KG è stato sostenuto dalla concessione P-1760 RA Welch Foundation, TCU Andrews Istituto di Matematica e Scienze della formazione (per KG), TCU ricerca e creatività Activity Grant (al KG) e TCU SERC Grant (a JHS).

1. Sintesi di biotina-Fc-cisteina (1) <ol><li> Metodi in fase solida per la produzione di resina-legato 1. <ol><li> Inserire biotina resina caricata (250 mg, 0,145 mmol) in una siringa sinterizzato e gonfiare la resina elaborando dimetilformammide (5 ml) e agitando la siringa su un agitatore di laboratorio per 20 min. Espellere la soluzione e ripetere dimetilformammide gonfiore ancora una volta. </li><li> Rimuovere il gruppo protettore Fmoc aggiungendo 4-6 ml di 20% piperidina in dimetilformammide alla siringa seguita da 10-15 minuti di agitazione. Ripetere il processo deprotezione con un altro 4-6 ml di piperidina. Lavare la resina con una sequenza di 3x dimetilformammide, 3x dimetilformammide: metanolo (1: 1), metanolo 3x: diclorometano (1: 1), 3x diclorometano, ~ 5 ml. Fare un test alla ninidrina (+) su un piccolo campione (~ 10) delle perle di confermare deprotezione successo dalla presenza di blu dopo riscaldamento. </li><li> Mescolare una soluzione contenente acido 1&#39;-Fmoc-ammino-ferrocene-1-carbossilico(203,3 mg, 0,4350 mmoli), 1-idrossibenzotriazolo idrato (58,8 mg, 0,413 mmoli), diisopropil carbodiimide (0,0673 ml, 0,435 mmoli), diisopropil etil ammina (0,0757 ml, 0,435 mmoli), e una miscela 4: 1 di diclorometano e dimetilformammide. Disegna questo nella siringa sinterizzato e scuotere delicatamente su un agitatore di laboratorio per 6 ore. Poi espellere la soluzione dalla siringa e lavare come descritto in precedenza. </li><li> Eseguire il test alla ninidrina (-) come descritto sopra per confermare accoppiamento. Il test ninidrina può ancora essere utile nel confermare accoppiamento nonostante il colore arancio del tallone derivato dal fissaggio del ferro contenente frazione. </li><li> Quindi rimuovere il gruppo Fmoc mediante l&#39;aggiunta di 20% piperidina in dimetilformammide e lavati come descritto sopra. Il test ninidrina (+) deve essere utilizzato per confermare la rimozione Fmoc. </li><li> Preparare una soluzione composta di Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), 1-idrossibenzotriazolo idrato (58,8 mg, 0,4125 mmol), diisopropil carbodiimide (0,0673 ml, 0,4350mmol), diisopropil etil ammina (0,0757 ml, 0,4350 mmoli), e una miscela 4: 1 di diclorometano e dimetilformammide. Aggiungi questo cocktail accoppiamento cisteina siringa sinterizzato e scuotere delicatamente per 6 ore. Lavare utilizzando il protocollo descritto in precedenza. </li><li> Conferma accoppiamento utilizzando il test alla ninidrina (-), seguita dalla rimozione del componente Fmoc con il 20% di piperidina e lavaggio. Verifica terminale libero ammina utilizzando il test alla ninidrina (+). </li></ol></li><li> Cleavage di 1 dalla resina. <ol><li> Fare una soluzione di TFA (9.45 ml), acqua (0,25 ml), 1,2-etanditiolo (0,25 ml), e triisopropyl silano (0,1 ml), aggiungere alla siringa e agitare delicatamente per 4 ore. </li><li> Raccogliere la risultante soluzione rosso-marrone in un tubo Eppendorf e si evapora il TFA lentamente utilizzando una corrente d&#39;aria. </li><li> Aggiungere fredda etere dietilico (~ 15 ml) al tubo Eppendorf precipitare 1, che costituirà agitazione. Isolare il prodotto tramite centrifugazione (1 g, 5 min). Tcicli gallina ripetute di lavaggi etere etilico (~ 60 ml totale) e centrifugare per ottenere 1 come rosso / marrone solido. </li></ol></li></ol> 2. Caratterizzazione e analisi di 1 <ol><li> Verificare che l&#39;identità corrisponde la connettività e la composizione mostrata in figura 2 con 1 H (16 scansioni) e 13 C NMR (512 scansioni) in metanolo deuterato (300 microlitri) e analisi ESI-MS. Aspettatevi i seguenti risultati: Spettro 1 H NMR (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2.245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4.104 (d, 2H ), 4.274 (q, 1H), 4.426 (d, 2H), 4.479 (q, 1H), 4.595 (t, 1H) e 13 C NMR spettro (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH 2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28.300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38.698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (Cp-ring), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). ESI-MS (m / z): Trovato: 639.00 [1 + Na] +, teorica: 639,1 [1 + Na] + e HR-MS (m / z): Trovato: 617,2049 [1 + H] +, teorica: 617.1622 [1 + H] +. </li><li> Eseguire HPLC, analisi elementale conferma la composizione isolata 1. Eseguire i cromatogrammi HPLC utilizzando una colonna a fase inversa C8 100% MeOH ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min. Nota: i tempi di ritenzione HPLC sono stati: 3,198-4,674 min. </li></ol> 3. L&#39;immobilizzazione di 1 su una superficie d&#39;oro <ol><li> Cut polimero sostenuto scivoli d&#39;oro in quadrati di ~ 0,25 in 2. </li><li> Riempire un bicchiere da 50 ml con una soluzione di acqua deionizzata di 1 (~ 1 mM). </li><li> Aggiungere la diapositiva oro al bicchiere e coprire con un vetro da orologio. Tuttoow il vetrino di incubare O / N a RT senza agitazione. </li><li> Rimuovere il vetrino oro dalla soluzione e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Ottenere la scansione di immagini di microscopia elettronica usando un microscopio elettronico a scansione (o equivalente) per osservare immobilizzato 1. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La sintesi di derivati ​​asimmetrici ferrocene è impegnativo in soluzione. Ad esempio, i tentativi di produrre 1 in soluzione comportato basse rese di prodotto desiderato (meno del 20%). Analogamente, utilizzando reazioni 1&#39;-ammino-ferrocene acido carbossilico (sans Fmoc) e resina biotina legata determinato prodotto insolubile coerente con il prodotto polimerizzato riportato da Baristic et al. e prodotto minima. 47 Questo è ulteriormente complicato dal ferrocene e suoi derivati ​​essendo sensibile alla luce e che i congeneri amminoacidi sono inclini a dimerize in soluzione. Questi problemi rendono ampie reazioni e workups impegnativo. Tuttavia tale reattività può essere aggirato utilizzando metodi in fase solida prima sviluppati da Merrifield per la sintesi di peptidi. La sintesi di sistemi ferrocene-peptide ha raccolto l&#39;attenzione da diversi gruppi e ha portato a una libreria di sistemi di peptide-ferrocene asimmetrici. 46,48-52 Il lavoroqui descritta in dettaglio la sintesi dei primi ferrocene asimmetrica bio-coniugati contenenti biotina-ferrocene-cisteina. Questo composto serve da modello attraverso cui altre piccole molecole recettori potrebbero essere considerati per il rilevamento di molecole biologicamente rilevanti. In questo lavoro è stato utilizzato come un tether immobilizzazione di una superficie d&#39;oro. La prima fase della sintesi era quello di ottenere un nucleo biotina immobilizzato su una resina a stato solido mediante un linker base ammina-. Resina -Fmoc-etilendiammina Il N -Biotin- N &#39;può essere acquistato in commercio come biotina NovaTag resina ed è stato usato come base di bio-coniugato 1. Il gruppo protettore Fmoc-ammino stato rimosso usando una soluzione al 20% di piperidina in dimetilformammide e positivo (blu) ninidrina test ha confermato deprotezione successo. L&#39;ammina libera della biotina resina legata è stato poi utilizzato per ancorare ferrocene usando un cocktail di accoppiamento composto diisopropil etil ammina,diisopropil carbodiimmide, e 1-idrossibenzotriazolo idrato. 40,46 Una varietà di precursori ferrocene sono disponibili per tali scopi e comprendono acido carbossilico e acido carbossilico ferrocene 1&#39;-Fmoc-ammino-ferrocene. L&#39;uso degli ex rese sistema mono sostituito bio-coniugati aventi solo uno degli anelli ciclopentadienilici modificati con un&#39;appendice biotina. Quest&#39;ultimo derivato ferrocene comprende la sostituzione ortogonale degli anelli ciclopentadienilici con un acido carbossilico ed un gruppo ammino Fmoc-protetto. Questa sostituzione consente estesa modifica asimmetrica del nucleo ferrocene introduzione di modifiche separata degli anelli ciclopentadienilici per produrre bio-coniugati quali 1. Le perle giallo chiaro cambiato in un arancio brillante tonalità upon accoppiamento positivo del ferrocene al nucleo biotina-resina, come mostrato in Figura 2. Nella successiva fase di sintesi di una varietà linker potrebbe essere collegatoper l&#39;ammina libera del ferrocene congenere resina-bound. Ai fini di questo sistema, è stato utilizzato come cisteina è un amminoacido contenente tiolato. Il componente tiolato permette il fissaggio del bio-coniugato ad una superficie d&#39;oro, come discusso di seguito. Modifica con cisteina proceduto per reazione del sistema destinato resina con Fmoc-Cys (MMT) -OH. La rimozione del gruppo Fmoc con il 20% di piperidina in dimetilformammide produce le forme di resina vincolato 1. La bio-coniugato resina-legato è stato rimosso dal supporto solido per scissione dei sistemi bio-organometallico utilizzando una soluzione di acido trifluoroacetico (TFA), acqua e triisopropyl silano. L&#39;evaporazione della soluzione di acido e l&#39;aggiunta di etere etilico freddo prodotto bio-coniugato 1 come solido determinato essere il sale rosso-arancio di TFA 1 come confermato dalla analisi elementare e NMR. Purezza è stata confermata mediante analisi HPLC. Per mostrare prova di principio per lacomponente cisteina fornendo una pastoia allegato per bio-coniugato 1, deposizione di 1 su una superficie d&#39;oro è stato esplorato. Il noto affinità Au-S consente l&#39;immobilizzazione facile di 1 su una superficie d&#39;oro polimerica backed. In questo esperimento, la superficie di oro è stato pulito e lucidato delicatamente. La slitta è stato poi immerso in una soluzione di acqua ~ 1 mm 1 e ha permesso di impostare O / N. La superficie Au è stato poi lavato con acqua distillata ed essiccato con un Kimwipe. I vetrini d&#39;oro sono stati poi valutati per la modifica utilizzando SEM. Le immagini mostrate in Figura 4 sono rappresentative di un monostrato di 1 aver formato sulla superficie d&#39;oro. Le imperfezioni della superficie sono postulato ad essere il risultato di &#39;buchi&#39; nel monostrato di 1 e sono sotto approfondimento dal nostro gruppo. , I metodi di sintesi complessiva di produrre bioconiugati ferrocene che possonoessere immobilizzato su una superficie d&#39;oro sono riportati. Il lavoro è il romanzo in quella sintesi di composti ferrocene asimmetrici è sfidato da una serie di reazioni collaterali che portano a rendimenti bassi e la purezza. Come ferrocene-bioconiugati simili a 1 hanno applicazioni come potenziali biosensori, superare queste difficoltà di sintesi è fondamentale. Usando i metodi in fase solida simili alla sintesi peptidica in fase solida, un Bioconjugate ben caratterizzato 1 contenente biotina-ferrocene-cisteina è stato prodotto. Inoltre, SEM è stato usato per dimostrare che questo sistema è in grado di aderire ad una superficie d&#39;oro grazie alla frazione tiolato del componente cisteina. Nel complesso, La semplice metodologia sintetica fornite nel presente documento può essere facilmente modificato per sequenze peptidiche e sistemi bio-coniugato per una vasta gamma di applicazioni.

I biosensori sono piccoli dispositivi che utilizzano la tecnologia di riconoscimento biomolecolare come piattaforma per l&#39;analisi selettiva e vengono utilizzati per la loro specificità, velocità e basso costo. Biosensori elettrochimici per la rilevazione di biomolecole sono all&#39;avanguardia di questo campo per la loro semplicità, economicità, ed alta sensibilità. 1,3 L&#39;anatomia generale di tali sensori è un elettrodo dotato di una molecola di riconoscimento specifico per il marcatore biologica di interesse . Il legame del biomarker dalla molecola di riconoscimento si traduce in una variazione locale del potenziale o corrente che può essere rilevato mediante misurazione semplice. Ad oggi la frazione riconoscimento può variare da enzimi, anticorpi 4-8, 9-12 cellule intere, recettori 13-16, 17-20 peptidi 21-23 e DNA 24 e sono in gran parte incentrati su grandi, molecole biologiche. 25-28 Research sforzi in questo campo si sono concentrati principalmente sulla immunosensori WHEre una immunoglobulina è immobilizzato con un nucleo attivo redox (come ferrocene) e utilizzato per rilevare un anticorpo di interesse. Questi studi sono stati esclusi dalle applicazioni cliniche a causa di una scarsa precisione e consumo di tempo derivanti dalle complicazioni derivanti dall&#39;uso di antigene / anticorpi. 1,3 crescente attenzione si è concentrata sulla rilevazione di piccole molecole (meno di 1 kg / mol) di biomedica , cibo e interesse ambientale, oltre alla sicurezza nazionale. 29 Gli esempi più noti di dispositivi di biosensori sono monitor glucosio auto-test, che hanno serigrafate elettrodi enzimi accoppiati ad un formato tascabile metri amperometrico. Questi sistemi tipicamente utilizzano un metodo coulometrico cui la quantità totale di carica generata dalla reazione di ossidazione del glucosio è misurata su un periodo di tempo. Dispositivi negoziabili devono essere portatile, robusto e tenuto in mano per fare uso facile per la popolazione in generale. Tags Redox quali ferrocene sono necessary di fornire il rilevamento elettrochimico di biomarcatori o piccole molecole in soluzione, come la maggior parte dei biomarcatori non sono intrinsecamente elettrochimicamente attivi. 30-38 Ferrocene è una molecola organometallica che è un gold standard per l&#39;elettrochimica, che lo rende una scelta eccellente per l&#39;integrazione in biosensori elettrochimici. Redox basata ferrocene-specie attive hanno già raccolto una notevole attenzione a causa delle loro piccole dimensioni, buona stabilità, l&#39;accesso sintetico comodo, facile modificazione chimica, relativa lipofilia, e la facilità di messa a punto redox. 3,30-42 Piccole molecole basate sul core ferrocene hanno stati ampiamente utilizzati come rivelatori di ioni metallici e piccole molecole. 32-38,43 sistemi di targeting specie più grandi come biomolecole hanno utilizzato l&#39;allegato di grandi anticorpi o immunoglobuline di derivati ​​del ferrocene che sono stati integrati su una superficie elettrochimica. 1,3,39 , 44 In ogni caso, il potenziale di intensi e correntety della coppia redox Fe III / Fe II è stato modificato su accoppiamento molecolare, producendo così una nuova maniglia spettroscopica che indica la presenza della molecola analita. Tale variazione è determinata dalla vasta sovrapposizione che si verifica tra il pi-sistema degli anelli ciclopentadienilici ed il ferro orbitali-d. Se il pi-sistema viene modificato, cioè, derivatizzato o reagito, allora l&#39;interazione orbitale, a sua volta, il cambiamento. Questo influenzerà il nucleo Fe e può essere osservata come un cambiamento nel potenziale della coppia Fe III / Fe II. 40,45,46 Queste proprietà rendono tale sistema attraente per l&#39;uso come agente quantificare in un immunodosaggio elettrochimica o biosensore. Per produrre sistemi ferrocene contenente specifici per portate biosensore è ottimale modificare un anello Cp con il bio-recettore specifico per una molecola bersaglio e utilizzare l&#39;altro anello Cp come tether molecolare per la lettura elettrochimica o elettrode (Figura 1). Sintesi di questi derivati ​​asimmetrici ferrocene è sfidato da reazioni laterali e la formazione di specie dimerica e polimeriche formate su intermolecular cross-linking. 47 Tuttavia, giunto chimica producendo un legame ammidico è la via più diretta per fornire semplici derivati ​​del ferrocene che coinvolgono componenti biologiche tali come peptidi e loro metaboliti. Pertanto, le tecniche in fase solida prima sviluppate nel 1950 da Merrifield per sintesi peptidica possono essere applicati a composti organometallici contenenti ferrocene. Attraverso l&#39;uso del ortogonalmente sostituito molecola di acido 1&#39;-Fmoc-ammino-ferrocene-1-carbossilico, un sistema ferrocene che può contenere una molecola recettore (biotina), lettura elettrochimica (ferrocene), e componente immobilizzare-linker (cisteina) presenta stato costruito e qui descritto. La sintesi di questo bio-coniugato è discusso così come prova per l&#39;immobilizzazione su una superficie d&#39;oro. Questo rappre lavorots la prima presentazione di un sistema composto da biotina, ferrocene ed un amminoacido per l&#39;immobilizzazione su una superficie d&#39;oro.

<table><tbody><tr><td>Biotin Novatag Resin</td><td>NovaBiochem</td><td>8550510001</td><td></td></tr><tr><td>TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe</td><td>Fisher</td><td>NC9299151</td><td></td></tr><tr><td>piperidine</td><td>Acros</td><td>P/3520/PB05</td><td></td></tr><tr><td>ninhydrin test</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017-1ea</td><td></td></tr><tr><td>1&amp;rsquo;-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid</td><td>Omm Scientific</td><td>Special Order</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Novabiochem</td><td>8520080025</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5408</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>triisopropyl silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes (20 ml)</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>any source</td><td></td><td>dry with molecular sieves prior to use &amp;amp; store in 100 ml media bottle for easy usage</td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>any source</td><td></td><td>dry with molecular sieves prior to use &amp;amp; store in 100 ml media bottle for easy usage</td></tr><tr><td>dimethylformamide</td><td>any source</td><td></td><td>dry with molecular sieves prior to use &amp;amp; store in 100 ml media bottle for easy usage</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synthetic methodology for asymmetric ferrocene derived bio-conjugate systems via solid phase resin-based methodology

La diagnosi precoce è la chiave per il successo del trattamento della maggior parte delle malattie, ed è particolarmente importante per la diagnosi e il trattamento di molti tipi di cancro. Le tecniche più comuni utilizzate sono Imaging modalità, come la risonanza magnetica (MRI), tomografia ad emissione di Topografia (PET), e computerizzata Topografia (CT) e sono ottimali per la comprensione della struttura fisica della malattia, ma possono essere eseguite solo una volta ogni quattro sei settimane a causa dell&#39;uso di agenti di imaging e costo complessivo. Con questo in mente, lo sviluppo di &quot;point of care&quot; tecniche, come biosensori, che valutano lo stadio della malattia e / o l&#39;efficacia del trattamento in studio del medico e lo fanno in modo tempestivo, avrebbe rivoluzionato protocolli di trattamento. 1 come un mezzo per esplorare biosensori ferrocene base per la rilevazione di molecole biologicamente rilevanti 2, sono stati sviluppati metodi per produrre bio-coniugati ferrocene-biotina qui descritti. Questa relazione si concentrerà su un sistema biotina-ferrocene-cisteina che può essere immobilizzato su una superficie d&#39;oro.

La forma legata resina 1 è indicata in figura 2. L&#39;attacco covalente del componente ferrocene dà luogo ad una tinta arancione alle perle di resina che è persistente con lavaggio in continuo e indicativa di un ferro immobilizzato contenente complessa rispetto a assorbimento di ferro dal componente PEG del tallone resina. La forma priva di resina 1 è identico a colori per le perle di resina. Dopo la rimozione del composto dalla resina perline, la purezza e resa (68%) che derivano dai metodi è di gran lunga superiore alla metodologia tipica soluzione. Analisi elementare del prodotto ha mostrato che 1 è stato isolato come sale di TFA: Calcolato (Trovato) per C 26 H 36 O 4 FeN 6 S 2 4TFA: C, 38.07 (38,90); H, 3.76 (4.20); N, 7,83 (7,70). La resa risultante (105,1 mg, 68%) da una reazione tipica è basata sui risultati dell&#39;analisi elementare. Analisi NMR in deuterato metanolo provided spettro 1 H NMR (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2.245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4.104 (d, 2H), 4.274 (q, 1H), 4.426 (d, 2H), 4.479 (q, 1H), 4.595 (t, 1H) e 13 C NMR spettro (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH 2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28.300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38.698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (Cp-ring) , 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH ), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). Tempi di ritenzione HPLC sono stati: 3,198-4,674 min. Le molteplici picchi osservati in analisi HPLC sono stati confermati come sali di TFA 1 come descritto sopra utilizzando analisi elementare. La spettrometria di massa correlato alla struttura mostrata nella Figura 2: ESI-MS (m / z): Trovato: 639,00 [1 + Na] +,Teorica: 639,1 [1 + Na] + e HR-MS (m / z): Trovato: 617,2049 [1 + H] +, teorica: 617,1622 [1 + H] +. Spettri di assorbimento elettronica sono stati ottenuti in acqua e hanno mostrato λ max (ε, M -1 cm -1) 268 (4,779.8), 434 (324,26). I metodi utilizzati per incubare un piccolo scivolo oro in una soluzione di Bioconjugate 1 sono rappresentati nel disegno schematico in figura 3. Uno strato sottile di oro indietro con materiale polimerico è stato aggiunto ad una soluzione di 1 e lasciata incubare O / N. La slitta oro è stato quindi lavato con acqua deionizzata e lasciato asciugare. Contemporaneamente, una diapositiva oro è stato co-incubate in acqua deionizzata e lavato nello stesso modo. Immagini SEM dei due campioni, mostrati in figura 4, hanno mostrato che la superficie di oro slitta co-incubate con 1 è stata modificata. Ciò indica che ilinterazioni tiolici di 1 forniscono un&#39;ancora di attacco alla superficie d&#39;oro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52399/52399fig1.jpg" /> Figura 1. basi di un biosensore. Un esempio specifico di un biosensore elettrochimico per rilevare direttamente un bersaglio in soluzione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52399/52399fig2.jpg" /> Figura 2. I metodi di sintesi utilizzati per produrre 1. I metodi utilizzati per incubare un piccolo scivolo oro in una soluzione di Bioconjugate 1 sono rappresentati nel disegno schematico in figura 3. Uno strato sottile di oro indietro con materiale polimerico è stato aggiunto ad una soluzione di 1 e lasciato incubare O / N. La slitta oro è stato quindi lavato con acqua deionizzata e lasciato asciugare. Contemporaneamente, una diapositiva oro è stato co-incubate in acqua deionizzata e lavato nello stesso modo. Immagini SEM dei due campioni, Mostrato in figura 4, ha mostrato che la superficie di oro slitta co-incubate con 1 è stata modificata. Ciò indica che le interazioni tiolici di 1 forniscono un&#39;ancora di attacco alla superficie d&#39;oro. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52399/52399fig3.jpg" /> Figura 3. Schema rappresenta l&#39;immobilizzazione di 1 su un vetrino oro. Il processo prevede la dissoluzione Bioconjugate in acqua e aggiungendo la diapositiva oro. Incubazione O / N è seguita dal lavaggio della slitta. Analisi per l&#39;immobilizzazione successo viene effettuata utilizzando la microscopia elettronica a scansione mostrato in Figura 4. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52399/52399fig4.jpg" /> Figura 4. Le immagini SEM di oro stratificato su un film plastico-polimero. (A) sans incubazione 1 e (B) following incubazione con 1 in acqua O / N e risciacquo con acqua.

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Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Metodologia sintetico per Asymmetric Ferrocene derivati ​​sistemi bio-coniugati attraverso Solid Metodologia Resina a base di fase

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

synthetic-methodology-for-asymmetric-ferrocene-derived-bio-conjugate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.6K Views.  Texas Christian University. The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Video: Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Ricerca

Chimica

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as Ru(II), Pt(II), and Rh(III). The compound, named as a water-soluble metal-organic complex array (WSMOCA), is obtained through 1) the conventional solution-chemistry-based preparation of the corresponding metal complex monomers having a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protected amino acid moiety and 2) their sequential coupling together with other water-soluble organic building units on the surface-functionalized polymeric resin by following the procedures originally developed for the solid-phase synthesis of polypeptides, with proper modifications. Traces of reactions determined by mass spectrometric analysis at the representative coupling steps in stage 2 confirm the selective construction of a predetermined sequence of metal centers along with the peptide backbone. The WSMOCA cleaved from the resin at the end of stage 2 has a certain level of solubility in aqueous media dependent on the pH value and/or salt content, which is useful for the purification of the compound.

A potential general method for the synthesis of water-soluble multimetallic peptidic arrays containing a predetermined sequence of metal centers is presented.

Sintesi di una serie complessa Metal-Organic solubile in acqua

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Costruzione di peptidi elicoidale Via foto-indotta del tiolo-ene/yne Hydrothiolation Thioether/vinile solfuro-tethered

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of solid-phase synthesis, regenerating Michael (REM) linker strategies, and 1,3-dipolar cycloaddition, a library of structurally similar heterocycles, both with and without a spirocyclic center, can be constructed. The main advantages of the solid-support synthesis are as follows: first, each reaction step can be driven to completion using a large excess of reagents resulting in high yields; next, the use of commercially available starting materials and reagents keep the costs low; finally, the reaction steps are easy to purify via simple filtration. The REM linker strategy is attractive because of its recyclability and traceless nature. Once a reaction scheme is completed, the linker can be reused multiple times. In a typical solid-phase synthesis, the product contains either a part of or the whole linker, which can prove undesirable. The REM linker is &#34;traceless&#34; and the point of attachment between the product and the polymer is indistinguishable. The high diastereoselectivity of the intramolecular 1,3-dipolar cycloaddition is well documented. Limited by the insolubility of the solid support, the reaction progression can only be monitored by a change in the functional groups (if any) via infrared (IR) spectroscopy. Thus, the structural identification of intermediates cannot be characterized by conventional nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Other limitations to this method stem from the compatibilities of the polymer/linker to the desired chemical reaction scheme. Herein we report a protocol that allows for the convenient production of spirocyclic heterocycles that, with simple modifications, can be automated with high-throughput techniques.

Here we present a protocol to demonstrate an efficient method for the synthesis of spirocyclic heterocycles. The five-step process utilizes solid-phase synthesis and regenerating Michael linker strategies. Generally difficult to synthesize, we present a customizable method for the synthesis of spirocyclic molecules otherwise inaccessible to other modern approaches.

Sintesi in fase solida di [4,4] Spirocyclic ossime

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

Costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di &quot;Sicura del fucile&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Biologia

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Solid Phase Synthesis

Source: Vy M. Dong and Diane Le, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
Merrifield&#39;s solid-phase synthesis is a Nobel Prize winning invention where a reactant molecule is bound on a solid support and undergoes successive chemical reactions to form a desired compound. When the molecules are bound to a solid support, excess reagents and byproducts can be removed by washing away the impurities, while the target compound remains bound to the resin. Specifically, we will showcase an example of solid-phase peptide synthesis (SPPS) to demonstrate this concept.

Solid Phase Synthesis: Principles, Peptide Synthesis

Sintesi in fase solida

Source: Vy M. Dong and Diane Le, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
Merrifield&#39;s solid-phase synthesis is a Nobel Prize ...

Metodologia sintetico per Asymmetric Ferrocene derivati sistemi bio-coniugati attraverso Solid Metodologia Resina a base di fase

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Sintesi di proteine bioconiugati

Sintesi di una serie complessa Metal-Organic solubile in acqua

Costruzione di peptidi elicoidale Via foto-indotta del tiolo-ene/yne Hydrothiolation Thioether/vinile solfuro-tethered

Sintesi in fase solida di [4,4] Spirocyclic ossime

Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche

Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di "Sicura del fucile" Metodologia

Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

Sintesi in fase solida

Metodologia sintetico per Asymmetric Ferrocene derivati ​​sistemi bio-coniugati attraverso Solid Metodologia Resina a base di fase

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Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di "Sicura del fucile" Metodologia

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