Leon Tai è finanziato da fondi d&#39;avvio di Chicago University of Illinois.

Tutti gli esperimenti seguono i protocolli del Comitato di istruzione e tutela degli animali istituzionali dell&#39;Università dell&#39;Illinois, Chicago. 1. Preparazione generale NOTA: La linea cerebrale endoteliale (hCMEC / D3) è una linea umana immortalizzata ampiamente caratterizzata dalla linea BEC 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Coltivare le cellule hCMEC / D3 sulle colonie di coltura tissutale rivestite con collagene tipo I (pelle di vitello, diluizione 1:20 di soluzione 0,1% in Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) contenente Ca 2+ e Mg 2+ ) nel basale Endothelial Growth Basal Medium (EBM-2) contenente 2-5% di siero fetale fetale (FBS), 10% acido ascorbico, 10% gentamicina solfato, 25% idrocortisone e 1/4 del volume totale degli integratori fattori di crescita forniti per 500 mL di supporti [ Vascolare endotelio gr(IGF-1) e fattore di crescita fibroblastica basale umano (bFGF), vedi tabella dei materiali ]. Il fattore di crescita (VEGF), il fattore di crescita epidermico (EGF) NOTA: il medium EBM-2 con FBS ei fattori di crescita è indicato come &quot;EBM-2 complete&quot;. EBM-2 senza FBS e integratori viene chiamato &quot;EBM-2 basal&quot;. A piena confluenza, le cellule hCMEC / D3 sono ~ 1 x 10 5 cellule / cm 2 . <ol><li> Passaggio delle cellule hCMEC / D3 in un rapporto di 1: 5 prima incubando con HBSS per 3 min senza Ca 2+ e Mg 2+ seguito dal distacco con 5 mL di trysina / EDTA (0,25%) per 5 min. Neutralizzare la tripsina usando EBM-2 completa (neutralizzazione 1: 1) e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C; Scartare il surnatante. Riposizionare il pellet in EBM-2 completo e ri-piastra a rapporto 1: 5. </li><li> Coltivare le pericie umane primarie e gli astrociti secondo il protocollo del fornitore [ Tabella dei Materiali ]. culturE le pericelle nel mezzo basico perlicente con supplemento di crescita FBS e pericita. </li><li> Coltivare gli astrociti umani nel terreno astrocitico contenente fattori di crescita astrocitico. Coltivare sia le pericie che gli astrociti in flaconi di coltura tissutale rivestiti con 3 ml di poli-L-lisina (PLL) per l&#39;adesione cellulare e utilizzare le cellule tra i passaggi 2 e 5. </li><li> Eutanizzare 7 topi e rimuovere gli steli del cervello e la cerebella con le pinze; Staccare i meningi con un accurato spostamento dei cervelli sulla garza. Tritare il tessuto cerebrale rimanente in un piatto di Petri in Medium Minimal Essential (MEM) con HEPES (5 mL per cervello) con una lama di rasoio sterile. Isolare i topi primari del BEC da topi di 2 mesi C57BL / 6J secondo il protocollo di riferimento 20 . </li><li> Trasferire il tessuto cerebrale macinato in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e incubare il tessuto in un papain (833,33 μL per cervello) e DNase (41,7 μL per cervello)Soluzione, in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C per 1 ora, per digerire il tessuto. </li><li> Tritare l&#39;omogenato in sequenza con aghi da 19 e 21, mescolare con un rapporto 1: 1 con una soluzione al 22% di Bovine Serum Albumin (BSA) e centrifugare a 1360 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Resuspendere il pellet risultante in 1 mL di EBM-2 e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C. Riposizionare nuovamente in 1 mL di EBM-2 completare e piastrare le cellule (1 mL / pozzetto) su piastre a 6 pozzetti rivestite con collagene (~ 1 cervello per pozzetto). </li><li> Sostituire il supporto 24 h più tardi con EBM-2 completo contenente 4 μg / mL puromicina cloridrato; Sostituire con EBM-2 completo dopo 2 giorni. I BEC primari sono coltivati ​​come per le cellule hCMEC / D3 e sono in piena confluenza a 1 x 10 5 cellule / cm 2 . </li><li> Preparare 100 μM di oAβ, 24 h prima del dosaggio. NOTA: l&#39;oAβ è considerata la forma di malattia di A. Per l&#39;oAβ, utilizzare le preparazioni ben caratterizzate descritte da DahlgreN et al. 21 . </li><li> Scongelare la soluzione di base della membrana basale a 4 ° C e trasferire l&#39;aliquota in strisce sterili PCR (8 tubi) a 140 μl di membrana basale per tubo. Riaffilare ogni striscia e conservare a -20 ° C. Sciogliere una striscia a 96 pozzetti a 4 ° C, 24 h prima del dosaggio. Pre-raffreddare le punte della pipetta per evitare la solidificazione. NOTA: Tutto il trattamento della matrice della membrana basale deve essere effettuato su ghiaccio per evitare una rapida solidificazione. Poiché 10 μL per pozzetto di membrana basale viene utilizzato il giorno del dosaggio, ogni striscia è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Incubare completamente confluenti BEC in EBM-2 basale, 24 h prima del dosaggio. NOTA: La motivazione è: EBM-2 completo contiene fattori integrati e FBS allo scopo di promuovere la crescita cellulare ottimale; Tuttavia, gli stessi percorsi molecolari che promuovono la crescita cellulare sono importanti anche per la copertura e la dinamica delle cellule endoteliali del cervello, sia in presenza che in abseNce di uno stressore. Noi quindi il siero e il supplemento affamano i BEC per ridurre l&#39;effetto confondente dell&#39;attivazione residua di percorsi cellulari di segnalazione. Da notare, le cellule sono brevemente (5 min) esposte a FBS durante la neutralizzazione delle cellule trypsinizzate prima del dosaggio. In contrasto con i BEC, le pericie e gli astrociti non sono affamati dal siero, a causa del fabbisogno di diversi fattori di crescita e della relativa instabilità di questi tipi di cellule in risposta alla fame di siero (laboratorio Tai, osservazioni inedite). NOTA: il basale EBM-2 è utilizzato durante il saggio per la formazione di singoli e triplici colture a maglia e le prove di interruzione. Questo è fondamentale per prevenire la confusione di stress o di trattamento che dipendono dal segnale. </li></ol> 2. Analisi di formattazione e di rottura di maglia <ol><li> Saggi di coltura singola BEC: NOTA: tre diversi paradigmi per le singole culture di BEC sono mostrati in Figura 1A </strong&gt;. Ogni paradigma è stato progettato per valutare la risposta dei BEC in diversi modelli di copertura delle vasche. Il paradigma 1 è la formazione di meshwork. Questo paradigma è stato progettato per esaminare gli effetti di stress e / o trattamenti su angiogenesi e formazione di meshwork. BECs, oAβ e trattamenti sono tutti aggiunti alla piastra al punto 0 h. Il paradigma 2 è la prevenzione della rottura del lavoro di rete. Le cellule vengono placcate in presenza di un fattore di crescita o di un farmaco e incubate per 4 ore per formare strutture simili a maglie reticolate. Uno stressor, oAβ in questo caso, viene aggiunto dopo 4 h. Questo paradigma valuta la capacità di un trattamento per prevenire danni causati da stress causati da strutture preformate. Il paradigma 3 è il trattamento simultaneo della rottura del meshwork. Le cellule sono placcate e consentite di formare strutture di tipo reticolo per 4 ore. I trattamenti e l&#39;oAβ vengono poi aggiunti contemporaneamente al punto di 4 h, valutando la capacità della rete cellulare preformata di rispondere a vari trattamenti. Tutti i paradigmi perSimili passi comuni, ad eccezione delle differenze nel tempo di aggiunta del trattamento. <ol><li> Al giorno del dosaggio, pipettare la matrice della membrana basale a 10 μL / pozzetto nel fondo delle piastre a 96 pozzetti e lasciare impostare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Sospendere il colorante liofilizzato di monitoraggio delle cellule verdi (vedere tabella dei materiali ) in 10 μL di DMSO per generare una soluzione di 10 mM stock e diluire a 10 μM (1: 1000) nel basale EBM-2. Rimuovere i supporti dal pallone completamente confluente e sostituirlo con basalto EBM-2 contenente il colorante verde di monitoraggio delle cellule (5 mL per un pallone da 75 cm 2 ). Preloadere BECs con il colorante verde di rilevamento delle cellule, 20 minuti prima dell&#39;inizio del dosaggio. </li><li> Incubare le cellule per 20-30 minuti a 37 ° C, rimuovere il mezzo con il colorante di monitoraggio delle cellule e staccare le cellule come descritto nel punto 1.1. Neutralizzare i supporti con EBM-2 contenente il 10% di FBS e centrifugare a 240 xg per 5 minuti a 4 ° C. Resuspendere il pellet in 1 mL di basale EBM-2. </li><li> Piattare i BEC nella piastra a 96 pozzetti a 10.000 cellule / pozzetto nel basale EBM-2 (punto 0 h in tutti i paradigmi). NOTA: A seconda del paradigma utilizzato, i trattamenti, gli stress oi controlli del veicolo vengono aggiunti nei punti di tempo specificati. In tutti i paradigmi, il mezzo viene raccolto per l&#39;analisi successiva ( es. Analisi ELISA) e le cellule vengono fissate a 24 h con paraformaldehide appena preparato al 4% in fosforo bufferato (PBS). Come approccio alternativo per determinare gli effetti di termine di oAβ sulla formazione di maglie, il protocollo potrebbe essere modificato per pre-incubare le fiasche di coltura confluente con oAβ e quindi eseguire i paradigmi di formazione di maglie (+/- oAβ). NOTA: Il volume finale in ogni pozzetto per tutti i paradigmi è 70 μL. Tutti i trattamenti (oAβ, EGF, ecc. ) Vengono aggiunti ai loro rispettivi pozzetti ad una diluizione 1:20, ovvero 3,5 μL per trattamento. Per il paradigma 1, le cellule vengono aggiunte in una soluzione di sospensione cellulare a 63 μL / well. Adesso vengono aggiunti oAβ, trattamenti e controlli desiderati a 3,5 μL / pozzetto ciascuno, dando un totale di 70 μL. Per il paradigma 2 vengono aggiunti 63 μL di sospensione cellulare e 3,5 μL di trattamento ( es. 100 ng / ml di EGF) al punto 0 h. Dopo 4 ore di incubazione, si aggiunge 3,5 μL di uno stock oAβ (per esempio per 100 nM di concentrazione finale oAβ, 3,5 μL di 2 μM di stock oAβ). Per il paradigma 3 si aggiunge 63 μL di sospensione cellulare al punto 0 h e a 4 h, oAβ e si aggiungono i trattamenti desiderati a 3,5 μL / pozzetto ciascuno, dando un totale di 70 μL. Questi volumi possono essere regolati secondo i trattamenti. Ad esempio, se è richiesto un solo trattamento, il volume della sospensione cellulare può essere regolato a 66,5 μL (mantenendo 10.000 cellule / pozzetto) e il volume di trattamento può rimanere a 3,5 μL. </li></ol></li><li> Saggio di cultura tripla: NOTA: Oltre ai test di coltura singola di BEC, abbiamo sviluppato( Figura 1B ) per determinare la risposta di BECs, periciti e astrociti all&#39;interno di reti preformate a fattori di pertinenza rilevanti ( es. OAβ). I BEC vengono placcati in presenza di trattamenti desiderati a 0 h. A 4 h, periciti vengono aggiunti dolcemente alla lastra. A 7 h, gli astrociti vengono aggiunti alla piastra, seguita dall&#39;aggiunta di uno stressore a 11 h. Le cellule vengono quindi incubate fino al punto di 24 ore. NOTA: Per i saggi di cultura tripla, è importante considerare i tempi per garantire che tutte le cellule siano confluenti allo stesso tempo. Gli astrociti umani e le pericelle devono essere coltivate 1 settimana prima del dosaggio, mentre le cellule hCMEC / D3 devono essere placcate o passate 4-5 giorni prima della data del dosaggio. Inoltre, è importante utilizzare celle primarie a basso passaggio (2-5) per evitare deriva fenotipica. <ol><li> Aggiungere la soluzione di lavoro per la tintura della cella a verde alle cellule hCMEC / D3 20 minuti prima di iniziare il test. Piattare le cellule hCMEC / D3 a 10, 000 cellule / pozzetto in EBM-2 basale (0 ora di ora). I volumi usati sono 45 μL di sospensione cellulare e 3,5 μL di trattamento ( cioè concentrazioni di EGF finali di 50 ng / ml, 100 ng / ml, o 1000 ng / ml da scorte che sono 20 volte più concentrate). </li><li> Dopo l&#39;incubazione a 37 ° C di 3,5 h, aggiungere alla pericia primaria umana la soluzione di lavoro per la tintura dei cavi blu (azoto blu di 10 μM nel basale EBM-2). Al punto di tempo di 4 h (~ 30 min di incubazione con il colorante di monitoraggio delle cellule) aggiungere delicatamente 2&#39;000 periciti / pozzetto alla piastra contenente hCMEC / D3 in un volume di 6 μL / pozzetto. </li><li> Dopo un&#39;ulteriore 2,5 ore di incubazione (totale 6,5 h da 0 ora di ora), aggiungere gli astrociti primari umani alla soluzione di lavoro per la tintura della cellula arancione (10 μM tracker cellulare arancione in basale EBM-2). Al punto di 7 h aggiungete delicatamente 10.000 astrociti / pozzetto alla lastra in 12 μL di volume. Pertanto, il rapporto cellulare complessivo per le cellule endoteliali: periciti: astrociti iS 5: 1: 5. Inoltre, il volume raggiunto a questo punto è di 66,5 μL. </li><li> Aggiungere oAβ (3,5 μL di stock di 100 μM) 4 h più tardi (11 ore totali da 0 ora). </li><li> Fissare le cellule 13 h più tardi in paraformaldeide al 4% in PBS. Attenzione: indossare indumenti protettivi, guanti e occhiali durante la manipolazione di paraformaldeide. </li></ol></li></ol> 3. Quantificazione <ol><li> Cattura immagini di fluorescenza dell&#39;intero pozzetto della piastra a 96 pozzetti ad ingrandimento 1,6X con un tempo di esposizione a 2 s al 50% di potenza massima utilizzando un microscopio di dissezione. NOTA: possono essere utilizzati microscopi equivalenti; Tuttavia, è fondamentale catturare l&#39;intero pozzo per un&#39;analisi completa. </li><li> Per l&#39;analisi quantitativa, elaborare le immagini usando il plugin 22 dell&#39;analizzatore di angiogenesis ImageJ per quantificare il numero di rami, il numero di maglie e la lunghezza totale della cella (questi letture vengono automaticamente tabulati dalla softwaRi) come descritto di seguito. Un protocollo visivo dettagliato di questo passaggio è fornito in Figura 2 . <ol><li> Apri fiji ImageJ cliccando sull&#39;icona del software. </li><li> Clicca sulle doppie frecce rosse in avanti alla fine della barra degli strumenti, quindi fai clic su &quot;Angiogenesis Analyzer&quot;. </li><li> Seleziona la cartella con i file di immagine, fai clic su &quot;Apri&quot;. </li><li> Quando viene visualizzata la casella &quot;impostazioni per l&#39;analisi&quot;, fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Quando viene visualizzata la casella &quot;elaborazione immagini&quot;, che indica il numero di immagini da elaborare, fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Quando viene visualizzata la casella &quot;finestra di avanzamento batch&quot;, che indica il tempo di elaborazione stimato. Durante questo periodo il programma quantifica le uscite tra cui il numero di rami, il numero di maglie e la lunghezza totale della cella. NOTA: Una volta che tutte le immagini vengono quantificate, il file dei risultati verrà visualizzato nella cartella dell&#39;immagine originale come un documento di foglio di calcolo. </li><li> SelezionareIl foglio di foglio di calcolo che contiene i risultati e confronta il numero di rami, maglie e lunghezza totale delle celle tra i gruppi. NOTA: Nel saggio di coltura triplo ImageJ viene ulteriormente utilizzato per analizzare la copertura e il numero di pericite / astrociti. Le immagini sono soggette a un esperimento acustico e la funzione &quot;analisi delle particelle&quot; utilizzata per generare letture. Le cellule fisse e le strutture tubolari possono anche essere immagazzinate per Aβ 17 o altri marcatori. </li></ol></li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+for+senile+dementias:+neuroangiogenesis.">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer's+Disease+and+Vascular+Dementia:+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis.">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

I metodi descritti possono essere utilizzati per affrontare diverse questioni biologiche fondamentali che riguardano la copertura cerebrovascolare24. In particolare, essi possono identificare quali recettori e vie di segnalazione svolgono un ruolo in angiogenesi, la copertura dei recipienti nei tessuti del cancro e cellule endoteliali periferiche rilevanti per il cervello. Gli esempi includono i recettori del fattore di crescita angiogenico, l&#39;ossido nitrico, la mitogen attivata dalla proteina chinasi e la segnalazione di calcio 25 , 26 , 27 . Gli hCMEC / D3 ei BEC primari sono modificabili agli approcci genetici di abbandono per facilitare questo sforzo 18 . L&#39;intuizione meccanica può essere ottenuta dalla coltura di BEC isolati da topi con completa o endoteliale specifiche delle cellule specifiche di proteine ​​chiave con i metodi descritti. Inoltre, i test a tre colture consentono un&#39;analisi approfondita dell&#39;influenza astrocitica e pericicaE sulla funzione delle cellule endoteliali del cervello. Ad esempio, le pericie e gli astrociti possono influenzare la formazione di nidiformi come la formazione di mediatori solubili ( ad es. Angiopoietina, citochine) e anche attraverso il supporto strutturale 24 . Il sistema modello può essere applicato anche alla ricerca delle malattie. Ad esempio, il sistema può affrontare se gli stressi relativi alla malattia e all&#39;invecchiamento aggiungono esogeniamente l&#39;angiogenesi e / o la rottura del lavoro di rete. Gli stress possono essere rilevanti per un disturbo specifico, ad esempio oAβ, o più generalizzato, ad esempio perossido di idrogeno, citochine. Il paradigma della cultura tripla aggiunge un ulteriore livello di complessità che può migliorare la comprensione di meccanismi critici e rilevanti per la malattia che influenzano la dinamica di BBB: delineare se gli stressi relativi alla malattia attivino astrociti e periciti per disturbare la funzione BEC. Per i coltura singola e tripla coltura, le cellule primarie possono essere isolate da froM modelli di mouse che imitano disordini di interesse per delineare ulteriormente gli effetti funzionali. Ci sono una serie di considerazioni importanti per l&#39;adattamento dei test di formazione e di interruzione di tipo meshwork a tipi diversi di cellule. La prima è la densità di semina. Per ogni nuova linea cellulare, un primo passo critico sta ottimizzando la densità di semina nella matrice della membrana basale sia per i singoli che per i tripli di coltura. La formazione di maglie è dipendente dal numero di cellule, poiché sia ​​troppo elevata che troppo bassa la densità delle cellule provoca una mancanza di formazione di maglie. Inoltre, anche per i metodi e le celle qui descritte, è prudente effettuare confronti di densità cellulare per tenere conto di eventuali variazioni di laboratorio nell&#39;elaborazione delle cellule prima di condurre esperimenti su larga scala. La seconda considerazione è la sequenza temporale della formazione di maglie. Devono essere condotti esperimenti del corso di tempo per identificare quando si formano e degradano strutture di tipo &quot;meshwork&quot;. Tipicamente un robusto mesh-lLa formazione ike viene osservata a ~ 4 h. La terza considerazione è la scelta del mezzo prima della semina e durante l&#39;esperimento. BECs, periciti e astrociti vengono coltivati ​​in mezzo che contiene FBS e una pletora di fattori di crescita ottimizzati per la crescita cellulare. Anche se è preferibile affinchè il fattore di siero e di crescita affligge i BEC 24 h prima dell&#39;esperimento, per alcuni tipi di cellule questo non può essere fattibile. Ad esempio, le cellule primarie con reclami specifici del recettore potrebbero richiedere fattori aggiuntivi per facilitare la crescita. Queste considerazioni si applicano anche durante l&#39;esperimento e la scelta del mezzo dipende dalla specifica domanda in esame. Tuttavia, quando si esamina il ruolo di fattori di stress esogeni e di potenziali trattamenti, in particolare fattori di crescita o composti connessi, l&#39;utilizzo di mezzi serici e di fattore di crescita durante l&#39;esperimento è l&#39;ideale. Inoltre, può essere possibile ridurre la lunghezza della fame di siero dei BEC, ma ciò dipende dal sig.In corso di indagine. Una quarta considerazione è la tempistica di aggiungere stress o trattamenti. Per quanto riguarda la scelta del trattamento medico, i tempi si basano sulla questione scientifica. Il test di formazione di maglie è più analogo all&#39;angiogenesi, mentre il test di interruzione del magnesio può essere più rilevante per un BBB maturo. Nella nostra esperienza, una volta stabilita, i dosaggi producono dati coerenti tra esperimenti. I problemi di coerenza sono spesso dovuti a discrepanze di densità di sopravvivenza tra il personale e, soprattutto, se i componenti del reagente medio o rilevante sono alterati inconsapevolmente. Ci sono limitazioni e aree di ulteriore sviluppo dei metodi descritti. Una forza di questa procedura è che basse concentrazioni di stressore ( ossia oAβ) possono essere utilizzate per indurre la rottura di maglie, cioè nM rispetto a μM, che sono più fisiologicamente rilevanti. Tuttavia, questa forza può anche essere una limitazione. Infatti, più in alto, bNon ancora tossiche, possono essere necessarie concentrazioni di oAβ per scopi di screening dei farmaci per aumentare la sensibilità, che si applicherà ad altri fattori di rischio per le malattie. Una limitazione del metodo è che il lavoro a maglie delle cellule è stabile solo per 24 ore nei protocolli descritti. Infatti, dopo 24 ore, le cellule delle cellule iniziano a degenerarsi. Pertanto aggiungiamo oAβ dopo un tempo relativamente breve (4 h) dopo la formazione di maglie, per consentire un tempo totale di incubazione di oAβ di 18 h. Forse le densità di sementi inferiori delle cellule potrebbero consentire protocolli di trattamento più lunghi. Un&#39;ulteriore limitazione potenziale è che il sistema in vitro non può imitare un funzionamento a maglie stabili di cellule come sarebbe stato osservato in vivo . L&#39;isolamento delle cellule da topi invecchiati può simulare più da vicino lo scenario in vivo .

<html> La barriera emato-cerebrale (BBB) ​​dei capillari cerebrali è la più grande interfaccia del contatto ematico-to-cerebrale e svolge un ruolo centrale nell&#39;omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS) 1 , 2 . I processi dinamici del BBB impediscono l&#39;assorbimento di molecole indesiderate dal sangue, rimuovono i prodotti di scarto dal CNS, forniscono nutrienti essenziali e molecole di segnalazione al CNS e modulano la neuroinflammazione 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Il danno di BBB è prevalente durante l&#39;invecchiamento e diversi disturbi neurodegenerativi tra cui la malattia di Alzheimer (AD), la sclerosi multipla e l&#39;ictus 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Pertanto, la disfunzione di BBB può svolgere un ruolo chiave nei disturbi neurodegenerativi, anche come obiettivo terapeutico. Il mantenimento della copertura dei recipienti è importante per le funzioni homeostatiche del BBB. Tuttavia, i dati in vivo e in vitro confligano sul fatto che i processi coinvolti nei disturbi neurodegenerativi causino una copertura BBB maggiore o minore 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , particolarmente in AD. Pertanto, vi è una forte logica per lo sviluppo di modelli in vitro utilizzando tipi di cellule per valutare e comprendere in modo più completo le dinamiche della copertura BBB. I capillari cerebrali sono composti da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs) <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Tutti i tipi di cellule contribuiscono alla funzione del BBB attraverso il supporto strutturale e attraverso la secrezione di molecole effector come fattori di crescita angiogenici, citochine e chemiokine che agiscono in modo paracrino e autocrino. Tuttavia, le principali cellule efficaci del BBB sono BECs 3 . In generale, le tecniche di coltura cellulare per la valutazione della funzione BBB sono i test di permeabilità eseguiti su cellule coltivate su inserti di filtri o valutando i livelli di proteine ​​chiave BEC, sia dopo l&#39;aggiunta di stress 14 , 15 , 16 . Sebbene importanti, questi dosaggi non riguardano la copertura cerebrovascolare. Qui, i nostri precedenti metodi 17 sono dettagliati per valutare la copertura BEC e le strutture di tipo reticolo utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e una cultura tripla umanizzataModello (BEC, astrociti e periciti) del BBB. L&#39;obiettivo era dimostrare l&#39;effetto dannoso di oAβ, che è considerato un importante contributore alla progressione dell&#39;AD, sulla copertura BEC. L&#39;effetto protettivo del fattore di crescita epidermico (EGF) evidenzia il potenziale della tecnica come strumento di screening terapeutico. La tecnica presenta diverse applicazioni per la ricerca di base e applicata, tra cui: 1) definire il ruolo di percorsi specifici in materia di angiogenesi e copertura dei vasi, 2) valutare gli effetti delle malattie e dei fattori rilevanti sull&#39;invecchiamento sull&#39;angiogenesi e sulla vasca e 3) individuare le attività farmacologiche obiettivi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">hCMEC/D3 cells</td>
			<td style="width:183px;">Milipore</td>
			<td style="width:119px;">SCC066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">EBM-2 basal media&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Collagen Type 1</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A1064401&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5% FBS</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Ascorbic acid</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Gentamycin sulphate</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25% Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="78">
			<td height="78" style="height:78px;width:379px;">1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin hydrochloride</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">80503-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">MEM-HEPES&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12360-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Papain cell dissociation system (papain and DNase1)</td>
			<td style="width:183px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Human pericytes</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Pericyte basal media</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Pericyte growth supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Human Astrocytes</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Astrocyte media</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Astrocyte growth supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Angiogenesis m-plates (96-well)</td>
			<td style="width:183px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">89646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Human Epidermal growth factor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Shenendoah Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker green&#160;</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker orange</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td>C34551</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker blue&#160;</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td>C2110</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Poly-l-lysine</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-60ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">C57BL mice</td>
			<td style="width:183px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">PCR tube strips</td>
			<td style="width:183px;">GeneMate</td>
			<td style="width:119px;">T-3014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">na</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption

La copertura del sangue-cervello (BBB) ​​svolge un ruolo centrale nell&#39;omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS). Il BBB è mantenuto dinamicamente da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs). Qui metodi dettagliati per valutare la copertura BBB utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e un modello di coltura triplicata umanizzata (BECs, astrociti e periciti) del BBB. Per evidenziare l&#39;applicabilità dei dosaggi agli stati di malattia, descriviamo l&#39;effetto dell&#39;amyloid oligomerico (oAβ), che rappresenta un importante contributo alla progressione della malattia di Alzheimer (AD), sulla copertura BBB. Inoltre, utilizziamo il fattore di crescita epidermico (EGF) per illuminare il potenziale di screening delle droghe delle tecniche. I nostri risultati mostrano che singole e triple coltivate BECs formano strutture a maglia in condizioni basali e che oAβ interferisce con questa formazione di mesh e degenerizza le strutture preformate di maglie,Ma EGF blocca questa rottura. Quindi le tecniche descritte sono importanti per la dissezione di processi fondamentali e rilevanti per la malattia che modulano la copertura BBB.

In singole colture, entrambe le cellule hCMEC / D3 ( Figura 3A ) e il BEC primario del mouse ( Figura 3B ) formano strutture a maglie simili a tutto il pozzo. Le strutture sono caratterizzate da un reticolo di nodi interconnessi ( Figura 3 ). In tutti i paradigmi descritti ( Figura 1 ), le strutture simili a maglie reticolari sono simili dopo 24 ore nei gruppi di controllo, formando ~ 20 strutture a maglia con una lunghezza totale cellulare di ~ 10.000 pixel. Per evidenziare l&#39;applicabilità dei metodi a fattori correlati alle malattie, l&#39;oAβ è stato aggiunto alla hCMEC / D3 e ai primari BECs del mouse in due paradigmi. Nella disgregazione della formazione di maglie a cellule (Paradigma 1), l&#39;oAβ e le cellule vengono placcate contemporaneamente. Nella rottura del reticolo preformato (Paradigma 2), l&#39;oAβ è aggiuntoEd 4 h dopo la placcatura delle cellule (vedi Figura 1A ). L&#39;oAβ a 100 nM induce una disgregazione della formazione e della degenerazione del reticolo di maglia ( Figura 3A , 3B ). Ad esempio, utilizzando le cellule hCMEC / D3 in entrambi i paradigmi, la quantificazione della copertura totale della cellula / lunghezza è inferiore del 16-20% con 100 nM oAβ 17 . Inoltre, il numero di maglie è ridotto del 40% con 100 nM oAβ in entrambi i paradigmi 17 . Pertanto, un fattore di pertinenza della malattia induce un effetto dannoso simile sulla copertura umana e sui topi BEC. Un vantaggio fondamentale del sistema di coltura cellulare è la capacità di identificare fattori o trattamenti che prevengono danni rilevanti per la malattia, che possono quindi passare ai test in vivo . Come prova del principio sperimentale, gli effetti dei principali fattori di crescita angiogenici sulla prevenzione della cha indotta da oAβSono stati valutati i dati relativi alla copertura delle navi 17 . Il FEG ha impedito danni indotti da oAβ alle cellule hCMEC / D3. Sulla base di questi dati, EGF è stato testato in un paradigma di prevenzione utilizzando un modello di topi transgenici che ricapitola gli aspetti critici della patologia AD-like. Il trattamento con EGF ha impedito i deficit cognitivi e BBB, compresa la degenerazione dei vasi 23 . Questi dati supportano il potenziale predittivo del sistema in vitro per l&#39; attività in vivo . Attualmente, utilizziamo tutti e tre i paradigmi sviluppati per lo screening: 1) formazione di maglie, 2) prevenzione della rottura del tessuto cellulare e 3) trattamento simultaneo della rottura di maglie. Come evidenziato nella figura 3 , EGF può proteggere dai danni indotti da oAβ in colture immortali e primarie di topo BEC. Il BBB è costituito da BEC, periciti e astrociti che contribuiscono collettivamente al cerebrovasc complessivoCopertura ular. Pertanto, un adattamento del sistema in vitro è l&#39;incorporazione di tutti e tre i tipi di cellule BBB. Il nostro paradigma di dosaggio della coltura tripla comprende le cellule hCMEC / D3, le pericie umane primarie e gli astrociti umani primari, che vengono aggiunti sequenzialmente alla matrice della membrana basale ( Figura 1B ). Nel paradigma del saggio di coltura tripolare, le cellule hCMEC / D3 formano un reticolo simile a quello delle singole colture, ma con le pericie e gli astrociti attaccati ai nodi e ai rami di connessione ( Figura 4 ). L&#39;aggiunta di 100 nM oAβ induce la disfunzione di rete (~ 10-15%) e una riduzione del numero di periciti che contattano i BEC 17 . In correlazione con i dati derivati ​​dai paradigmi di analisi della coltura singola, il danno indotto da oAβ è impedito dal trattamento EGF. Pertanto, il modello BBB tripla coltura è adatto per gli studi incentrati sugli effetti interattivi degli astrociti, periciE BEC sulle dinamiche dei recipienti. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55846/55846fig1.jpg" /> Figura 1: Panoramica dei test di formazione di meshwork e di interruzione. ( A ) I paradigmi di analisi della coltura singola. Paradigma 1, formazione di maglie. Le cellule, gli stress e i trattamenti sono tutti aggiunti alla lastra al punto di 0 h. Paradigma 2, prevenzione della rottura del lavoro di rete. Le cellule vengono placcate in presenza di trattamenti desiderati, incubati per 4 h e uno stressor viene aggiunto al punto di 4 h. Paradigma 3, trattamento simultaneo della rottura del meshwork. Le cellule sono placcate e consentite di formare strutture simili a maglia per 4 ore prima che i trattamenti e / o gli stressori siano aggiunti contemporaneamente al punto di 4 h. Tutti i paradigmi terminano al punto di 24 h, e le cellule sono fissate con 4% di paraformaldeide. ( B ) Paradigma del saggio di coltura tripla. BECs (10.000 cellule / pozzetto) sono placcati nel presDi trattamenti desiderati a 0 h. Al punto di 4 h le pericelle (2.000 cellule / pozzetto) vengono aggiunte delicatamente alla piastra. A 7 ore astrociti (10.000 cellule / pozzetto) vengono aggiunti alla piastra, seguita dall&#39;aggiunta di stressori pertinenti a 11 h. Le cellule vengono quindi incubate fino al punto di 24 h e fissate con 4% di paraformaldeide. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55846/55846fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55846/55846fig2.jpg" /> Figura 2: Analisi quantitativa. Tutte le immagini vengono aperte in Fiji ImageJ e elaborate in batch utilizzando l&#39;Analizzatore Angiogenesis 22 . Sono utilizzati quantificazione della lunghezza totale e del numero di maglie. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55846/55846fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di t</a>La sua figura. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55846/55846fig3.jpg" /> Figura 3: Analisi di disfunzione di maglie: immagini rappresentative. Tutte le immagini sono ricavate da esperimenti che utilizzano Paradigm 2, interruzione di meshwork. ( A ) Immagini rappresentative delle cellule hCMEC / D3 placcate e trattate con controllo del veicolo (VC), EGF (100 nM), oAβ (100 nM) o oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Immagini a ingrandimento 10X, barra di scala = 100 μm. ( B ) Immagini rappresentative del mouse primario BEC placcate e trattate con VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) o oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Immagini a ingrandimento 10X, verde = BECs, barra di scala = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55846/55846fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Figura 4. Test di coltura tripla: immagini rappresentative. ( A ) Le immagini rappresentative delle cellule hCMEC / D3, periciti primarie umane e astrociti umani primari placcati e trattati con VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) o oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) Secondo il paradigma descritto nella Figura 1B . Immagini a 10x ingrandimento, verde = BECs, blu = pericytes, e rosso (pseudocolore) = astrociti. Barra di scala = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55846/55846fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l&#39;omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue.

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

8.4K Views.  University of Illinois at Chicago.  Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l'omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue. 

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

MRI-guidato Interruzione della barriera emato-encefalica transcranica con ultrasuoni focalizzati in un modello murino

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

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Medicina

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

La misurazione e trattamento di soppressione in Ambliopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modello Rat di emato-encefalica Turbativa Barriera per consentire mirato Therapeutics neurovascolare

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Test per la verifica della nave Permeabilità Sangue

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Cerebrale permanente occlusione di vasi<em&gt; Via</em&gt; Doppio Legatura e resezione

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

Stretch in microvascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) come<em&gt; In Vitro</em&gt; Trauma cranico modello della barriera ematoencefalica

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

L&#39;ossigeno-glucosio Deprivazione e riossigenazione come<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemia-riperfusione Injury modello per lo studio barriera sanguigna del cervello Erettile

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore largely based on animal studies, despite the high diversity among species in placental anatomy, hemodynamics and duration of the pregnancy. The vast majority of human placenta studies are ex vivo perfusion studies or in vitro trophoblast studies. Although in vitro studies and animal models are essential, extrapolation of the results from such studies to the human placenta in vivo is uncertain. We aimed to study human placenta physiology in vivo at term, and present a detailed protocol of the method. Exploiting the intraabdominal access to the uterine vein just before the uterine incision during planned cesarean section, we collect blood samples from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta. When combining concentration measurements from blood samples with volume blood flow measurements, we are able to quantify placental and fetal uptake and release of any compound. Furthermore, placental tissue samples from the same mother-fetus pairs can provide measurements of transporter density and activity and other aspects of placental functions in vivo. Through this integrative use of the 4-vessel sampling method we are able to test some of the current concepts of placental nutrient transfer and metabolism in vivo, both in normal and pathological pregnancies. Furthermore, this method enables the identification of substances secreted by the placenta to the maternal circulation, which could be an important contribution to the search for biomarkers of placenta dysfunction.

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

We present a detailed method to study human placental physiology in vivo at term. The method combines blood sampling from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta with ultrasound measurements of volume blood flow and placental tissue sampling.

L&#39;approccio di campionamento a 4 nave per studi integrativi della fisiologia placentare umana<em&gt; In Vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...