34;coverslip&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.13.1 &#34;DAPI&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Stage Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;light microscope&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000/C2si</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;confocal microscope&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective, NA = 0.20</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;low-power objective&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective, NA = 0.75</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;medium-power objective&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x objective, NA = 1.40</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;high-power objective&#34;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing cre-lox recombination in mouse cerebral cortex through in utero electroporation

Cella-autonome funzioni neuronali dei geni possono essere rivelate causando perdita o guadagno di funzione di un gene in una popolazione di piccola e sparsa di neuroni. Per effettuare questa operazione richiede la generazione di un mosaico in cui i neuroni con perdita o guadagno di funzione di un gene sono circondati da tessuto geneticamente imperturbato. Qui, uniamo il sistema di ricombinazione di Cre-lox con elettroporazione nell'utero al fine di generare tessuto cerebrale mosaico che può essere utilizzato per studiare la funzione delle cellule-autonoma dei geni nei neuroni. Costrutti del DNA (disponibili nei repository), che codifica per un'etichetta fluorescente e la Cre ricombinasi, vengono introdotti nello sviluppo di neuroni corticali contenenti geni affiancati con siti loxP nei cervelli degli embrioni del mouse utilizzando in utero elettroporazione. Inoltre, descriviamo vari adattamenti per il metodo di elettroporazione nell'utero che aumentano la sopravvivenza e la riproducibilità. Questo metodo coinvolge anche stabilire un titolo per ricombinazione Cre-mediata in una rada o densa popolazione di neuroni. Preparati istologici del tessuto cerebrale con etichetta non richiedono (ma può essere adattati a) immunohistochemistry. I costrutti utilizzati garantiscono che fluorescente etichettati neuroni trasportare il gene per la ricombinasi Cre. Preparati istologici consentono analisi morfologica dei neuroni confocale imaging delle pergole dentritici ed axonal e spine dendritiche. Perché perdita o guadagno di funzione è realizzato in tessuto di tipo sparse mosaico, questo metodo consente lo studio delle necessità delle cellule autonome e la sufficienza della gene prodotti in vivo.

Il singolo costrutto GFP. CRE (vedere elenco dei materiali) era individulamente presso E15.5 e visualizzati a P14. A seconda della concentrazione del costrutto e il volume di iniezione, un risultato rado o denso può essere ottenuto22,26. Ad esempio, l'iniezione di 1 µ l di 2 mg/mL GFP. Cre risultati in una distribuzione sparsa delle cellule con etichettate, alcuni dei quali possono essere luminoso (Figura 1A) e localizzata a livello II/III (Figura 1B). Perché il tessuto è 100 µm di spessore, la maggior parte delle pergole dendritiche sono conservata (Figura 1). Le spine dendritiche possono essere osservate ad alti ingrandimenti (60 X; Figura 1). Iniezione di 1,5 µ l alla stessa concentrazione si traduce in molto denso etichettatura (Figura 2A) nel livello II/III (Figura 2B), che può essere sub-ottimale, come è difficile rintracciare l'origine dei neuriti e delle spine dendritiche (Figura 2). Tuttavia, è ancora possibile all'immagine di un neurone (Figura 2D) e dei suoi processi (Figura 2E) selezionando una cella luminosa nella periferia della zona con etichetta (Figura 2D).
Infine, è possibile massimizzare la luminosità dei neuroni pur mantenendo una distribuzione sparsa delle cellule con etichettate. Qui, Supernova-GFP (vedere elenco dei materiali) era individulamente presso E15.5 e visualizzato al P23. Si noti che, sulla base delle osservazioni del tessuto di cervello preso alle varie età postnatale, non sembra essere un effetto dell'età sulla luminosità di qualsiasi costrutti fluorescente utilizzato qui23,24,26. Iniezione di 1 µ l di una miscela contenente 1 mg/mL Sn-GFP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) e 10 µ g/mL TRE-Cre risultati in una distribuzione sparsa delle cellule per lo più brillanti (Figura 3A) nel livello II/III (Figura 3B). È possibile visualizzare processi dentritici ed axonal (Figura 3B) e spine dendritiche (Figura 3). Nella nostra esperienza, il targeting sia con un singolo costrutto come GFP. Cre o con "Supernova" costrutti riproducibile resa di espressione in almeno il 75% degli embrioni individulamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig1.jpg"> Figura 1: Sparse e brillante espressione dopo nell'utero elettroporazione con un singolo costruire contenenti GFP e Cre ricombinasi. (A) micrografo di fluorescenza di basso ingrandimento (4x) della corteccia cerebrale alle P23, dopo elettroporazione presso E15.5. (B) medio-ingrandimento (X 20) fluorescenza micrografo di macchia nucleare DAPI, rivelando laminazione corticale (livelli I, II/III, IV e strati profondi a IV). (C) micrografo di fluorescenza di ingrandimenti medio (X 20) di un singolo neurone. (D) micrografo di fluorescenza ad alto ingrandimento (60 X) delle spine dendritiche. Scala bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C); e 5 µm (D). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56675/56675fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig2.jpg"> Figura 2: Denso e brillante espressione dopo nell'utero elettroporazione con un singolo costruire contenenti GFP e Cre ricombinasi. (A) micrografo di fluorescenza di basso ingrandimento (4x) della corteccia cerebrale a P14, dopo elettroporazione presso E15.5. (B) medio-ingrandimento (X 20) fluorescenza micrografo di macchia nucleare DAPI, rivelando laminazione corticale (livelli I, II/III, IV e strati profondi a IV). (C) micrografo di fluorescenza di ingrandimenti medio (X 20) dei neuroni nella zona di etichettatura più densa. (D) micrografo di fluorescenza di ingrandimenti medio (X 20) dei neuroni preso alla periferia della zona di etichettatura più densa. (E) micrografo di fluorescenza ad alto ingrandimento (60 X) delle spine dendritiche. Scala bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C, D); e 5 µm (E). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56675/56675fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig3.jpg"> Figura 3: Sparse e brillante espressione dopo nell'utero elettroporazione con Supernova-GFP costrutti contenenti GFP e Cre ricombinasi. (A) micrografo di fluorescenza di basso ingrandimento (4x) della corteccia cerebrale a P14, dopo elettroporazione presso E15.5. (B) medio-ingrandimento (X 20) fluorescenza micrografo di macchia nucleare DAPI, rivelando laminazione corticale (livelli I, II/III, IV e strati profondi a IV). (C) micrografo di fluorescenza di ingrandimenti medio (X 20) di un singolo neurone. (D) micrografo di fluorescenza ad alto ingrandimento (60 X) delle spine dendritiche. Scala bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C); e 5 µm (D). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56675/56675fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.

Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

inducing-cre-lox-recombination-mouse-cerebral-cortex-through-utero

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

11.6K Views.  James Madison University. Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Generazione di topi transgenici per uso topico<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione e<em&gt; In vivo</em&gt; Screening bioluminescenza

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...