Name: in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
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Leon Tai è finanziato da fondi d&#39;avvio di Chicago University of Illinois.

Tutti gli esperimenti seguono i protocolli del Comitato di istruzione e tutela degli animali istituzionali dell&#39;Università dell&#39;Illinois, Chicago. 1. Preparazione generale NOTA: La linea cerebrale endoteliale (hCMEC / D3) è una linea umana immortalizzata ampiamente caratterizzata dalla linea BEC 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Coltivare le cellule hCMEC / D3 sulle colonie di coltura tissutale rivestite con collagene tipo I (pelle di vitello, diluizione 1:20 di soluzione 0,1% in Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) contenente Ca 2+ e Mg 2+ ) nel basale Endothelial Growth Basal Medium (EBM-2) contenente 2-5% di siero fetale fetale (FBS), 10% acido ascorbico, 10% gentamicina solfato, 25% idrocortisone e 1/4 del volume totale degli integratori fattori di crescita forniti per 500 mL di supporti [ Vascolare endotelio gr(IGF-1) e fattore di crescita fibroblastica basale umano (bFGF), vedi tabella dei materiali ]. Il fattore di crescita (VEGF), il fattore di crescita epidermico (EGF) NOTA: il medium EBM-2 con FBS ei fattori di crescita è indicato come &quot;EBM-2 complete&quot;. EBM-2 senza FBS e integratori viene chiamato &quot;EBM-2 basal&quot;. A piena confluenza, le cellule hCMEC / D3 sono ~ 1 x 10 5 cellule / cm 2 . <ol><li> Passaggio delle cellule hCMEC / D3 in un rapporto di 1: 5 prima incubando con HBSS per 3 min senza Ca 2+ e Mg 2+ seguito dal distacco con 5 mL di trysina / EDTA (0,25%) per 5 min. Neutralizzare la tripsina usando EBM-2 completa (neutralizzazione 1: 1) e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C; Scartare il surnatante. Riposizionare il pellet in EBM-2 completo e ri-piastra a rapporto 1: 5. </li><li> Coltivare le pericie umane primarie e gli astrociti secondo il protocollo del fornitore [ Tabella dei Materiali ]. culturE le pericelle nel mezzo basico perlicente con supplemento di crescita FBS e pericita. </li><li> Coltivare gli astrociti umani nel terreno astrocitico contenente fattori di crescita astrocitico. Coltivare sia le pericie che gli astrociti in flaconi di coltura tissutale rivestiti con 3 ml di poli-L-lisina (PLL) per l&#39;adesione cellulare e utilizzare le cellule tra i passaggi 2 e 5. </li><li> Eutanizzare 7 topi e rimuovere gli steli del cervello e la cerebella con le pinze; Staccare i meningi con un accurato spostamento dei cervelli sulla garza. Tritare il tessuto cerebrale rimanente in un piatto di Petri in Medium Minimal Essential (MEM) con HEPES (5 mL per cervello) con una lama di rasoio sterile. Isolare i topi primari del BEC da topi di 2 mesi C57BL / 6J secondo il protocollo di riferimento 20 . </li><li> Trasferire il tessuto cerebrale macinato in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e incubare il tessuto in un papain (833,33 μL per cervello) e DNase (41,7 μL per cervello)Soluzione, in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C per 1 ora, per digerire il tessuto. </li><li> Tritare l&#39;omogenato in sequenza con aghi da 19 e 21, mescolare con un rapporto 1: 1 con una soluzione al 22% di Bovine Serum Albumin (BSA) e centrifugare a 1360 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Resuspendere il pellet risultante in 1 mL di EBM-2 e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C. Riposizionare nuovamente in 1 mL di EBM-2 completare e piastrare le cellule (1 mL / pozzetto) su piastre a 6 pozzetti rivestite con collagene (~ 1 cervello per pozzetto). </li><li> Sostituire il supporto 24 h più tardi con EBM-2 completo contenente 4 μg / mL puromicina cloridrato; Sostituire con EBM-2 completo dopo 2 giorni. I BEC primari sono coltivati ​​come per le cellule hCMEC / D3 e sono in piena confluenza a 1 x 10 5 cellule / cm 2 . </li><li> Preparare 100 μM di oAβ, 24 h prima del dosaggio. NOTA: l&#39;oAβ è considerata la forma di malattia di A. Per l&#39;oAβ, utilizzare le preparazioni ben caratterizzate descritte da DahlgreN et al. 21 . </li><li> Scongelare la soluzione di base della membrana basale a 4 ° C e trasferire l&#39;aliquota in strisce sterili PCR (8 tubi) a 140 μl di membrana basale per tubo. Riaffilare ogni striscia e conservare a -20 ° C. Sciogliere una striscia a 96 pozzetti a 4 ° C, 24 h prima del dosaggio. Pre-raffreddare le punte della pipetta per evitare la solidificazione. NOTA: Tutto il trattamento della matrice della membrana basale deve essere effettuato su ghiaccio per evitare una rapida solidificazione. Poiché 10 μL per pozzetto di membrana basale viene utilizzato il giorno del dosaggio, ogni striscia è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Incubare completamente confluenti BEC in EBM-2 basale, 24 h prima del dosaggio. NOTA: La motivazione è: EBM-2 completo contiene fattori integrati e FBS allo scopo di promuovere la crescita cellulare ottimale; Tuttavia, gli stessi percorsi molecolari che promuovono la crescita cellulare sono importanti anche per la copertura e la dinamica delle cellule endoteliali del cervello, sia in presenza che in abseNce di uno stressore. Noi quindi il siero e il supplemento affamano i BEC per ridurre l&#39;effetto confondente dell&#39;attivazione residua di percorsi cellulari di segnalazione. Da notare, le cellule sono brevemente (5 min) esposte a FBS durante la neutralizzazione delle cellule trypsinizzate prima del dosaggio. In contrasto con i BEC, le pericie e gli astrociti non sono affamati dal siero, a causa del fabbisogno di diversi fattori di crescita e della relativa instabilità di questi tipi di cellule in risposta alla fame di siero (laboratorio Tai, osservazioni inedite). NOTA: il basale EBM-2 è utilizzato durante il saggio per la formazione di singoli e triplici colture a maglia e le prove di interruzione. Questo è fondamentale per prevenire la confusione di stress o di trattamento che dipendono dal segnale. </li></ol> 2. Analisi di formattazione e di rottura di maglia <ol><li> Saggi di coltura singola BEC: NOTA: tre diversi paradigmi per le singole culture di BEC sono mostrati in Figura 1A </strong&gt;. Ogni paradigma è stato progettato per valutare la risposta dei BEC in diversi modelli di copertura delle vasche. Il paradigma 1 è la formazione di meshwork. Questo paradigma è stato progettato per esaminare gli effetti di stress e / o trattamenti su angiogenesi e formazione di meshwork. BECs, oAβ e trattamenti sono tutti aggiunti alla piastra al punto 0 h. Il paradigma 2 è la prevenzione della rottura del lavoro di rete. Le cellule vengono placcate in presenza di un fattore di crescita o di un farmaco e incubate per 4 ore per formare strutture simili a maglie reticolate. Uno stressor, oAβ in questo caso, viene aggiunto dopo 4 h. Questo paradigma valuta la capacità di un trattamento per prevenire danni causati da stress causati da strutture preformate. Il paradigma 3 è il trattamento simultaneo della rottura del meshwork. Le cellule sono placcate e consentite di formare strutture di tipo reticolo per 4 ore. I trattamenti e l&#39;oAβ vengono poi aggiunti contemporaneamente al punto di 4 h, valutando la capacità della rete cellulare preformata di rispondere a vari trattamenti. Tutti i paradigmi perSimili passi comuni, ad eccezione delle differenze nel tempo di aggiunta del trattamento. <ol><li> Al giorno del dosaggio, pipettare la matrice della membrana basale a 10 μL / pozzetto nel fondo delle piastre a 96 pozzetti e lasciare impostare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Sospendere il colorante liofilizzato di monitoraggio delle cellule verdi (vedere tabella dei materiali ) in 10 μL di DMSO per generare una soluzione di 10 mM stock e diluire a 10 μM (1: 1000) nel basale EBM-2. Rimuovere i supporti dal pallone completamente confluente e sostituirlo con basalto EBM-2 contenente il colorante verde di monitoraggio delle cellule (5 mL per un pallone da 75 cm 2 ). Preloadere BECs con il colorante verde di rilevamento delle cellule, 20 minuti prima dell&#39;inizio del dosaggio. </li><li> Incubare le cellule per 20-30 minuti a 37 ° C, rimuovere il mezzo con il colorante di monitoraggio delle cellule e staccare le cellule come descritto nel punto 1.1. Neutralizzare i supporti con EBM-2 contenente il 10% di FBS e centrifugare a 240 xg per 5 minuti a 4 ° C. Resuspendere il pellet in 1 mL di basale EBM-2. </li><li> Piattare i BEC nella piastra a 96 pozzetti a 10.000 cellule / pozzetto nel basale EBM-2 (punto 0 h in tutti i paradigmi). NOTA: A seconda del paradigma utilizzato, i trattamenti, gli stress oi controlli del veicolo vengono aggiunti nei punti di tempo specificati. In tutti i paradigmi, il mezzo viene raccolto per l&#39;analisi successiva ( es. Analisi ELISA) e le cellule vengono fissate a 24 h con paraformaldehide appena preparato al 4% in fosforo bufferato (PBS). Come approccio alternativo per determinare gli effetti di termine di oAβ sulla formazione di maglie, il protocollo potrebbe essere modificato per pre-incubare le fiasche di coltura confluente con oAβ e quindi eseguire i paradigmi di formazione di maglie (+/- oAβ). NOTA: Il volume finale in ogni pozzetto per tutti i paradigmi è 70 μL. Tutti i trattamenti (oAβ, EGF, ecc. ) Vengono aggiunti ai loro rispettivi pozzetti ad una diluizione 1:20, ovvero 3,5 μL per trattamento. Per il paradigma 1, le cellule vengono aggiunte in una soluzione di sospensione cellulare a 63 μL / well. Adesso vengono aggiunti oAβ, trattamenti e controlli desiderati a 3,5 μL / pozzetto ciascuno, dando un totale di 70 μL. Per il paradigma 2 vengono aggiunti 63 μL di sospensione cellulare e 3,5 μL di trattamento ( es. 100 ng / ml di EGF) al punto 0 h. Dopo 4 ore di incubazione, si aggiunge 3,5 μL di uno stock oAβ (per esempio per 100 nM di concentrazione finale oAβ, 3,5 μL di 2 μM di stock oAβ). Per il paradigma 3 si aggiunge 63 μL di sospensione cellulare al punto 0 h e a 4 h, oAβ e si aggiungono i trattamenti desiderati a 3,5 μL / pozzetto ciascuno, dando un totale di 70 μL. Questi volumi possono essere regolati secondo i trattamenti. Ad esempio, se è richiesto un solo trattamento, il volume della sospensione cellulare può essere regolato a 66,5 μL (mantenendo 10.000 cellule / pozzetto) e il volume di trattamento può rimanere a 3,5 μL. </li></ol></li><li> Saggio di cultura tripla: NOTA: Oltre ai test di coltura singola di BEC, abbiamo sviluppato( Figura 1B ) per determinare la risposta di BECs, periciti e astrociti all&#39;interno di reti preformate a fattori di pertinenza rilevanti ( es. OAβ). I BEC vengono placcati in presenza di trattamenti desiderati a 0 h. A 4 h, periciti vengono aggiunti dolcemente alla lastra. A 7 h, gli astrociti vengono aggiunti alla piastra, seguita dall&#39;aggiunta di uno stressore a 11 h. Le cellule vengono quindi incubate fino al punto di 24 ore. NOTA: Per i saggi di cultura tripla, è importante considerare i tempi per garantire che tutte le cellule siano confluenti allo stesso tempo. Gli astrociti umani e le pericelle devono essere coltivate 1 settimana prima del dosaggio, mentre le cellule hCMEC / D3 devono essere placcate o passate 4-5 giorni prima della data del dosaggio. Inoltre, è importante utilizzare celle primarie a basso passaggio (2-5) per evitare deriva fenotipica. <ol><li> Aggiungere la soluzione di lavoro per la tintura della cella a verde alle cellule hCMEC / D3 20 minuti prima di iniziare il test. Piattare le cellule hCMEC / D3 a 10, 000 cellule / pozzetto in EBM-2 basale (0 ora di ora). I volumi usati sono 45 μL di sospensione cellulare e 3,5 μL di trattamento ( cioè concentrazioni di EGF finali di 50 ng / ml, 100 ng / ml, o 1000 ng / ml da scorte che sono 20 volte più concentrate). </li><li> Dopo l&#39;incubazione a 37 ° C di 3,5 h, aggiungere alla pericia primaria umana la soluzione di lavoro per la tintura dei cavi blu (azoto blu di 10 μM nel basale EBM-2). Al punto di tempo di 4 h (~ 30 min di incubazione con il colorante di monitoraggio delle cellule) aggiungere delicatamente 2&#39;000 periciti / pozzetto alla piastra contenente hCMEC / D3 in un volume di 6 μL / pozzetto. </li><li> Dopo un&#39;ulteriore 2,5 ore di incubazione (totale 6,5 h da 0 ora di ora), aggiungere gli astrociti primari umani alla soluzione di lavoro per la tintura della cellula arancione (10 μM tracker cellulare arancione in basale EBM-2). Al punto di 7 h aggiungete delicatamente 10.000 astrociti / pozzetto alla lastra in 12 μL di volume. Pertanto, il rapporto cellulare complessivo per le cellule endoteliali: periciti: astrociti iS 5: 1: 5. Inoltre, il volume raggiunto a questo punto è di 66,5 μL. </li><li> Aggiungere oAβ (3,5 μL di stock di 100 μM) 4 h più tardi (11 ore totali da 0 ora). </li><li> Fissare le cellule 13 h più tardi in paraformaldeide al 4% in PBS. Attenzione: indossare indumenti protettivi, guanti e occhiali durante la manipolazione di paraformaldeide. </li></ol></li></ol> 3. Quantificazione <ol><li> Cattura immagini di fluorescenza dell&#39;intero pozzetto della piastra a 96 pozzetti ad ingrandimento 1,6X con un tempo di esposizione a 2 s al 50% di potenza massima utilizzando un microscopio di dissezione. NOTA: possono essere utilizzati microscopi equivalenti; Tuttavia, è fondamentale catturare l&#39;intero pozzo per un&#39;analisi completa. </li><li> Per l&#39;analisi quantitativa, elaborare le immagini usando il plugin 22 dell&#39;analizzatore di angiogenesis ImageJ per quantificare il numero di rami, il numero di maglie e la lunghezza totale della cella (questi letture vengono automaticamente tabulati dalla softwaRi) come descritto di seguito. Un protocollo visivo dettagliato di questo passaggio è fornito in Figura 2 . <ol><li> Apri fiji ImageJ cliccando sull&#39;icona del software. </li><li> Clicca sulle doppie frecce rosse in avanti alla fine della barra degli strumenti, quindi fai clic su &quot;Angiogenesis Analyzer&quot;. </li><li> Seleziona la cartella con i file di immagine, fai clic su &quot;Apri&quot;. </li><li> Quando viene visualizzata la casella &quot;impostazioni per l&#39;analisi&quot;, fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Quando viene visualizzata la casella &quot;elaborazione immagini&quot;, che indica il numero di immagini da elaborare, fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Quando viene visualizzata la casella &quot;finestra di avanzamento batch&quot;, che indica il tempo di elaborazione stimato. Durante questo periodo il programma quantifica le uscite tra cui il numero di rami, il numero di maglie e la lunghezza totale della cella. NOTA: Una volta che tutte le immagini vengono quantificate, il file dei risultati verrà visualizzato nella cartella dell&#39;immagine originale come un documento di foglio di calcolo. </li><li> SelezionareIl foglio di foglio di calcolo che contiene i risultati e confronta il numero di rami, maglie e lunghezza totale delle celle tra i gruppi. NOTA: Nel saggio di coltura triplo ImageJ viene ulteriormente utilizzato per analizzare la copertura e il numero di pericite / astrociti. Le immagini sono soggette a un esperimento acustico e la funzione &quot;analisi delle particelle&quot; utilizzata per generare letture. Le cellule fisse e le strutture tubolari possono anche essere immagazzinate per Aβ 17 o altri marcatori. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

I metodi descritti possono essere utilizzati per affrontare diverse questioni biologiche fondamentali che riguardano la copertura cerebrovascolare24. In particolare, essi possono identificare quali recettori e vie di segnalazione svolgono un ruolo in angiogenesi, la copertura dei recipienti nei tessuti del cancro e cellule endoteliali periferiche rilevanti per il cervello. Gli esempi includono i recettori del fattore di crescita angiogenico, l&#39;ossido nitrico, la mitogen attivata dalla proteina chinasi e la segnalazione di calcio 25 , 26 , 27 . Gli hCMEC / D3 ei BEC primari sono modificabili agli approcci genetici di abbandono per facilitare questo sforzo 18 . L&#39;intuizione meccanica può essere ottenuta dalla coltura di BEC isolati da topi con completa o endoteliale specifiche delle cellule specifiche di proteine ​​chiave con i metodi descritti. Inoltre, i test a tre colture consentono un&#39;analisi approfondita dell&#39;influenza astrocitica e pericicaE sulla funzione delle cellule endoteliali del cervello. Ad esempio, le pericie e gli astrociti possono influenzare la formazione di nidiformi come la formazione di mediatori solubili ( ad es. Angiopoietina, citochine) e anche attraverso il supporto strutturale 24 . Il sistema modello può essere applicato anche alla ricerca delle malattie. Ad esempio, il sistema può affrontare se gli stressi relativi alla malattia e all&#39;invecchiamento aggiungono esogeniamente l&#39;angiogenesi e / o la rottura del lavoro di rete. Gli stress possono essere rilevanti per un disturbo specifico, ad esempio oAβ, o più generalizzato, ad esempio perossido di idrogeno, citochine. Il paradigma della cultura tripla aggiunge un ulteriore livello di complessità che può migliorare la comprensione di meccanismi critici e rilevanti per la malattia che influenzano la dinamica di BBB: delineare se gli stressi relativi alla malattia attivino astrociti e periciti per disturbare la funzione BEC. Per i coltura singola e tripla coltura, le cellule primarie possono essere isolate da froM modelli di mouse che imitano disordini di interesse per delineare ulteriormente gli effetti funzionali. Ci sono una serie di considerazioni importanti per l&#39;adattamento dei test di formazione e di interruzione di tipo meshwork a tipi diversi di cellule. La prima è la densità di semina. Per ogni nuova linea cellulare, un primo passo critico sta ottimizzando la densità di semina nella matrice della membrana basale sia per i singoli che per i tripli di coltura. La formazione di maglie è dipendente dal numero di cellule, poiché sia ​​troppo elevata che troppo bassa la densità delle cellule provoca una mancanza di formazione di maglie. Inoltre, anche per i metodi e le celle qui descritte, è prudente effettuare confronti di densità cellulare per tenere conto di eventuali variazioni di laboratorio nell&#39;elaborazione delle cellule prima di condurre esperimenti su larga scala. La seconda considerazione è la sequenza temporale della formazione di maglie. Devono essere condotti esperimenti del corso di tempo per identificare quando si formano e degradano strutture di tipo &quot;meshwork&quot;. Tipicamente un robusto mesh-lLa formazione ike viene osservata a ~ 4 h. La terza considerazione è la scelta del mezzo prima della semina e durante l&#39;esperimento. BECs, periciti e astrociti vengono coltivati ​​in mezzo che contiene FBS e una pletora di fattori di crescita ottimizzati per la crescita cellulare. Anche se è preferibile affinchè il fattore di siero e di crescita affligge i BEC 24 h prima dell&#39;esperimento, per alcuni tipi di cellule questo non può essere fattibile. Ad esempio, le cellule primarie con reclami specifici del recettore potrebbero richiedere fattori aggiuntivi per facilitare la crescita. Queste considerazioni si applicano anche durante l&#39;esperimento e la scelta del mezzo dipende dalla specifica domanda in esame. Tuttavia, quando si esamina il ruolo di fattori di stress esogeni e di potenziali trattamenti, in particolare fattori di crescita o composti connessi, l&#39;utilizzo di mezzi serici e di fattore di crescita durante l&#39;esperimento è l&#39;ideale. Inoltre, può essere possibile ridurre la lunghezza della fame di siero dei BEC, ma ciò dipende dal sig.In corso di indagine. Una quarta considerazione è la tempistica di aggiungere stress o trattamenti. Per quanto riguarda la scelta del trattamento medico, i tempi si basano sulla questione scientifica. Il test di formazione di maglie è più analogo all&#39;angiogenesi, mentre il test di interruzione del magnesio può essere più rilevante per un BBB maturo. Nella nostra esperienza, una volta stabilita, i dosaggi producono dati coerenti tra esperimenti. I problemi di coerenza sono spesso dovuti a discrepanze di densità di sopravvivenza tra il personale e, soprattutto, se i componenti del reagente medio o rilevante sono alterati inconsapevolmente. Ci sono limitazioni e aree di ulteriore sviluppo dei metodi descritti. Una forza di questa procedura è che basse concentrazioni di stressore ( ossia oAβ) possono essere utilizzate per indurre la rottura di maglie, cioè nM rispetto a μM, che sono più fisiologicamente rilevanti. Tuttavia, questa forza può anche essere una limitazione. Infatti, più in alto, bNon ancora tossiche, possono essere necessarie concentrazioni di oAβ per scopi di screening dei farmaci per aumentare la sensibilità, che si applicherà ad altri fattori di rischio per le malattie. Una limitazione del metodo è che il lavoro a maglie delle cellule è stabile solo per 24 ore nei protocolli descritti. Infatti, dopo 24 ore, le cellule delle cellule iniziano a degenerarsi. Pertanto aggiungiamo oAβ dopo un tempo relativamente breve (4 h) dopo la formazione di maglie, per consentire un tempo totale di incubazione di oAβ di 18 h. Forse le densità di sementi inferiori delle cellule potrebbero consentire protocolli di trattamento più lunghi. Un&#39;ulteriore limitazione potenziale è che il sistema in vitro non può imitare un funzionamento a maglie stabili di cellule come sarebbe stato osservato in vivo . L&#39;isolamento delle cellule da topi invecchiati può simulare più da vicino lo scenario in vivo .

<html> La barriera emato-cerebrale (BBB) ​​dei capillari cerebrali è la più grande interfaccia del contatto ematico-to-cerebrale e svolge un ruolo centrale nell&#39;omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS) 1 , 2 . I processi dinamici del BBB impediscono l&#39;assorbimento di molecole indesiderate dal sangue, rimuovono i prodotti di scarto dal CNS, forniscono nutrienti essenziali e molecole di segnalazione al CNS e modulano la neuroinflammazione 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Il danno di BBB è prevalente durante l&#39;invecchiamento e diversi disturbi neurodegenerativi tra cui la malattia di Alzheimer (AD), la sclerosi multipla e l&#39;ictus 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Pertanto, la disfunzione di BBB può svolgere un ruolo chiave nei disturbi neurodegenerativi, anche come obiettivo terapeutico. Il mantenimento della copertura dei recipienti è importante per le funzioni homeostatiche del BBB. Tuttavia, i dati in vivo e in vitro confligano sul fatto che i processi coinvolti nei disturbi neurodegenerativi causino una copertura BBB maggiore o minore 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , particolarmente in AD. Pertanto, vi è una forte logica per lo sviluppo di modelli in vitro utilizzando tipi di cellule per valutare e comprendere in modo più completo le dinamiche della copertura BBB. I capillari cerebrali sono composti da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs) <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Tutti i tipi di cellule contribuiscono alla funzione del BBB attraverso il supporto strutturale e attraverso la secrezione di molecole effector come fattori di crescita angiogenici, citochine e chemiokine che agiscono in modo paracrino e autocrino. Tuttavia, le principali cellule efficaci del BBB sono BECs 3 . In generale, le tecniche di coltura cellulare per la valutazione della funzione BBB sono i test di permeabilità eseguiti su cellule coltivate su inserti di filtri o valutando i livelli di proteine ​​chiave BEC, sia dopo l&#39;aggiunta di stress 14 , 15 , 16 . Sebbene importanti, questi dosaggi non riguardano la copertura cerebrovascolare. Qui, i nostri precedenti metodi 17 sono dettagliati per valutare la copertura BEC e le strutture di tipo reticolo utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e una cultura tripla umanizzataModello (BEC, astrociti e periciti) del BBB. L&#39;obiettivo era dimostrare l&#39;effetto dannoso di oAβ, che è considerato un importante contributore alla progressione dell&#39;AD, sulla copertura BEC. L&#39;effetto protettivo del fattore di crescita epidermico (EGF) evidenzia il potenziale della tecnica come strumento di screening terapeutico. La tecnica presenta diverse applicazioni per la ricerca di base e applicata, tra cui: 1) definire il ruolo di percorsi specifici in materia di angiogenesi e copertura dei vasi, 2) valutare gli effetti delle malattie e dei fattori rilevanti sull&#39;invecchiamento sull&#39;angiogenesi e sulla vasca e 3) individuare le attività farmacologiche obiettivi.

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 cells</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 basal media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Ascorbic acid</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Gentamycin sulphate</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% Hydrocortisone</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin hydrochloride</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papain cell dissociation system (papain and DNase1)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Human pericytes</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte basal media</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Human Astrocytes</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte media</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesis m-plates (96-well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal growth factor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker green</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker blue</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube strips</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption

La copertura del sangue-cervello (BBB) ​​svolge un ruolo centrale nell&#39;omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS). Il BBB è mantenuto dinamicamente da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs). Qui metodi dettagliati per valutare la copertura BBB utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e un modello di coltura triplicata umanizzata (BECs, astrociti e periciti) del BBB. Per evidenziare l&#39;applicabilità dei dosaggi agli stati di malattia, descriviamo l&#39;effetto dell&#39;amyloid oligomerico (oAβ), che rappresenta un importante contributo alla progressione della malattia di Alzheimer (AD), sulla copertura BBB. Inoltre, utilizziamo il fattore di crescita epidermico (EGF) per illuminare il potenziale di screening delle droghe delle tecniche. I nostri risultati mostrano che singole e triple coltivate BECs formano strutture a maglia in condizioni basali e che oAβ interferisce con questa formazione di mesh e degenerizza le strutture preformate di maglie,Ma EGF blocca questa rottura. Quindi le tecniche descritte sono importanti per la dissezione di processi fondamentali e rilevanti per la malattia che modulano la copertura BBB.

In singole colture, entrambe le cellule hCMEC / D3 ( Figura 3A ) e il BEC primario del mouse ( Figura 3B ) formano strutture a maglie simili a tutto il pozzo. Le strutture sono caratterizzate da un reticolo di nodi interconnessi ( Figura 3 ). In tutti i paradigmi descritti ( Figura 1 ), le strutture simili a maglie reticolari sono simili dopo 24 ore nei gruppi di controllo, formando ~ 20 strutture a maglia con una lunghezza totale cellulare di ~ 10.000 pixel. Per evidenziare l&#39;applicabilità dei metodi a fattori correlati alle malattie, l&#39;oAβ è stato aggiunto alla hCMEC / D3 e ai primari BECs del mouse in due paradigmi. Nella disgregazione della formazione di maglie a cellule (Paradigma 1), l&#39;oAβ e le cellule vengono placcate contemporaneamente. Nella rottura del reticolo preformato (Paradigma 2), l&#39;oAβ è aggiuntoEd 4 h dopo la placcatura delle cellule (vedi Figura 1A ). L&#39;oAβ a 100 nM induce una disgregazione della formazione e della degenerazione del reticolo di maglia ( Figura 3A , 3B ). Ad esempio, utilizzando le cellule hCMEC / D3 in entrambi i paradigmi, la quantificazione della copertura totale della cellula / lunghezza è inferiore del 16-20% con 100 nM oAβ 17 . Inoltre, il numero di maglie è ridotto del 40% con 100 nM oAβ in entrambi i paradigmi 17 . Pertanto, un fattore di pertinenza della malattia induce un effetto dannoso simile sulla copertura umana e sui topi BEC. Un vantaggio fondamentale del sistema di coltura cellulare è la capacità di identificare fattori o trattamenti che prevengono danni rilevanti per la malattia, che possono quindi passare ai test in vivo . Come prova del principio sperimentale, gli effetti dei principali fattori di crescita angiogenici sulla prevenzione della cha indotta da oAβSono stati valutati i dati relativi alla copertura delle navi 17 . Il FEG ha impedito danni indotti da oAβ alle cellule hCMEC / D3. Sulla base di questi dati, EGF è stato testato in un paradigma di prevenzione utilizzando un modello di topi transgenici che ricapitola gli aspetti critici della patologia AD-like. Il trattamento con EGF ha impedito i deficit cognitivi e BBB, compresa la degenerazione dei vasi 23 . Questi dati supportano il potenziale predittivo del sistema in vitro per l&#39; attività in vivo . Attualmente, utilizziamo tutti e tre i paradigmi sviluppati per lo screening: 1) formazione di maglie, 2) prevenzione della rottura del tessuto cellulare e 3) trattamento simultaneo della rottura di maglie. Come evidenziato nella figura 3 , EGF può proteggere dai danni indotti da oAβ in colture immortali e primarie di topo BEC. Il BBB è costituito da BEC, periciti e astrociti che contribuiscono collettivamente al cerebrovasc complessivoCopertura ular. Pertanto, un adattamento del sistema in vitro è l&#39;incorporazione di tutti e tre i tipi di cellule BBB. Il nostro paradigma di dosaggio della coltura tripla comprende le cellule hCMEC / D3, le pericie umane primarie e gli astrociti umani primari, che vengono aggiunti sequenzialmente alla matrice della membrana basale ( Figura 1B ). Nel paradigma del saggio di coltura tripolare, le cellule hCMEC / D3 formano un reticolo simile a quello delle singole colture, ma con le pericie e gli astrociti attaccati ai nodi e ai rami di connessione ( Figura 4 ). L&#39;aggiunta di 100 nM oAβ induce la disfunzione di rete (~ 10-15%) e una riduzione del numero di periciti che contattano i BEC 17 . In correlazione con i dati derivati ​​dai paradigmi di analisi della coltura singola, il danno indotto da oAβ è impedito dal trattamento EGF. Pertanto, il modello BBB tripla coltura è adatto per gli studi incentrati sugli effetti interattivi degli astrociti, periciE BEC sulle dinamiche dei recipienti. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55846/55846fig1.jpg" /> Figura 1: Panoramica dei test di formazione di meshwork e di interruzione. ( A ) I paradigmi di analisi della coltura singola. Paradigma 1, formazione di maglie. Le cellule, gli stress e i trattamenti sono tutti aggiunti alla lastra al punto di 0 h. Paradigma 2, prevenzione della rottura del lavoro di rete. Le cellule vengono placcate in presenza di trattamenti desiderati, incubati per 4 h e uno stressor viene aggiunto al punto di 4 h. Paradigma 3, trattamento simultaneo della rottura del meshwork. Le cellule sono placcate e consentite di formare strutture simili a maglia per 4 ore prima che i trattamenti e / o gli stressori siano aggiunti contemporaneamente al punto di 4 h. Tutti i paradigmi terminano al punto di 24 h, e le cellule sono fissate con 4% di paraformaldeide. ( B ) Paradigma del saggio di coltura tripla. BECs (10.000 cellule / pozzetto) sono placcati nel presDi trattamenti desiderati a 0 h. Al punto di 4 h le pericelle (2.000 cellule / pozzetto) vengono aggiunte delicatamente alla piastra. A 7 ore astrociti (10.000 cellule / pozzetto) vengono aggiunti alla piastra, seguita dall&#39;aggiunta di stressori pertinenti a 11 h. Le cellule vengono quindi incubate fino al punto di 24 h e fissate con 4% di paraformaldeide. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55846/55846fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55846/55846fig2.jpg" /> Figura 2: Analisi quantitativa. Tutte le immagini vengono aperte in Fiji ImageJ e elaborate in batch utilizzando l&#39;Analizzatore Angiogenesis 22 . Sono utilizzati quantificazione della lunghezza totale e del numero di maglie. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55846/55846fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di t</a>La sua figura. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55846/55846fig3.jpg" /> Figura 3: Analisi di disfunzione di maglie: immagini rappresentative. Tutte le immagini sono ricavate da esperimenti che utilizzano Paradigm 2, interruzione di meshwork. ( A ) Immagini rappresentative delle cellule hCMEC / D3 placcate e trattate con controllo del veicolo (VC), EGF (100 nM), oAβ (100 nM) o oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Immagini a ingrandimento 10X, barra di scala = 100 μm. ( B ) Immagini rappresentative del mouse primario BEC placcate e trattate con VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) o oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Immagini a ingrandimento 10X, verde = BECs, barra di scala = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55846/55846fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Figura 4. Test di coltura tripla: immagini rappresentative. ( A ) Le immagini rappresentative delle cellule hCMEC / D3, periciti primarie umane e astrociti umani primari placcati e trattati con VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) o oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) Secondo il paradigma descritto nella Figura 1B . Immagini a 10x ingrandimento, verde = BECs, blu = pericytes, e rosso (pseudocolore) = astrociti. Barra di scala = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55846/55846fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l&#39;omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue.

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

8.4K Views.  University of Illinois at Chicago.  Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l'omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue. 

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Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

Fornitura di payload predicting In Vivo utilizzando una tumore-barriera emato-encefalica in un piatto

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioingegneria

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicina

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Immunologia e infezioni

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Neuroscienze

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Un modello 3D di barriera emato-encefalica derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Autore in primo piano: Un approccio personalizzato verso lo studio della malattia di Alzheimer utilizzando un modello di barriera emato-encefalica in vitro 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Fornitura di payload predicting In Vivo utilizzando una tumore-barriera emato-encefalica in un piatto

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Istituzione di un

Un

L'analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica