Questo lavoro è supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation della Cina (No.31472037). La menzione dei nomi commerciali o dei prodotti commerciali in questo articolo è esclusivamente ai fini di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni.

NOTA: per limitare il degrado del RNA, preparare le soluzioni utilizzando acqua distillata autoclavata a umido (a 121 ° C per 60 min) e anche materiali autoclave a umido. 1. Preparazione di RNA ISH Antisense e Sense Probes <ol><li> Amplificazione e purificazione del gene target <ol><li> Innanzitutto, produrre un frammento a doppio filamento di L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) dal plasmide contenente il cDNA di LmigOR1 a piena lunghezza con una polimerasi Taq DNA che aggiunge adenine a entrambe le estremità dei frammenti. <ol><li> Utilizzare un volume di reazione di 100 μL, contenente 50 μL di miscela di reazione 2x, 4 μl di ciascuno dei sensori di senso e antisenso ( Tabella 1 ), 1 μL di plasmide template e 41 μL di H 2 O senza RNasi. Utilizzare il seguente PCR Protocollo: 94 ° C per 5 minuti, seguito da 30 cicli di 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min, Seguita da 72 ° C per 10 min. </li><li> Ripetere questi passaggi per produrre il frammento a doppio filamento di 1,303 bp di LmigOR2 (GenBank: JQ766966) e 1,251 bp frammento a doppio filamento di LmigORco (GenBank: JN989549). I primer utilizzati in questi esperimenti sono presentati nella Tabella 1 . </li><li> Eseguire i prodotti PCR su gel agarosio dell&#39;1,2% in tampone 1x Tris-acetato-EDTA e visualizzare utilizzando la colorazione del bromuro di etidio. </li></ol></li><li> Estrarre questi prodotti PCR utilizzando un kit di estrazione del gel. <ol><li> Dopo l&#39;elettroforesi, inserire le fasce di DNA di accisa dal gel e inserire le fette di gel in un tubo da 1,5 mL. Quindi aggiungere 100 μl di buffer di legame (Buffer PN) per 0,1 g di fetta di gel. Vorticali e incubare a 50 ° C fino a quando la fetta di gel è completamente sciolta. </li><li> Inserire una colonna di adsorbimento CA2 nel tubo di raccolta e aggiungere 500 μL di buffer di bilanciamento (Buffer BL). Ciò migliora la capacità di assorbimento e la stabilità della membrana di silice. CentriSi muove a 12.400 xg per 1 min. </li><li> Trasferire la miscela di gel dissolta al gruppo di colonna di adsorbimento e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Poi, centrifuga i tubi a 12.400 xg per 1 min. Scartare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta. </li><li> Aggiungere due volte 600 μL di soluzione di lavaggio (aggiunta di etanolo, Tampone PW). Centrifugare a 12.400 xg per 1 min. Eliminare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta. </li><li> Svuotare il tubo di raccolta e recuperare nuovamente la colonna a 12.400 xg per 2 minuti per consentire l&#39;evaporazione di qualsiasi etanolo residuo. </li><li> Trasferire con cautela la colonna di adsorbimento in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Asciugare a pellet il pellet per 5-10 min e ricollegare il DNA in un volume adatto ( ad esempio, 30 μL) di acqua priva di nucleasi. </li><li> Incubare a RT per 2 min. Centrifugare a 12.400 xg per 2 min. Scartare la colonna di adsorbimento e memorizzare il DNA a 4 ° C o -20 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Costruire i plasmidi ricombinanti <ol><li> Individualmente lega il frammento di 387 bp di LmigOR1 , frammento di 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco in un vettore T che contiene promotori per polimerasi RNA a T7 (a monte) e SP6 (a valle) adiacenti al DNA inserito usando ligasi del DNA di T4. Preparare la seguente 10 μL di reazione: 5 μL di tampone di legatura 2x, 1 μL di T vettore, 3 μL (~100 ng) del DNA del gene inserito e 1 μl di T4 ligasi DNA e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 5 μl di ciascun plasmide ricombinante contenente il frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco separatamente in 50 μl di competenti Escherichia coli DH5α in tubi sterili da 1,5 ml. <ol><li> Mescolare delicatamente e mettere i tubi in ghiaccio per 30 minuti e poi incubarli per 90 s a 42° C. Trasferirli nuovamente in ghiaccio per 3 minuti. </li><li> Aggiungere a ciascun tubo 450 μl di mezzo liquido Luria-Bertani (LB) senza ampicillina e incubarli in un agitatore a 150 giri / min per 1 h a 37 ° C per ripristinare l&#39; E. coli DH5α. </li><li> Prendere un&#39;aliquota di 100 μl di ciascun trasformante e utilizzarle per inoculare le lastre di substrato solido di LB contenenti ampicillina da 50 μg / ml, 24 μg / mL isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e 40 μg / ml 5-bromo-4 -chloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal). </li><li> Incubare queste piastre in un incubatore costante a 37 ° C per 18 h. Schermate i plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando il metodo di screening blu-bianco. Sequenza dei plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando sequenziamento di Sanger e identificazione delle direzioni di inserto di tre geni OR. </li></ol></li></ol></li><li> Selezionare endonucleasi di restrizione per linearizzare i plasmidi ricombinanti <ol><li> Usare endonucleasi di restrizione tIl cappello non solo digerisce nel sito di clonazione multiplo del vettore ma anche non taglia il DNA dell&#39;inserto. In questo esperimento, tutti i 3 geni vengono inseriti nel vettore T nella direzione corrispondente a quella del vettore. </li><li> Utilizzare l&#39;endonucleasi di restrizione Nco I per linearizzare i plasmidi ricombinanti contenenti il ​​frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco per produrre le sonde antisenso. Utilizzare l&#39;endonucleasi di restrizione Sp e I per produrre le sonde di sensazione. NOTA: Se la direzione dell&#39;inserto corrisponde a quella del vettore, viene selezionato un sito di restrizione univoco dalla fine di T7 per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Un sito unico di restrizione dalla fine dello SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda di sensazione. Altrimenti, se la direzione dell&#39;inserto non corrisponde a tLa direzione del vettore, quindi un sito unico di restrizione dalla fine di SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Il sito unico di restrizione dalla fine di T7 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda di senso. </li></ol></li><li> Purificando i plasmidi ricombinanti linearizzati <ol><li> Digest 20 μg ciascuno dei tre plasmidi ricombinanti contenenti il ​​387 bp frammento di LmigOR1 , 1,303 bp frammento di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco utilizzando l&#39;endonucleasi restriction Nco I in una reazione di 100 μl che contiene 10 μL di tampone 10x, 40 μL di 0,5 μg / μl di plasmide, 3 μL di Nco I e 47 μl di H 2 O senza RNasi, seguita da un&#39;incubazione di 3 ore a 37 ° C. </li><li> Allo stesso modo, digerire 20 μg di ciascuno di questi tre plasmidi ricombinanti uCantare l&#39;endonucleasi di restrizione Spe I. </li><li> Purificare questi plasmidi digeriti usando un kit di estrazione del gel come descritto in 1.1.2. Determinare le concentrazioni di questi plasmidi ricombinanti linearizzati estratti mediante spettrofotometria e regolare a 0,5 μg / μL. </li></ol></li><li> Preparare antisenso e sonde sensoriali <ol><li> Utilizzare il sistema di trascrizione RNA T7 / SP6 per generare sonde antisenso e sensori. La polimerasi RNA SP6 è usata per trascrivere RNA a doppio filamento per le sonde antisense DIG e biotina per questi tre geni OR utilizzando plasmidi ricombinanti linearizzati come modelli in vitro . La polimerasi RNA T7 viene utilizzata per produrre sonde di senso. Eseguire la reazione in un volume finale di 20 μl, contenente 2 μL di 10 volte NTP mix, 2 μL di 10X buffer di trascrizione, 1 μL di inibitore della RNasi, 2 μL di T7 o SP6 RNA polimerasi, 4 μL di 0,5 μg / μl di plasmidi linearizzati e 9 μL H 2 O senza RNasi, seguitiDa un incubo di 3 ore a 37 ° C. </li><li> Incubare le sonde antisense e sensori con DIG e biotina per 30 min con 1 μl DNasi a 37 ° C. Aggiungere 2,5 μL di 5 M LiCl e 75 μl di etanolo assoluto, quindi incubare le reazioni per 30 minuti a -70 ° C. </li><li> Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. Decanta con cautela il surnatante. Aggiungere 150 μl di etanolo al 70% per lavare il precipitante. Preparare l&#39;etanolo al 70% (1 L) aggiungendo l&#39;etanolo al 95% (736.8 mL) in acqua distillata sterile (263.2 mL). </li><li> Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C e asciugare in aria il pellet per 5-10 min a RT. Aggiungere 25 μL di H 2 O senza RNasi per sciogliere le sonde antisense e sensori RNA. </li><li> Se la lunghezza del gene inserito è più lunga di 1 kb, successivamente frammenti di RNA antisenso e sensori a una lunghezza media di ~ 300 bp per incubazione in soluzioni di tampone bicarbonato-carbonato. Eseguire la reazione in un volume finale di 50 μL, cCon 25 μL di sonda RNA e 25 μL di soluzione tampone bicarbonato-carbonato (80 mM NaHCO 3 , 120 mM Na 2 CO 3 , pH 10,2) a 60 ° C. Il tempo di idrolisi richiesto è dato da una formula pubblicata in precedenza 17 . </li><li> Aggiungere 5 μl di 10% di acido acetico per fermare la reazione. In questo esperimento, frammentare i LmigOR2 e LmigORco antisense e sonde di sensazione per 24 e 23 minuti, rispettivamente. T = (L o -L f ) / kXL o XL f L o = lunghezza iniziale del frammento in ca. L f = lunghezza del frammento finale in ca. K = la costante di velocità per l&#39;idrolisi, circa 0,11 kb -1 min -1 T = tempo di idrolisi in min </li><li> Infine, aggiungere 250 μl di tampone di ibridazione e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione delle Sezioni del Cryostat <ol><li> Precool il freeziNg del microtomo a -24 ° C. </li><li> Selezionare le nuove locuste di adulazione adulta che sono attive e che hanno antenne intatte. Tagliare le antenne in pezzi da 2-3 mm utilizzando i rasoi sterili. </li><li> Mettere il composto OCT su un supporto di microtomo congelante e mettere uno o due campioni sul composto orizzontalmente. Quindi, trasferire il supporto nel microtomo a congelamento a -24 ° C per equilibrare fino a quando il composto si blocca. Estrarre il supporto e coprire i campioni con un piccolo composto. Trasferire il titolare nel microtomo di congelamento a -24 ° C per almeno 10 minuti ( Figura 1 ). NOTA: Evitare di ottenere bolle nel composto. </li><li> Fissare il supporto con i campioni nel microtomo di congelamento, quindi dividere i campioni congelati in fette di 12 μm a -24 ° C. </li><li> Fissare le fette uno ad uno su diapositive (25 x 75 mm, senza nucleasi) e asciugare all&#39;aria per 10 min. </li></ol> 3. Sezioni di fissaggio <ol><li> Dopo aver preparato il criostatoMettere le diapositive in un contenitore di plastica (~ 100 x 40 x 80 mm) e fissare i tessuti incubando le diapositive in soluzione 4% di paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le diapositive in 1X saline fosfato-bufferizzato (PBS) per 1 minuto. </li><li> Per eliminare le proteine ​​alcaline, trasferire le diapositive a 0,2 M HCl per 10 minuti. </li><li> Per eliminare la proteina superficiale dell&#39;acido nucleico, trasferire le diapositive a 1XPBS con 1% di Triton X-100 per 2 min. </li><li> Lavare le diapositive due volte per 30 s in 1x PBS. </li><li> Infine, sciacquare le diapositive in soluzione formamide per 10 minuti a 4 ° C. </li></ol> 4. Ibridazione <ol><li> Preparare le sonde antisenso e sensore <ol><li> Utilizzare un tampone di ibridazione per diluire le sonde di antisense o sensori di RNA nei tubi da 1,5 mL senza nucleasi. In questo esperimento, per tutte le sonde antisense e sensori ( LmigOR1, LmigOR2 e LmigOrco ), aggiungere 1 μL di sonda a 99 μL buffer di ibridazione per diapositiva. Generalmente, l&#39;uso di diluizioni 1: 100 di sonde antisenso produce significativi segnali positivi e bassi sfondi utilizzando questo protocollo. </li><li> Per il rilevamento cromogenico, provvedere a diluire singolarmente le sonde DIG-etichettate. </li><li> Per il rilevamento TSA, diluire DIG marcato LmigOR1 con sonde LmigOrco marcati con biotina o DIG marcato LmigOR2 con biotina marcata LmigOR1 sonde insieme nel tampone di ibridazione. </li><li> Scaldare le diluizioni per 10 minuti a 65 ° C e metterle in ghiaccio per almeno 5 min. </li></ol></li><li> ibridazione <ol><li> Scolare le diapositive e aggiungere 100 μL di sonde antisense e sensori diluiti (fase 4.1) alle sezioni del tessuto. Quindi, posizionare le copertine (24 mm x 50 mm, senza nucleasi) sulle sezioni del tessuto. </li><li> Posizionare i vetri coperti orizzontalmente in una scatola umida (~ 300 x 180 x 50 mm 3 ; figura 2 ) e incubare unaT 55 ° C per 22 ore. Aggiungere una soluzione di formamide o 1X PBS al fondo della scatola per mantenere l&#39;ambiente umido, ma non immergere le diapositive nel liquido. </li></ol></li><li> Lavaggio e blocco. <ol><li> Dopo l&#39;ibridazione, rimuovete con attenzione le copertine. Lavare le diapositive due volte per 30 minuti in 0,1 x Saline Sodio Citrato (SSC) a 60 ° C. NOTA: Lavatrice significa mettere le diapositive in un supporto di scorrimento che viene poi posizionato in un contenitore di plastica e agitato leggermente su un bilanciere (~ 50 rpm; Figura 2 ). </li><li> Sciacquare le diapositive in 1x Tris-Buffered Saline (TBS) per 30 s. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente di blocco dell&#39;1% in TBS completato con 0,03% di Triton X-100 su ciascuna diapositiva e incubare per 30 min. Quindi, scartare la soluzione di blocco. </li></ol></li><li> Immunoistochimica. <ol><li> Per il rilevamento cromogenico, utilizzare il reagente di bloccaggio in TBS per diluire 750 unità (U) / mL anti-digoxigenina AP-coniugato antiboDa due a 1,5 U / ml soluzione AP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP per scivolo coperto (24 mm x 50 mm). </li><li> Per la rilevazione di TSA, utilizzare il reagente bloccante in TBS per diluire 750 U / mL di anticorpi anti-digoxigenin AP coniugati e anti-biotina streptavidina HRP-coniugata contro la soluzione AP / HRP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP / HRP per uno scivolo coperto (24 mm x 50 mm). </li><li> Incubare le diapositive in una scatola umida ( Figura 2 ) per 60 minuti a 37 ° C. Utilizzare la soluzione formamide o 1X PBS per mantenere la scatola umida ma non soglia. </li></ol></li></ol> 5. Colorazione <ol><li> Rimuovere con attenzione i coperchietti. Lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS integrato con 0,05% di Tween-20. Sciacquare le diapositive in DAP-buffer (rilevazione cromogena: pH 9,5; rilevazione TSA: pH 8,0) per 5 min. </li><li> Colorazione (rilevazione cromogena) <ol><li> Aggiungere 100 μL di soluzione NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) di substrato (diluito in DAP;PH 9,5) a ogni diapositiva. Posizionare con attenzione i coperchi (24 x 50 mm) sulle diapositive. </li><li> Incubare le diapositive in una scatola umida con soluzione di substrato per 10 min - O / N a 37 ° C. NOTA: Controllare lo sviluppo guardando le diapositive di tanto in tanto sotto il microscopio. </li><li> Quando lo sviluppo è pronto, arrestare la reazione trasferendo le diapositive in acqua. </li></ol></li><li> Colorazione (rilevazione TSA) <ol><li> Utilizzare una siringa per spostare il substrato HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) dal filtro della siringa (0,22 μm; Figura 2 ). </li><li> Aggiungere 100 μL di substrato HNPP / Fast Red per diapositiva ricoperta da una copertura (24 x 50 mm). Incubare le diapositive per 30 min con substrato HNPP / Fast Red a RT. </li><li> Rimuovere con cura i vetrini e lavare le diapositive tre volte per 5 minuti in 1X TBS integrato con 0,05% di Tween-20. </li><li> Utilizzare 100 μl di substrato TSA / coperto (24 x 50 mm 2 ) scorrevole. Incubare le diapositive con substrato TSA per 10 minuti a RT. </li><li> Rimuovere le copertine con cura e lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS con 0,05% di Tween-20. </li></ol></li><li> Incorporare le diapositive in PBS / glicerolo (1: 3). NOTA: Dopo aver terminato queste procedure, le diapositive devono essere osservate il più presto possibile perché il segnale fluorescente si spegnerà rapidamente. </li></ol> 6. Osservazione <ol><li> Rilevamento cromogeno <ol><li> Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio ottico. Scegli le lenti obiettivo 10X, 20X e 40X per osservare i risultati del rilevamento cromogeno. </li><li> Utilizzare il software DP-BSW per analizzare i risultati e acquisire le immagini. </li></ol></li><li> Rilevamento TSA <ol><li> Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio confocale. I geni con etichetta DIG devono essere osservati sotto la luce di 543 nm, presentando un colore rosso e i geni biotinici devono essereOsservata sotto la luce di 488 nm, presentante un colore verde. Quando emergono, presentano il colore giallo. </li><li> Scegli le lenti obiettivo 20X e 40X per osservare rispettivamente i risultati del rilevamento TSA. </li><li> Utilizzare il software FV1000 per analizzare i risultati e acquisire le immagini. </li></ol></li></ol>

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C., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ.+hybridization+to+cellular+RNA+with+radiolabelled+RNA+probes.">In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes.</a> In situ hybridization. , 2 (1992).</li><li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate.">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li><li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose:+Bio-blots.">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li><li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li><li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution.">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da divulgare né altri conflitti di interesse.

È difficile eseguire RNA ISH per localizzare i geni OR nelle antenne degli insetti perché i livelli di espressione di geni OR, ad eccezione di ORco , sono molto bassi e che preservano fette istologiche di antenne insettiche è molto difficile. Inoltre, il rilevamento di TSA è anche molto complicato. Per risolvere questi problemi, occorre prendere le seguenti misure. Le antenne sono scelte da locuzioni adulte di recente molting che presentano cuticole sottili e morbide di antenne, che mantengono la loro morfologia sullo scivolo. I campioni congelati vengono tagliati in fette di 12 μm. Sono utilizzate sonde altamente sensibili e specifiche di biotina e DIG. Detergenti, come Tween-20 e Triton X-100, vengono utilizzati per ridurre lo sfondo in molti passaggi. Nel rilevamento di TSA, un gene altamente espresso, rispetto ad un altro gene espressamente basso, dovrebbe essere etichettato con biotina-16-UTP. Le diapositive devono essere osservate il più presto possibile perché i segnali fluorescenti si spegneranno rapidamente. DIG-aNd le sonde con biotina hanno i vantaggi di una durata più lunga, maggiori segnali di segnale e rumore e migliori risoluzioni cellulari rispetto alle sonde radioattive 18 , 19 . Il protocollo presentato in questo documento presenta alcuni vantaggi rispetto all&#39;intera integrazione di ibridazione in situ . Questo protocollo identifica facilmente le localizzazioni dei geni a livello cellulare, ma non può essere facilmente utilizzato per indagare i modelli di distribuzione del gene, che è più facilmente eseguito con l&#39;ibridazione in situ in situ . Per identificare un gene OR, sono stati presi due approcci. Uno era il rilevamento cromogenico in sezioni consecutive e l&#39;altro era rilevamento fluorescente in una sezione. ORco è coespresso con un determinato OR come marker ORN 10 , 20 , 21 . Le cellule che esprimevano LmigOR1 o LmigOR2 erano entrambe situateA raggruppamenti di cellule LmigORco- esprimenti che li hanno chiaramente identificati come OR ( Figura 4 e Figura 6 ). Usando gli stessi approcci, abbiamo scoperto che LmigOR1 e LmigOR2 non sono coespressi in un sensilio. I risultati di questi due approcci sono corroboranti. Questo protocollo è stato anche utilizzato con successo per localizzare LmigORco, SgreORco, SgreIR8a e SgreIR25a nelle antenne di locusta 10 , 14 . Recentemente, LmigOR3 è stato localizzato nei neuroni trilogeno sensile in L. migratoria utilizzando lo stesso protocollo 15 . Questo protocollo è stato usato per localizzare due proteine ​​della membrana neuronale sensoriale SgreSNMP1 e SgreSNMP2 nelle antenne di S. gregaria 16 . Pertanto, questo protocollo ha affidato in modo affidabile i geni correlati ai chemosensori nelle antenne della locusta, che non solo hanno verificato questiGeni candidati, ma anche localizzato questi geni a cellule specifiche alloggiate in diversi tipi di sensilla. In conclusione, questo protocollo altamente efficace di RNA ISH è specificatamente descritto per localizzare i geni OR, così come altri geni espressi a bassi livelli, nelle antenne degli insetti.

Le antenne degli insetti, che sono gli organi chemo-senoriali più importanti, sono ricoperti da molte strutture del capello, chiamate sensilla, che sono innervate dai neuroni dell&#39;orecchio olfattivo (ORN). Sulla membrana degli ORN insetti, i recettori ordoranti (OR), un tipo di proteina contenente sette domini transmembranti, vengono espressi con un coreceptore (ORco) per formare un eteromero che funge da canale ionico 1 , 2 , 3 . ORs differenti rispondono a diverse combinazioni di composti chimici 4 , 5 , 6 . Le locuste ( Locusta migratoria ) si basano principalmente sulle indicazioni olfattive per attivare comportamenti importanti 7 . Gli OR Locust sono fattori chiave per comprendere i meccanismi olfattivi molecolari. Localizzare una specifica locusta OR gene al neurone di aTipo sensilismo morfologicamente specifico da RNA In Hybridization In Situ (RNA ISH) è il primo passo per esplorare la funzione OR. RNA ISH utilizza una sonda RNA complementare etichettata per misurare e localizzare una sequenza specifica di RNA in sezione di tessuti, cellule o montanti interi in situ , fornendo approfondimenti nei processi fisiologici e nella patogenesi della malattia. Sono state ampiamente utilizzate sonde RNA con etichettatura digossigenina (DIG-etichettata) e biotina. L&#39;etichettatura di RNA con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP può essere preparata mediante trascrizione in vitro con le polimerasi RNA di SP6 e T7. Le sonde RNA con DIG e biotina hanno i seguenti vantaggi: non radioattivi; sicuro; stabile; Altamente sensibile; Altamente specifiche; E facile da produrre usando PCR e trascrizione in vitro . Le sonde RNA con DIG e biotina possono essere rilevate in modo cromogeno e fluorescente. Le sonde RNA con etichetta DIG possono essere rilevate con anti-digoxigenin AlkaliNe anticorpi concomitanti con fosfatasi (AP) che possono essere visualizzati con substrati chemiluminescenti altamente sensibili nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizzando un microscopio ottico o con 2 Acido-2-fenilanilide fosfato (HNPP) accoppiato con sale di cloruro di emiciclo 4-chloro-2-methylbenzenediazonium (Fast Red) utilizzando un microscopio confocale. Le sonde RNA con biotina possono essere rilevate con anticorpi coniugati con anti-biotina streptavidina per rade di rapa perossidasi (HRP) che possono essere visualizzati con tiramidi di fluoresceina usando un microscopio confocale. Così, l&#39;ibridazione in situ fluorescente a doppio colore può essere eseguita per rilevare due geni bersaglio in una fetta usando sonde RNA etichette DIG e biotina. RNA ISH con sonde DIG e / o biotina è stato utilizzato con successo per localizzare i geni correlati agli olfattivi, come OR , recettore ionotropico, proteina legante odoranteE proteine ​​della membrana del neurone sensoriale, nelle antenne insettuali di, ma non solo, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e la locusta di deserto Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Tuttavia, ci sono due sfide sostanziali quando si esegue RNA ISH per gli OR di insetti: (1) OR geni (ad eccezione di ORco ) sono espressi a bassi livelli e solo in poche cellule, rendendo molto rilevante il rilevamento del segnale e (2) Istologia, tale che la morfologia sia preservata e il rumore di fondo è basso, può essere impegnativo. In questo documento un protocollo dettagliato ed efficace che descrive RNA ISH per localizzare i geni OR in insettoVengono presentate antenne, tra cui sia la rilevazione cromatica e la tastatura del segnale di tiramide (TSA).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215;TSINGKETM Master Mix</td>
			<td>TSINGKE, China</td>
			<td>TSE004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free H2O</td>
			<td>TIANGEN, China</td>
			<td>RT121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGULAR AGAROSE G-10</td>
			<td>BIOWEST, SPAIN</td>
			<td>91622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance buffer</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T Vector</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>A362A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>M180A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>TIANGEN, China</td>
			<td>CB101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>A-6140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Inalco, USA</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td>SBS Genetech, China</td>
			<td>GX1-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nco I</td>
			<td>BioLabs, New England</td>
			<td>R0193S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spe I</td>
			<td>BioLabs, New England</td>
			<td>R0133M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11685597910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10012718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10009257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td>
			<td>10000292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td>
			<td>FISH0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>80070591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>AMRESCO, USA</td>
			<td>0777-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>0.04mol/L Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td>
			<td>10000292</td>
			<td>0.12%acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>03677</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>10g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM335231</td>
			<td>10g/L Peptone from casein (Tryptone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM361526</td>
			<td>5g/L Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>10g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM335231</td>
			<td>10g/L Peptone from casein (Tryptone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM361526</td>
			<td>5g/L Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>WISENT ING, Canada</td>
			<td>800-010-CG</td>
			<td>15g/L Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>8.5%NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900041-500G</td>
			<td>14mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900268-500G</td>
			<td>80mM Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris buffered saline (pH7.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>1M Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris buffered saline (pH7.5)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>1.5M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>100mM Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>100mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900020-500G</td>
			<td>50mM MgCl2&#183;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;saline-sodium citrate (pH7.0)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>3M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;saline-sodium citrate (pH7.0)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900095-500G</td>
			<td>0.3M Na-Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution (pH9.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900894-100G</td>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution (pH9.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900182-500G</td>
			<td>0.1M NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900182-500G</td>
			<td>80mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td>120mM Na2CO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide Solution (pH10.2)</td>
			<td>MPBIO, USA</td>
			<td>FORMD002</td>
			<td>50% Deionized Formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide Solution (pH10.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#215;saline-sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1% Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td>AMRESCO, USA</td>
			<td>0694-500ML</td>
			<td>0.03% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1&#215;Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase solution</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>MPBIO, USA</td>
			<td>FORMD002</td>
			<td>50% Deionized Formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2&#215;saline-sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>D8906-50G</td>
			<td>10% dextran sulphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>invitrogen, USA</td>
			<td>AM7119</td>
			<td>20 &#181;g/ml yeast t-RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>D3159-10G</td>
			<td>0.2 mg/ml herring sperm DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11758888001</td>
			<td>1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate (10mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11758888001</td>
			<td>1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide signal amplification substrate</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>2% fluorescein-tyramides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide signal amplification substrate</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>Amplification Diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>Jung CM300 cryostat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td>
			<td>NANODROP 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>Olympus IX71microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>Olympus BX45 confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization

Gli insetti hanno evoluto sofisticati sistemi di accoglienza olfattiva per sensibilizzare i segnali chimici esogeni. Questi segnali chimici sono trasdolati da Neuroni Receptor Olfattivi (ORNs) alloggiati in strutture di capelli, chiamate chemosensilla, delle antenne. Nelle membrane delle ORN, si ritiene che i recettori ordoranti (OR) siano coinvolti nella codifica degli odori. Quindi, essere in grado di identificare i geni localizzati alle ORN è necessario per riconoscere i geni OR e costituisce una base fondamentale per ulteriori studi funzionali in situ . I livelli di espressione di RNA di OR specifici nelle antenne insettici sono molto basse e la conservazione del tessuto degli insetti per l&#39;istologia è impegnativa. Pertanto, è difficile localizzare un OR ad un tipo specifico di sensilla usando l&#39;ibridazione RNA in situ . In questo articolo viene introdotto un protocollo dettagliato e altamente efficace di RNA in situ di ibridazione in particolare per i geni OR insoddisfatti di espressione debole. Inoltre, uno specifico OR Gene waS identificata condurre esperimenti di ibridazione in situ fluorescenti a doppio colore usando un gene recettore co-esprimente, Orco , come marker.

Con rilevazione cromogenica, un piccolo sottoinsieme delle cellule antenne in ogni sezione antenne adulta è stato indicato con le sonde antisense LmigOR1 e LmigOR2 ( Figura 3 ) con DIG. RNA ISH su sezioni consecutive per localizzare LmigOR1 e LmigOR2 ha mostrato che le cellule antennali che esprimono i due geni si trovavano nei cluster ORN che esprimevano LmigORco , indicando che il putativo LmigOR1 e LmigOR2 erano effettivamente espressi in ORN ( Figura 4a -4d ). A volte, sono state visualizzate strutture etichettate come dendritiche ( Figura 4e -4f ). LmigOR1 e LmigOR2 erano entrambi localizzati ai neuroni nella sensilla basiconica ( Figura 5a-5b ), ma non erano coespressi in sensilla individuale, indicando che erano presenti in diversi basico<html> Nic sensillium sottotipi ( Figura 5c- 5d ). Nel rilevamento TSA, l&#39;ibridazione in situ in fluorescenza a doppio colore ha mostrato che le cellule esprimenti LmigOR1 (colore rosso) erano localizzate nei cluster ORN che esprimevano LmigORco (colore verde), indicando che il presunto LmigOR1 è stato espresso in ORN ( Figura 6a ). Una vista ravvicinata delle aree in scatola della figura 6a è mostrata nella figura 6b . I neuroni esprimenti LmigOR1 (colore verde, figura 7a ) e il neurone esprimente LmigOR2 (colore rosso, figura 7b ) si trovavano a diversi sottotipi di sensillium basico ( Figura 7c ). <html> 4 / 55924fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Preparazione delle sezioni dell&#39;antenna di insetti per l&#39;ibridazione in situ RNA. (A) Il microtomo di congelamento; ( Bc ) I campioni sono incorporati in un congelatore OCT Compound. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55924/55924fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55924/55924fig2.jpg" /> Figura 2: Elementi sperimentali per l&#39; ibridazione RNA in situ . (A) Il portavetrini e il contenitore di plastica. B ) La scatola umida. ( C ) il rocker. D ) il filtro a membrana. E ) microscopio confocale.<html> .jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55924/55924fig3.jpg" /> Figura 3: Localizzazione cellulare di LmigOR1 e LmigOR2 negli organi olfattivi. (A) Sintesi di cellule esprimente LmigOR1 in un segmento antenne locusta. ( B ) Panoramica delle cellule esprimenti LmigOR2 in un segmento antenne di locuste. Le frecce indicano le cellule che esprimono LmigOR1 ( a ) e LmigOR2 ( b ). Barre di scala = 100 μm (a e b). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55924/55924fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <html> &quot;&gt; <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55924/55924fig4.jpg" /> Figura 4: Identità neuronale delle cellule antenne esprimendo LmIGORs mediante rivelazioni cromogene. (Ab) Lo schema di etichettatura LmigOR1 (a) e LmigORco (b) sonda antisenso su sezioni consecutive di antenna locusta. ( Cd ) Il modello di etichettatura della sonda antisense LmigORco ( c ) e LmigOR2 ( d ) su sezioni consecutive di antenne locuste. ( Ef ) Illustrazione di strutture a volte danneggiate (indicata da frecce rosse). Barre di scala = 50 μm (ad); 20 μm (e e f). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55924/55924fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55924/55924fig5.jpg" /> Figura 5: LmigOR1 e LmigOR2 sono espressi in ORN alloggiati in sensazione Basiconic. (Ab) Basiconic sensillum ospitato ORNS esprimono LmigOR1 (a) e LmigOR2 (b). ( Cd ) L&#39;espressione di LmigOR1 e LmigOR2 in sottoinsieme distinto di ORN antenne è stata verificata in sezioni consecutive (cd). Le frecce a freccia indicano le cellule antennali che esprimono LmigOR1 (a, c) e LmigOR2 (b, d). Ba: sensilio basicico. Barre di scala = 20 μm (a e b); 50 μm (c e d). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55924/55924fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Figura 6: Identità neuronale della cella antenne esprimendo LmigOR1 mediante rilevamenti TSA. (A) bicolore ibridazione in situ è stata eseguita su sezione longitudinale antennale per illustrare l&#39;espressione di LmigOR1 (rosso) e LmigORco (verde). Localizzazione di LmigOR1- espressione di cellule in cluster di cellule che esprimono LmigORco ha confermato la sua identità neurale. ( B ) Vista ravvicinata delle aree inscatolate in a. Di tanto in tanto le strutture a forma di dendritica sono state indicate con la freccia. Le aree circondate indicano il cluster di ORN che esprime LmigORco e condivide lo stesso sensilum. Barre di scala = 50 μm (a); 20 μm (b). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55924/55924fig6large.jpg" target="_blank">C</a>Leccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55924/55924fig7.jpg" /> Figura 7: LmigOR1 e LmigOR2 sono stati localizzati a diversi ORAN di Basiconic Sensia da TSA Detection. I segnali fluorescenti sono stati visualizzati usando sistemi di rilevazione, indicando i neuroni LmigOR1 dalla fluorescenza verde ( a ) e le cellule positive di LmigOR2 mediante la fluorescenza rossa ( b ) sono state espresse in differenti sottotipi di sensoniali basilari ( c ). Le frecce a freccia indicano le cellule antennali che esprimono LmigOR1 e LmigOR2 . Barre di scala = 20 μm. Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55924/55924fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un</a>Versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome </td><td> sequenze </td></tr><tr><td> Lmig OR1 -sonde </td><td> 5&#39;-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3&#39; </td></tr><tr><td> Lmig OR1 -sonda-come </td><td> 5&#39;-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3&#39; </td></tr><tr><td> Lmig OR2-sonde </td><td> 5&#39;-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3&#39; </td></tr><tr><td> Lmig OR2-sonda-as </td><td> 5&#39;-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3&#39; </td></tr><tr><td> Lmig Orco-sonde </td><td> 5&#39;-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3&#39; </td></tr><tr><td> Lmig Orco-sonda-as </td><td> 5&#39;-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Le sequenze dei primer PCR.

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e altamente efficace di ibridazione in RNA in situ , in particolare per i geni espressi a basso livello del recettore dell&#39;Odorant (OR), così come altri geni, nelle antenne degli insetti utilizzando digoxigenina (DIG) o sonde con biotina.

Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell&#39;antenna di Locust da RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

8.0K Views.  China Agricultural University.  Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e altamente efficace di ibridazione in RNA in situ , in particolare per i geni espressi a basso livello del recettore dell'Odorant (OR), così come altri geni, nelle antenne degli insetti utilizzando digoxigenina (DIG) o sonde con biotina. 

Video: Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Ricerca

Neuroscienze

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Vivere-cella misura di Odorant recettore attivazione mediante un'analisi di campo in tempo reale

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology