Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Kathleen Mathers, il dottor Jean-Philippe Mocho e il dottor Yolanda Saavedra Torres per il loro aiuto ad esibirsi in elettroporazione utero nell&#39;ambito delle procedure asettiche, e Wood Hayley per il suo aiuto per preparare i disegni. EP è stato sostenuto da un lungo periodo Federazione delle società biochimiche europee (FEBS) e una borsa di studio del Medical Research Council (MRC) borsa di studio lo sviluppo della carriera, MAH da un Wellcome Trust sovvenzione Elizabeth Fisher e Victor Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW da un lungo periodo EMBO fellowship e RA da una borsa di studio MRC. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del progetto del Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) e da un Grant-in-Aid dal Medical Research Council (U117570528) a FG

Nel Regno Unito, i topi sono alloggiati, allevati e trattati secondo le linee guida approvate dal Ministero degli Interni sotto la Animal (Scientific Procedures) Act 1986. 1. Preparazione: Soluzione DNA e Needles <ol><li> Purificare il DNA con un plasmide libero Endotoxin Maxi-prep kit. Preparare la soluzione plasmide DNA iniettabile a concentrazioni desiderate in acqua e aggiungere Fast Green (concentrazione finale di 0,05%) per visualizzare iniezioni. L&#39;efficienza di elettroporazione è altamente dipendente dalla concentrazione di DNA. Una concentrazione di 1 pg / pl viene generalmente utilizzato. Questa concentrazione è sufficiente per visualizzare i neuroni elettroporate senza compromettere il loro sviluppo. Tuttavia, secondo il promotore utilizzato nel vettore plasmidico (basso livello di espressione con promotore di citomegalovirus / enhancer, con forte livello di espressione del citomegalovirus enhancer precoce immediato e β-actina di pollo fusione promotore (CAG) promotore), nonché le dimensioni e la<html> stabilità della proteina espressa, questa concentrazione può essere regolato (0,25 pg / pl a 5 pg / pl). </li><li> Tirare aghi di vetro con un estrattore micropipetta. </li></ol> 2. Preparazione della Chirurgia <ol><li> Autoclavare strumenti chirurgici e saline tampone fosfato (PBS). </li><li> Preparare la soluzione analgesico in PBS (buprenorfina, Vetergesic, concentrazione finale di 30 ug / ml). Pesare il mouse incinta iniettare per via sottocutanea e 0,1 mg / kg di Vetergesic almeno 30 minuti prima della chirurgia. Durante questo tempo, preparare la zona chirurgica. Accendere i rilievi di riscaldamento e la camera di recupero. Mettere PBS sterile in bagno di acqua calda e tutti gli strumenti sterili e materiali su teli sterili. Posizionare gli elettrodi di platino in un bicchiere pieno di PBS e connettersi al elettroporatore. Riempire l&#39;ago con la soluzione di DNA con una punta microloader, collegare l&#39;ago al titolare capillare e pizzicare la punta dell&#39;ago con una pinza. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Chirurgia Prima dell&#39;iniezione del DNA ed elettroporazione <ol><li> Anestetizzare un topo in stato di gravidanza (E14.5, E15.5) con isoflurano in carrier di ossigeno (ossigeno 2 l / min) utilizzando una camera di anestetico di induzione. Attendere che l&#39;animale perde il riflesso di raddrizzamento. </li><li> Trasferire l&#39;animale a una maschera di &quot;pre-chirurgia&quot;. Mettere una goccia di gel occhio su ciascun occhio per evitare ulcerazioni della cornea degli occhi, mentre la madre è in anestesia generale. Utilizzare un rasoio elettrico a radersi i capelli dell&#39;addome. Pulire la zona rasata una volta con clorhexidine per raccogliere i capelli volo. </li><li> Trasferire l&#39;animale a una seconda maschera nella zona di intervento. Posizionate il mouse con la schiena sul cuscino. Avviare la chirurgia quando il riflesso pedale è andato perduto. </li><li> Indossare maschera e guanti sterili. Coprire l&#39;animale con un telino sterile (con un piccolo foro sopra l&#39;addome) per evitare che i tessuti e gli strumenti vengano contaminate dalle aree di pelle che non sono stati rasati e disinfettati. Pulire la zona rasata unot almeno 3 volte con clorhexidine. Usare un tampone di cotone sterile diverso ogni volta. Utilizzare un bisturi per fare una incisione verticale lungo la linea mediana (~ 1 pollice lungo) attraverso la pelle. Usando le forbici, praticare un&#39;incisione simile del muscolo dell&#39;addome lungo la linea alba (linea bianca composta principalmente di collagene del tessuto connettivo). </li><li> Scegliere gli embrioni più accessibili e posizionare la pinza ad anelli tra due embrioni e tirare la catena embrionale dalla cavità addominale. Da questo punto in poi, tenere gli embrioni idratata con sterile preriscaldata PBS. </li></ol> N microscopio è richiesto per la visualizzazione. 4. L&#39;iniezione di DNA e di elettroporazione <ol><li> Inizia con uno dei laterali più embrioni, rendendo più facile tenere traccia di quali sono state elettroporate embrioni. Non tirare troppo sugli embrioni in quanto ciò aumenta il rischio di emorragia. Manipolare la posizione dell&#39;embrione all&#39;interno del sacco amniotico utilizzando i pinza ad anelli estabilizzare la testa degli embrioni tra gli anelli. Premere delicatamente per spingere verso l&#39;alto l&#39;embrione più vicino alla parete uterina. </li><li> Con l&#39;altra mano, prendere il titolare capillare e inserire l&#39;ago attentamente in mezzo dell&#39;emisfero per indirizzare il ventricolo laterale. Premere il pedale per iniettare circa 1 pl di soluzione di DNA miscelato con Fast Green (meno di 1 pl per studiare dendriti). Si dovrebbe osservare il colorante verde di riempimento del ventricolo laterale. Passaggi critici: - la nitidezza l&#39;ago è fondamentale per forare correttamente la parete uterina. È importante ridurre al minimo il movimento dell&#39;ago alla superficie della parete uterina e dopo l&#39;inserimento nel ventricolo causa un allargamento del foro porterà alla fuoriuscita di liquido amniotico e morte embrionale. Evitare di vasi sanguigni penetranti nella parete uterina, come questo si tradurrà in emorragia e la morte dell&#39;embrione. - È importante non iniettare un volume troppo grande di DNA nel ventricolo laterale perché indurràidrocefalo (non superino il 2 ul a E14.5). Il volume di DNA viene regolato secondo lo scopo dell&#39;esperimento. Se 1ml è generalmente utilizzato per la maggior parte degli esperimenti, un volume minore di DNA (circa 0,5 pl) è richiesto per dendrite e l&#39;analisi della colonna vertebrale. Infatti poche cellule isolate devono essere mirate al fine di visualizzare e misurare il pergolato dendritica dei neuroni elettroporate. </li><li> Posizionare gli elettrodi sui lati della testa dell&#39;embrione con il polo positivo (+) paddle sullo stesso lato come il ventricolo iniettato per elettroporazione corteccia o sul lato opposto del ventricolo iniettato per elettroporazione dell&#39;ippocampo (Figura 2). Quindi applicare cinque impulsi elettrici 30V (50 msec durata) ad intervalli di 1 sec. Passaggio critico: Evitare l&#39;applicazione di corrente attraverso la placenta in quanto ciò può provocare la morte dell&#39;embrione. Tutti gli embrioni di un topo in stato di gravidanza può essere elettroporate, di solito con lo stesso DNA costrutto per evitare qualsiasi confusione. Tuttavia, una diminuzione lungo intervento chirurgico<html> è il tasso di sopravvivenza degli embrioni. La cavità addominale non deve essere aperta più di 30 min. </li></ol> 5. Chirurgia Post-elettroporazione <ol><li> Dopo electroporating gli embrioni, aggiungere PBS nella cavità addominale e utilizzare le pinza ad anelli per sostituire il corno uterino nella sua posizione originale. Suturare la parete addominale e pelle con Vicryl suture riassorbibili. </li><li> Mettete l&#39;animale in una camera di recupero fino a quando non si sveglia (min di solito 5-10) e poi trasferirli in una gabbia posta su un rilievo del heating. </li></ol> 6. Post-operatorio Controllare il comportamento dei topi per valutare il dolore, sofferenza o angoscia e pesare gli animali 24 h e 48 h dopo l&#39;intervento chirurgico. Se necessario, analgesici può essere somministrata per minimizzare il dolore e disagio. 7. Tissue Processing Raccogliere gli embrioni elettroporate o cuccioli nelle fasi embrionali o post-natale necessari per l&#39;esperimento. ove_content &quot;&gt; - Per l&#39;analisi in fasi embrionali (per esempio per studiare la proliferazione cellulare o la migrazione): Euthanize madre via dislocazione cervicale e raccogliere gli embrioni. Dopo decapitazione, selezionare i cervelli che sono state elettroporate correttamente, come indicato dalla quantità e la posizione del segnale fluorescente, visualizzato attraverso il cranio con un binoculare fluorescente. Sezionare il cervello fuori dal cranio e fissare una notte in 4% PFA e poi posto in 20% di saccarosio / PBS durante la notte. Incorpora in compound ottobre, il congelamento a -80 ° C e la sezione con un criostato. - Per l&#39;analisi in una fase post-natale (per esempio per studiare dendriti e spine): Anestetizzare cuccioli o topi adulti con iniezione intraperitoneale di pentobarbitone (40-60 mg / kg) ed eseguire perfusione transcardial con PBS, seguito da 4% in PBS PFA. Sezionare il cervello fuori dal cranio e post-fix in 4% PFA durante la notte. Dopo lavaggi in PBS, la sezione cervello utilizzando un vibratomo (100 sezioni micron per dendrite analisi). Montare le sezioni in Poly Aqua / mount utilizzando coprioggetto 0.16-0.19 mm di spessore per dendriti delle immagini e spine. 8. Rappresentativi risultati La figura 3 mostra esempi di cellule elettroporate nella corteccia cerebrale (Figure 3A, B), nella CA1 (figure 3C, D) e nel giro dentato dell&#39;ippocampo (figure 3e, F). Topi wild-type sono state elettroporate a E14.5 con un costrutto GFP (PCA-b-EGFPm5 silenziatore 3) e il cervello sono state raccolte al giorno postnatale (P) 14. Iniettando un piccolo volume di soluzione di DNA (0,5 pl o meno di una soluzione a 1 pg / pl), alcune celle sono etichettati, che permette la visualizzazione del arborizzazione dendritica di isolate GFP + cellule (figura 3) così come le loro spine con un ingrandimento maggiore (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;strong&gt; Figura 1. Rappresentazione schematica di elettroporazione protocolli che possono essere utilizzati per studiare dendriti e spine. (A) elettroporazione di un costrutto GFP per confrontare i dendriti e spine nei topi wild-type e mutanti. (B) Elettroporazione di GFP-shRNA (GFP è espressa dal costrutto stesso) per confrontare dendriti e spine in topi elettroporata con un costrutto shRNA specifico per un gene di interesse (X) o un shRNA controllo. (C) IUE possono essere utilizzati insieme con un sistema inducibile Cre per limitare l&#39;espressione del shRNA al periodo di tempo auspicabile. In questo esperimento, un vettore che esprime una forma di ricombinasi Cre che può essere attivato da 4-hydroxytamoxifen (CAG-ER T2 CREER T2; 1 pg / pl) 10, viene elettroporata con un vettore che esprime una shRNA specifica in un Cre dipendente modo (1 pg / pl, e con un indicatore di ricombinazione (CALNL-GFP costrutto, espressione inducibile GFP da Cre;. 1 pg / pl) 10 Il efficienzecy del knockdown può essere migliorata aumentando la concentrazione del shRNA così come l&#39;aumento CAG ER-T2 CREER concentrazione T2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> Figura 2. Controllo spaziale di elettroporazione. Questa figura mostra dove posizionare gli elettrodi paletta secondo la sito di iniezione del DNA per indirizzare la corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> Figura 3. Visualizzazione del pergolato dendritiche in utero elettroporate di cellule nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo. (A, B) sezioni coronali che mostrano GFP + cellule piramidali della corteccia cerebrale, (CD) cellule piramidali di CA1 dell&#39;ippocampo e (E, F), cellule granulari del giro dentato a P14. Un costrutto GFP (PCA-b-EGFPm5 silenziatore 3) è stato elettroporate a E14.5. Immagini maggiore ingrandimento (B, D, F) mostrano che IUE è un metodo efficace per visualizzare dendriti. Barre di scala rappresentano 50 micron (B, D e F), 150 micron (A, C, E). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> Figura 4. Visualizzazione di spine dendritiche in P14 neuroni che sono stati elettroporate in utero ad E14.5 con un costrutto che esprime GFP. (A, B) le immagini ad alto ingrandimento di spine da dendriti basali dei neuroni piramidali dell&#39;ippocampo. Barre di scala rappresentano 5 micron (A) e 2 micron (B).

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Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. 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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

IUE è un potente strumento per manipolare l&#39;espressione genica non solo nello spazio ma anche nel tempo. Mostriamo qui che questa tecnica può essere usata per visualizzare e manipolare geneticamente dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo dei topi. Oltre ai vantaggi precedentemente citati, è opportuno notare che IUE, a differenza di Golgi metodo, può essere combinato con immunoistochimica o ibridazione in situ, che permette ad esempio di fenotipo delle cellule elettroporate. E &#39;inoltre importante ricordare che questa procedura non induce malformazioni cerebrali evidenti nonostante la sua relativa invasività. Inoltre, a livello cellulare, IUE non modificare le proprietà elettrofisiologiche del elettroporata neuroni 13. Mentre la nostra manifestazione si concentra sulla visualizzazione delle morfologie dendritiche e della colonna vertebrale, IUE dei neuroni corticali e dell&#39;ippocampo a E14.5 potrebbe anche essere utilizzato per studiare altri eventi di sviluppo come la formazione degli assoni e di orientamento. In aggiuntaition, lo stesso tipo di protocollo, possono essere attuate in altre fasi dello sviluppo embrionale per indirizzare le diverse popolazioni. Ad esempio, un paradigma elettroporazione evolutivamente molto tardi corticale E18.5 può essere eseguita per guidare l&#39;espressione in progenitori astrocitari 1. Analogamente, mentre un elettroporazione dell&#39;ippocampo a E14.5 consente di indirizzare CA1-CA3 progenitori dei neuroni piramidali e cellule progenitrici dentato granuli al tempo stesso, uno elettroporazione ritardo ippocampo (E18.5 o precoce postnatale) consentirebbe di indirizzare differenti granulo dentata progenitori 14. In questo caso, il volume iniettato di DNA può essere aumentata come pure l&#39;intensità della corrente. Transgeni introdotti da IUE sembrano rimanere episomiale e sono quindi persi dalle cellule seguenti divisioni cellulari successive. In cellule postmitotico quali neuroni, tuttavia, i transgeni episomale rimangono attive per mesi dopo l&#39;elettroporazione consentendo studi a lungo termine 13, 15. Nel nostro studio, abbiamo osservato luminoso GFP + cellule fino a 7 settimane dopo la nascita (il punto di ultima ora abbiamo analizzato) che indicano che embrionale di mira dei precursori neuronali corticali e dell&#39;ippocampo che utilizzano i risultati IUE in persistente espressione del transgene dai primi momenti dello sviluppo fino fino all&#39;età adulta. Una limitazione di corrente della tecnica è che è difficile esercitare un controllo preciso del numero totale di cellule elettroporate. Tuttavia, diminuendo il volume iniettato di soluzione di DNA, abbiamo dimostrato che è possibile marcare poche cellule e per visualizzare la arborizzazione dendritica di GFP + cellule isolate, nonché le loro spine. La dimensione della zona trasfettata potrebbe anche essere regolato modificando i parametri di elettroporazione, come intensità di corrente e il numero di impulsi o il diametro delle pale elettroporazione. Complessivamente IUE è un metodo che è facile da implementare, rapida eefficace per studiare dendriti e spine in vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Preparazione di aghi e soluzione di DNA per iniezione </td></tr><tr><td> Endofree kit Maxi plasmide </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari 1,0 millimetri OD x 0,58 mm ID </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader suggerimenti </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> Per Eppendorf pipette 0,5 pl-10 pl / 2-20 pl </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> Materiale per chirurgia </td></tr><tr><td> Extra forbici Iris sottili </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> Anello pinza </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> Porta aghi </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> Graefe Pinza </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Vicryl sutura assorbibile </td><td> Ethicon Inc (Johnson &amp; Johnson) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> Teleria sterile 30cm x 45 cm </td><td> Buster </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> Tamponi sterili </td><td> Shermond </td><td> Huby-340 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Cotton fioc </td><td> Clean Croce Co., Ltd </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina (Vetergesic) </td><td> Alstoe Animal Health </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> Eye Gel Viscotears </td><td> Novartis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Abbott Laboratories </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, Sodio Pentobarbitone 20% </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Elettroporazione </td></tr><tr><td> Elettroporatore </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Tweezertrode 5 millimetri </td><td> BTX, Harvard Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet microiniettore </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> Pedale di controllo per FemtoJet microiniettore </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> Porta capillare </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tissue di elaborazione </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> ThermoScientific (Menzel-Glaser) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Coprivetrini </td><td> Menzel-Glaser </td><td></td><td> 22 x 50 mm # 1,5 </td></tr><tr><td> Aqua Poly / mount </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

In elettroporazione utero (IUE) è diventata una tecnica potente per studiare lo sviluppo delle varie regioni del sistema nervoso embrionale 1-5. Ad oggi questo strumento è stato ampiamente utilizzato per studiare la regolazione della proliferazione cellulare, la differenziazione neuronale e migrazione specialmente nei paesi corteccia cerebrale 6-8. Qui di seguito troverai il nostro protocollo di elettroporare in utero della corteccia cerebrale e l&#39;ippocampo e fornire la prova che questo approccio può essere utilizzato per studiare dendriti e spine in queste due regioni cerebrali. Visualizzazione e manipolazione di neuroni in colture primarie hanno contribuito ad una migliore comprensione dei processi coinvolti nella dendrite, colonna vertebrale e lo sviluppo delle sinapsi. Tuttavia neuroni in crescita in vitro non sono esposti a tutti i segnali fisiologici che possono influire dendrite e / o di formazione delle spine e manutenzione durante il normale sviluppo. La nostra conoscenza delle strutture dendritiche e della colonna vertebrale <em&gt; in vivo nei topi wild-type o mutanti provengono in massima parte dalle osservazioni utilizzando il metodo di Golgi-Cox 9. Tuttavia, colorazione Golgi è considerato essere imprevedibile. Infatti, gruppi di cellule nervose e tratti di fibre sono etichettati in modo casuale, con aree particolari spesso apparire completamente tinto mentre le aree adiacenti sono privi di colorazione. Recenti studi hanno dimostrato che IUE di costrutti fluorescenti rappresenta un attraente metodo alternativo per studiare dendriti, spine e sinapsi in topi mutanti / wild-type 10-11 (Figura 1A). Inoltre rispetto alla generazione di knockouts topo, IUE rappresenta un approccio rapido per eseguire aumento e calo di studi in funzione specifica popolazione di cellule durante una finestra di tempo specifico. Inoltre, IUE è stato usato con successo con l&#39;espressione genica inducibile o inducibile RNAi avvicina definire il controllo temporale sopra l&#39;espressione di un gene o shRNA 12. Questi vantaggi di IUE hanno così opened nuove dimensioni per studiare l&#39;effetto dell&#39;espressione genica / soppressione sui dendriti e spine, non solo in particolari strutture cerebrali (Figura 1B), ma anche in un punto temporale specifico di sviluppo (figura 1C). Infine, IUE fornisce uno strumento utile per identificare interazioni funzionali tra i geni coinvolti nella dendrite, colonna vertebrale e / o sviluppo delle sinapsi. Infatti, contrariamente ad altri metodi di trasferimento genico, quali virus, è semplice per combinare più RNAi o transgeni in stessa popolazione di cellule. In sintesi, IUE è un metodo potente che ha già contribuito alla caratterizzazione dei meccanismi molecolari alla base della funzione del cervello e della malattia e dovrebbe anche essere utile nello studio dei dendriti e spine.

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Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per elettroporare in utero della corteccia cerebrale e l&#39;ippocampo a E14.5 nei topi. Abbiamo anche dimostrato che questo è un metodo valido per studiare dendriti e spine in queste due regioni cerebrali.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.9K Views.  MRC National Institute for Medical Research. Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per elettroporare in utero della corteccia cerebrale e l'ippocampo a E14.5 nei topi. Abbiamo anche dimostrato che questo è un metodo valido per studiare dendriti e spine in queste due regioni cerebrali.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

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Neuroscienze

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...