This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Colture Cellulari del cervello umano cellule endoteliali microvascolari (HBMEC) <ol><li> Rivestimento di fiaschi di coltura cellulare <ol><li> Per preparare la soluzione di fibronectina, aggiungere 10 ml di PBS in una provetta da centrifuga 15. Aggiungere 150 microlitri fibronectina e mescolare bene. </li><li> Per coprire il fondo un pallone di coltura di cellule T-25 aggiungere 2 mL della soluzione fibronectina. Incubare la beuta di coltura cellulare per almeno 3 ore a 37 ° C in incubatore. Rivestito fibronectina flaconi possono essere conservati per 2 settimane a 37 ° C / 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Semina e coltura cellulare di HBMEC <ol><li> soluzione fibronectina Aspirare dal fondo del pallone di coltura cellulare. Aggiungere 7,2 x 10 4 HBMEC / cm sospesi in 6 mL ECM-b medie (= ECM-b integrato con 5% di siero fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina, e 1% supplemento di crescita delle cellule endoteliali). Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2. Controllare la crescita delle cellule al giorno utilizzando un microscopio. </li><li> Cambiare la media ogni 3 giorni.Raccogliere o cellule dividere, quando HBMEC raggiungere circa il 80% di confluenza. HBMEC deve essere utilizzato tra passaggio 1 e 15 per evitare la perdita delle proprietà fisiologiche. </li></ol></li><li> Harvest HBMEC. <ol><li> Preparare accutase soluzione miscelando accutase (1x) con PBS a un rapporto di 1: 1. Mantenere accutase soluzione a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua fino ad ulteriore utilizzo. </li><li> Trasferimento ECM-b mezzo dal pallone di coltura di cellule in una provetta da centrifuga 15. Lavare HBMEC aggiungendo 5 ml di PBS al fondo del pallone di coltura cellulare. Aspirare PBS e ripetere la fase di lavaggio altre due volte. </li><li> Aggiungere 2 ml di soluzione pre-riscaldato accutase. Incubare a 37 ° C per 2 min. Successivamente, HBMEC vengono risospese saldamente toccando il pallone di coltura cellulare più volte. Cellule distacco è controllato tramite un microscopio </li><li> L&#39;ECM-b-medio precedentemente memorizzato in una provetta da 15 mL viene aggiunto nuovamente al pallone di coltura cellulare non appena HBMEC inizia a staccarsi. Risciacquare il fondo del pallone volte fino a più HBMEC sonoRISOSPESO. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 15. Centrifugare a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml ECM-b medie. Contare le cellule e diluire la sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di 3 x 10 5 HBMEC per mL ECM-b medie. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del Colture cellulari Inserti <ol><li> Rivestimento di inserti colture cellulari Nota importante: Evitare di toccare la membrana degli inserti colture cellulari. <ol><li> Aggiungere 100 microlitri soluzione fibronectina (vedi 1.1.1) per ciascun inserto di coltura cellulare (Figura 1A) e un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto (controllo ottico bene). Incubare per almeno 3 ore a 37 ° C. Dopo soluzione di incubazione aspirare fibronectina. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di sospensione HBMEC agli inserti di coltura cellulare e il controllo ottico bene. Aggiungere 600 microlitri ECM-b mezzo al compartimento inferiore della cellainserti coltura. Incubare per 3 - 4 giorni a 37 ° C / 5% di CO 2 fino integrità della barriera (Figura 1B) viene raggiunto, controllare la crescita cellulare mediante valutazione microscopica del HBMEC nel controllo ottico bene. Nota: non è consigliabile la crescita delle cellule al di là di quattro giorni. </li><li> Opzionale: Per simulare condizioni infiammatorie aspirare il terreno dal compartimento inferiore e sostituirla con ECM-b mezzo integrato con 500 U / ml di IFN-γ / TNF-α 24 h prima del saggio di migrazione. </li></ol></li></ol> 3. Controllo di qualità con Evans Blue nel Giorno del saggio Trasmigrazione <ol><li> Preparazione della soluzione di blu Evans <ol><li> Per preparare PBS / B27 soluzione della miscela 10 mL PBS con supplemento B27 200 microlitri utilizzando una provetta da centrifuga 15. Diluire soluzione madre blu Evans (20 mg / ml di PBS) 1: 1000 con PBS / B27. </li></ol></li><li> Evans saggio di permeabilità blu <ol><li> Aspirare il terreno dal vano inferiore, seguita da vano superioredi un inserto di coltura cellulare contenente un confluenti HBMEC monostrato. Aggiungere 100 ml di Evans soluzione blu per l&#39;inserto coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 600 microlitri di PBS / B27 al vano inferiore e incubare per 60 min a 37 ° C / 5% di CO 2. Rimuovere con attenzione l&#39;inserto di coltura cellulare con pinze. </li></ol></li><li> misurazione blu Evans <ol><li> Rimuovere PBS / B27 dal compartimento inferiore e trasferire 100 microlitri ciascuno a due pozzetti di una polistirolo nero 96 pozzetti a fondo piatto. Inserire piatto in un lettore di piastre Tecan Pro Infinite M200 e determinare z-posizione ottimale. </li><li> Misura eccitazione di Evans blue utilizzando rispettive impostazioni (ad esempio: eccitazione: 620 nm, emissione: 680 nm, banda di eccitazione: 9 nm, emissione di banda: 20 nm, valorizzazione 175x, 25 lampeggia, tempo di integrazione: 20 ms). </li><li> Per determinare funzioni di barriera HBMEC confronta le acquisiti dati con una curva standard raffigurante Evans blu permeazione attraverso HBMEC a tempi diversi dopo semecellule ing (Figura 1B, destra). </li></ol></li></ol> 4. Migrazione Assay <ol><li> Preparazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). <ol><li> Aggiungere 10 ml RPMI in una provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere 200 microlitri B27 supplemento. Contare le cellule PBMC e centrifugare a 300 xg per 5 min. Risospendere PBMC ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule / ml RPMI / B27. </li></ol></li><li> Set-up del test di migrazione <ol><li> Aspirare mezzo dal compartimento inferiore, seguita da scompartimento superiore di inserti colture cellulari contenenti confluenti HBMEC monostrati (Figura 1A). Per donatore aggiungere 100 microlitri di sospensione PBMC ciascun agli inserti coltura cellulare ed anche ad un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti a (controllo in vitro). </li><li> Aggiungere 600 microlitri RPMI / B27 al vano inferiore degli inserti colture cellulari e 500 microlitri al PBMC del controllo in vitro e incubare 6 ore a 37 ° C / 5% di CO 2. </li&gt; </ol></li><li> La raccolta delle migrata PBMC <ol><li> Estrarre l&#39;inserto coltura cellulare utilizzando una pinza e risciacquare con cura il fondo con 400 microlitri di PBS senza toccare la membrana. Scartare dell&#39;inserto coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 20 ml fluorosfere conteggio del flusso (circa 1.000 perline / mL) al vano inferiore della coltura cellulare inserire nonché al controllo in vitro e mescolare bene. Trasferire 1 ml di sospensione risultante PBMC di citometria a flusso tubi. </li></ol></li></ol> 5. Citometria a Flusso <ol><li> preparazione del campione <ol><li> Centrifuga PBMC a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo aggiungendo anticorpi fluorocromo coniugato a 100 microlitri citometria a flusso tampone (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) per campione. Per i risultati presentati di seguito 1 ml CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 ml CD56-PC7, 1 ml CD8-A700, e 1 ml CD16-A750 sono stati utilizzati per campione. </li><li> Risospendere PBMC in 100 microlitri della soluzione di anticorpi e incubare per 30 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di citometria a flusso di buffer e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li></ol></li><li> acquisizione del campione <ol><li> Risospendere PBMC nella quantità richiesta (variabile a seconda del citometro a flusso utilizzato) della citometria a flusso tampone. </li><li> Acquisire macchiato PBMC usando un citometro a flusso con una sonda attiva tra 525 e 700 nm per rivelare fluorosfere conteggio flusso (eccitazione 488 nm, emissione 525 - 700 nm). (Le seguenti operazioni sono un esempio, se si utilizza un flusso Gallio citometro operato con software Kaluza G:. (1) Avviare il computer (2) Quando il sistema operativo è completamente caricato, avviare il citofluorimetro premendo il tasto &quot;citometro a pulsante&quot; . (3) Caricare il rispettivo protocollo di acquisizione premendo il tasto &quot;protocollo aperto&quot;. (4) Scegliere il protocollo richiesto e selezionare &quot;aperto&quot;. (5) Duplicate il protocollo per ogni campione cliccando con il dirittopulsante del mouse sul protocollo visibile nel carosello virtuale e un clic sinistro sul campo &quot;duplicato&quot;. (6) Etichettare ogni campione nella lista di campioni. (7) Trasferire i campioni alle posizioni indicate della giostra e avviare l&#39;acquisizione.) </li></ol></li><li> L&#39;analisi dei campioni <ol><li> Aprire il flusso risultante citometria dati utilizzando il relativo software. Determinare il numero di sottopopolazioni di interesse per trasmigrata PBMC così come le cellule in vitro da pozzetti di controllo e il flusso fluorosfere conteggio utilizzando il rispettivo software di analisi. (Un esempio della strategia di gating è dato nella parte risultati (Figura 1 C: Per analizzare la trasmigrazione di sottoinsiemi cellule NK, selezionare prima linfociti in un canale laterale scatter (SSC) rispetto a canale forward scatter plot (FSC) linfociti sono. poi visualizzati in una CD3 contro trama CD56 e CD56 + CD3 -. Le cellule NK sono selezionati per distinguere tra sottogruppi NK-cellule, le cellule NK vengono visualizzati inun CD56 contro CD16 e CD56 CD16 trama brillante dim / - così come CD56 CD16 dim + cellule NK vengono selezionate. Inoltre, fluorosfere conteggio flusso sono scelti da un terreno FSC rispetto SSC e successivamente visualizzato in una trama di un canale con emissione tra 525 e 700 nm in funzione del tempo per determinare il loro numero.) </li><li> Per calcolare il numero totale di cellule di ciascun campione, normalizzare il numero di cellule rilevata utilizzando fluorosfere conteggio flusso: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Determinare la percentuale di cellule migrate come rapporto tra cellule migrate totali e cellule totali nel controllo in vitro. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Qui vi presentiamo una tecnica per indagare la trasmigrazione dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica umana. In vitro analisi della migrazione dei linfociti al sistema nervoso centrale è importante per studiare i processi fondamentali di linfociti stravaso, potenziali alterazioni correlati alla malattia, e nuovi approcci terapeutici. Diverse modifiche del modello di barriera emato-encefalica sono possibili. Ad esempio, le cellule del compartimento superiore potrebbero essere analizzati per indagare la composizione della popolazione di cellule non migrate. Inoltre, il trattamento del monostrato HBMEC con IFN-γ e TNF-α 24 ore prima del test può essere utilizzato per simulare una barriera emato-encefalica infiammato per studiare l&#39;effetto di disturbi infiammatori SNC 21, 25. Analogamente, il trattamento di HBMEC o linfociti con altre sostanze permette investigare loro effetti sulla linfociti stravaso (es loroeffetto sulle molecole di adesione) 30, 31. Il coinvolgimento di alcune molecole di adesione può essere studiata utilizzando anticorpi bloccanti per integrine o loro ligandi 32. Inoltre, l&#39;apparato sperimentale qui presentata consente l&#39;analisi degli effetti chemiotattici da chemiochine o supernatanti derivati da astrociti o altre cellule 33, 34. Sostituzione di HBMEC con il cervello umano cellule epiteliali primarie derivate allarga lo spettro di questa configurazione sperimentale per indagine della barriera sangue fluido cerebrospinale-15. HBMEC non dovrebbe essere sostituito con cellule endoteliali immortalizzate o cellule derivate da altri organi per mantenere CNS specificità del modello. Tuttavia, le cellule endoteliali cerebrali derivate da altre specie potrebbero essere usati per analizzare trasmigrazione nei rispettivi animali 35. Inoltre, l&#39;acido retinoico o hydrocortisone sono stati descritti per aumentare le funzioni di barriera e potrebbe quindi essere impiegato 36, 37. In caso di numero di cellule limitato la quantità di cellule sottoposte al test può essere ridotta, perché il nostro modello prevede tassi di recupero lineare tra 2 x 10 5 e 1 x 10 6 PBMC (dati non mostrati). Per analizzare le popolazioni di cellule rare seguenti trasmigrazione potrebbe essere necessario cellule piscina da diversi pozzi per ottenere cellule sufficienti richieste per citometria a flusso. Infine, il nostro setup sperimentale potrebbe anche essere utilizzato per studiare il rilascio di farmaci nel SNC 38. Una dimensione dei pori di 3 um è tipicamente utilizzato per consentire linfociti trasmigrazione, mentre una dimensione dei pori di 0,4 um impedisce linfociti trasmigrazione, ma consente di studiare drug delivery 39, 40, 41, 42. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nonostante le varie applicazioni della configurazione sperimentale descritto qui, alcuni punti devono essere tenuti in considerazione per garantire risultati significativi. L&#39;integrità della membrana porosa, nonche la monostrato HBMEC è critica. Pertanto, è fondamentale per evitare danni fisici della membrana, per esempio con puntali. Aggiunta di liquidi o sospensione cellulare alla parte superiore dell&#39;inserto coltura cellulare deve essere effettuata senza contatto diretto. Goccioline potrebbero essere spazzati via al confine con l&#39;inserto di coltura cellulare. posizionamento orizzontale della punta della pipetta garantisce la protezione della membrana, quando la membrana viene sciacquato abluminale alla fine del saggio di migrazione. La qualità del monostrato HBMEC può essere analizzato mediante valutazione microscopica di confluenza nonché Blu di Evans permeazione come dimostrato per la valutazione della integrità della barriera ematoencefalica in esperimenti roditori 43. Centrifugazione HBMEC a forze inferiori g e l&#39;utilizzo dei primi passaggi (cioè </em&gt; 1 - 15) assicura la qualità e l&#39;uniformità del monostrato. Impedire la dissoluzione della membrana porosa, è importante rispettare la sequenza descritta di aspirazione e aggiunta del mezzo, quando si lavora con il monostrato HBMEC. Sebbene aderenza al protocollo qui descritto assicura risultati significativi e riproducibili, questa tecnica ha alcune limitazioni. Prima di tutto, in vivo la barriera emato-encefalica è formato da un numero di cellule che interagiscono in vari modi e rafforzare la funzione di barriera modificando la formazione di giunzioni strette 1. Pertanto, anche se questo modello barriera ematoencefalica è una buona approssimazione della situazione in vivo, aspetti importanti sono mancanti. Inoltre, linfociti stravaso nel sistema nervoso centrale attraverso la barriera emato-encefalica è un processo a più fasi. Mentre ogni singolo passo può essere indagato a parte, la tecnica qui presentata non fornisce informazioni sul chile processo di stravaso sotto l&#39;influenza di forze di taglio 2, 44, 45, 46. Infine, l&#39;analisi di cellule migrate da PBMC potrebbe essere difficile a seconda della frequenza delle cellule di interesse, perché di solito solo frequenze sola cifra di cellule trasmigrano. Pertanto, la separazione delle popolazioni di interesse prima del dosaggio o pool di cellule migrate in più inserti di coltura cellulare può essere necessario. Altri modelli per l&#39;analisi della migrazione dei leucociti nel sistema nervoso centrale coprono alcuni degli aspetti mancanti nel nostro modello. Co-coltura con astrociti, periciti, e / o neuroni vengono utilizzati per simulare la complessità della barriera emato-encefalica meglio 47. Modelli tra forze di taglio come DIV-BBB riflettono più le condizioni fisiologiche, pertanto, consentendo un&#39;analisi più sofisticata di linfociti diapedesi 48. </p&gt; In sintesi, vi presentiamo una tecnica facilmente accessibile per l&#39;indagine qualitativa e quantitativa di diapedesi dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica umana.

migrazione dei linfociti dal sangue nei tessuti è cruciale per la sorveglianza immunitaria. Una sequenza di interazioni molecolari specifici assicura portale di stravaso specifico in piccolo intestino, pelle, linfonodi, il sistema nervoso centrale (SNC), e altri tessuti 1. Alterazioni nella migrazione dei linfociti sono coinvolti nella fisiopatologia di diverse malattie larghe diffusione 2. Migrazione nel CNS immuno-privilegiato è strettamente regolato e di conseguenza alterazioni di questo processo sono coinvolti nelle patologie del SNC sono collegati come encefalomielite 3, neuromielite ottica, ictus, e la sclerosi multipla (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Pertanto, è importante studiare linfociti stravaso di capire meglio la malattia fisiopatologia e di sviluppare strumenti per un<html> melioration di malattia onere 8, 9, 10, 11, 12. Linfociti migrano nel SNC tramite percorsi distinti. Stravaso attraverso venule postcapillari nello spazio subaracnoideo attraverso la barriera sangue fluido cerebrospinale all&#39;interno del plesso coroide e attraverso la barriera emato-encefalica sono stati descritti 1, 13, 14, 15. Migrazione attraverso la barriera ematoencefalica è condotta dall&#39;interazione di linfociti con cellule endoteliali 14. Contrariamente alle cellule endoteliali in periferia, cellule endoteliali del SNC esprimono elevate quantità di molecole di giunzione strette, così strettamente limitando la quantità di cellule e proteine ​​in grado di attraversare la barriera emato-encefalicalass = &quot;xref&quot;&gt; 16. l&#39;infiammazione in allentamento delle giunzioni strette e induce l&#39;espressione di molecole di adesione; quindi, aumentando la migrazione dei linfociti nel SNC 1, 17, 18. Lo stravaso attraverso la barriera emato-encefalica è un processo a più fasi. Linfociti cordicella per le cellule endoteliali e quindi rotolare lungo l&#39;endotelio in un processo principalmente mediato da selectine 1, 15. Successivamente, le interazioni tra chemochine secrete dall&#39;endotelio ed i rispettivi recettori per chemochine espressi sui linfociti inducono cambiamenti conformazionali di integrine, promuovendo così ferma adesione alle cellule endoteliali 1. Infine, linfociti sia strisciare lungo la barriera endoteliale contro il flusso di sangue prima trasmigranti nello spazio perivascolare, o stallo immediatamente e direttamente trasmigrate al sito della ditta adesione 1, 19, 20. Tutte queste fasi di linfociti stravaso possono essere analizzate in vitro con tecniche distinti 21. Time-lapse microscopia video viene utilizzato per studiare il tethering iniziale e rotolamento 15. Saggi di adesione forniscono informazioni dettagliate su arresto ditta per endoteliali barriere 22. Saggi trasmigrazione come dimostrato qui consentono l&#39;analisi della trasmigrazione immuno-cella 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Utilizzando l&#39;umano in vitro di sangue modello encefalica, potremmo recentemente dimostrare che una più alta migrcapacità Atory di CD56 CD16 luminoso dim / - cellule NK rispetto al loro CD56 dim CD16 + controparti è riflessa da una predominanza di questo sottogruppo di cellule NK nel vano intratecale 21. Così, il nostro apparato sperimentale sembra essere adatto per simulare la situazione in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>without CaCl2 or MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin 1mg/mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 cell culture flask</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBMEC</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pelobiotech</td>
			<td>PB-H-6023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM-b</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth supplement</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>clear, 6.5mm diameter, 3.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50x concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200Pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black flat bottom plate</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>675086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Count Fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7547053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios 10-color flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza 1.5a</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300430</td>
			<td>clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-PC7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A21692</td>
			<td>clone N901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16-A750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66330</td>
			<td>clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300506</td>
			<td>clone RPA-T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-A700</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66332</td>
			<td>clone B9.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

Linfociti stravaso nel sistema nervoso centrale (CNS) è fondamentale per la sorveglianza immunitaria. alterazioni correlati alla malattia di linfociti stravaso possono provocare alterazioni fisiopatologiche nel SNC. Così, l&#39;indagine della migrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale è importante per capire le malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale e di sviluppare nuovi approcci di terapia. Qui vi presentiamo un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana per studiare linfociti stravaso. cellule endoteliali microvascolari cerebrali umano (HBMEC) sono confluently coltivate su un tereftalato di polietilene poroso Transwell inserire per imitare l&#39;endotelio della barriera emato-encefalica. funzione di barriera è convalidato dal zonula occludere immunoistochimica, transendoteliale resistenza elettrica (TEER) misurazioni così come l&#39;analisi di Evans blue permeazione. Questo modello permette di indagine della diapedesi delle sottopopolazioni linfocitarie rari come CD56 CD16 luminoso dim / - cellule NK. Furthermminerale, gli effetti di altre cellule, citochine e chemochine, alterazioni legati alla malattia e distinti regimi di trattamento sulla capacità migratoria dei linfociti può essere studiato. Infine, l&#39;impatto degli stimoli infiammatori oltre a diversi regimi di trattamento sulla barriera endoteliale possono essere analizzati.

Risultati rappresentativi mostrano trasmigrazione di cellule NK e sottoinsiemi di cellule T usando il sangue-cervello modello barriera umana (Figura 1A) sono mostrate. L&#39;integrità del monostrato HBMEC stato convalidato dalla colorazione della molecola giunzioni strette ZO-1, misurazioni transendoteliale resistenza elettrica (Teer), ed Evans blu permeazione (Figura 1B). Dopo 3 - 4 giorni cultura HBMEC espresso molecola giunzioni strette ZO-1 (Figura 1B, sinistra). Inoltre, HBMEC cresciuto in monostrati espongono resistenza transendoteliale elettrica (Figura 1B centrale) nonché ridotta permeazione Evans blue (Figura 1B, destra). Monostrati HBMEC sono stati usati per studiare la trasmigrazione delle cellule NK CD56 compreso brillante CD16 dim / - e CD56 dim CD16 + sottoinsiemi NK e delle cellule T, tra cui cellule come due ex CD4 + e CD8 + Tamples (Figura 1D + E, rispettivamente). La percentuale di cellule migrate è stata calcolata sulla base delle conte cellulari ottenute mediante citometria di flusso e normalizzati utilizzando fluorosfere conteggio flusso come controllo interno (Figura 1C). Il monostrato HBMEC è stata stimolata con IFN-γ e TNF-α 24h prima del test per simulare condizioni infiammatorie. stimolazione citochina comportato un aumento della migrazione di tutte le popolazioni linfocitarie analizzati. Questo potrebbe essere dovuto ad un aumento dell&#39;espressione di molecole di adesione compreso ICAM-1 (dati non mostrati). CD56 luminoso CD16 dim / - cellule NK esposte una capacità migratoria maggiore rispetto alla loro CD56 dim CD16 + NK attraverso sia non stimolate (10,88% vs 0,86%) e IFN-γγ / TNF-α stimolata (18,22% vs 2,94%) HBMEC (Figura 1D). Tuttavia, l&#39;aumento relativo di trasmigrazione come risultato di infiammazione era superiore per il CD56 dim CD16 + </sup&gt; sottoinsieme delle cellule NK (+ 342% rispetto al + 167% per CD56 CD16 luminoso dim / -). Questi risultati imitano le osservazioni in vivo che CD56 luminoso CD16 dim / - cellule NK sono arricchiti nel vano intratecale. Così, il modello di barriera emato-encefalica sembra essere adatto per analizzare i principi fondamentali della diapedesi immunitaria delle cellule di popolazioni di linfociti rari nel SNC 21. Infine, la capacità trasmigratori di CD4 e CD8 sottogruppi di cellule T è mostrato (Figura 1E). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55390/55390fig1.jpg" /> Figura 1: migrazione differenziale di sottoinsiemi cellule NK attraverso uninflamed e infiammate HBMEC monostrati. A. Una foto di inserti transwell (a sinistra) e illustrazione del setup sperimentale (a destra). B. Validazione delle funzioni di barriera HBMEC. Sinistra: colorazione immunoistochimica del mol giunzione strettoecule ZO-1 utilizzando il coniglio anti-umano ZO-1 (Abcam, 1: 200) e di capra anti-IgG di coniglio-Cy3 (1: 300) su HBMEC coltivate per 3 giorni. Centro: la resistenza elettrica transendoteliale (TEER) di HBMEC tra il giorno 2 e il giorno 4 di coltivazione. A destra: curva standard per evans permeazione blu per HBMEC con ( &quot;infiammato&quot;, rosso) o senza ( &quot;uninflamed&quot;, nero) stimolazione con 500 U / mL IFN-γ e TNF-α per 24 ore. saggi di trasmigrazione vengono eseguiti 72 - 96 ore dopo la semina del HBMEC (freccia nera). CE. PBMC derivate da 16 individui sani sono stati sottoposti a test di migrazione come descritto nella sezione del protocollo. 24 h prima del saggio, metà degli inserti coltura cellulare sono state stimolate con 500 IU / ml di IFN-γ e TNF-α. cellule trasmigrato state raccolte e analizzate mediante citometria di flusso. C. rappresentativi risultati per PBMC derivate dal controllo in vitro ben (in alto) e dopo la migrazione di tutti uninflamed HBMEC (in basso). NK cel<html> ls stati gated da linfociti totali come CD3 - cellule CD56 + e ulteriormente distinguere in CD56 CD16 luminoso dim / - ( &quot;CD56 luminoso &quot;) e CD56 dim CD16 + (&quot; CD56 dim&quot;) sottoinsiemi NK-cellule. fluorosfere conteggio del flusso ( &quot;perle&quot;) sono stati gated sulla base di FSC / SSC caratteristiche ed il loro numero è stato determinato in un FL3 rispetto al plot tempo. Calcoli esemplificativi per determinare la percentuale di cellule CD56 e CD56 luminoso dim NK migrati vengono visualizzati sulla destra. D. percentuale di cellule NK migrate nonché dim sottoinsiemi NK-cellule CD56 luminoso e CD56, e E. percentuale di cellule T CD4 + compresi migrate e CD8 + sottogruppi di cellule T seguenti trasmigrazione attraverso uninflamed (nero) o infiammata (rosso) HBMEC raffigurato come media ± SEM. P-valori sono stati calcolati in coppia studente t-test; ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K Views.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Isolamento linfociti T umani, la cultura e l&#39;analisi delle migrazioni In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Finger-stick Metodologia di campionamento del sangue per la determinazione di esercizio apoptosi indotta da linfociti

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Aderenza Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Sviluppo di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modello per studiare l&#39;interazione tra<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE con il suo recettore ad alta affinità FcεRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...