Questo lavoro è stato finanziato da NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant e un Supplemental Grant NIH a FR, borsa di BB a CM, borsa CDT a RG.

1. Preparazione delle diapositive <ol><li> Porre vetrini da microscopio da 22 mm x 40 mm in piatti da coltura a cellule da 6 cm, 1 vetrino per piatto. </li><li> Esporre ogni lato di ciascuna diapositiva come pure il piatto da 6 cm a luce ultravioletta (UV) per 15-20 minuti per sterilizzare in un cappuccio sterile. </li><li> Coprire i piatti con diapositive all&#39;interno con parafilm e conservare a 4 ° C fino a quando non sarà pronto per l&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di supporti, buffers, soluzioni e reagenti <ol><li> Preparare 1 L di soluzione salina bilanciata Hank (HBSS) in acqua deionizzata e aggiungere 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO3 e 1 mM EGTA. Regolare a pH 7,2-7,3 con NaOH. Tampone filtrante con filtro da 0,22 μm in una bottiglia autoclavata. </li><li> Preparare 900 ml di alghe di glucosio elevato Dulbecco&#39;s Medium (DMEM) modificato in acqua deionizzata. Aggiungere 44 mM NaHCO 3 e regolare il pH a 7,2-7,3 con HC1. Filtrare i supporti con un filtro da 0,22 μm in una bottiglia autoclavata. Aggiungere 100 ml di bovi fetaliNe serum (FBS) ai media per ottenere la concentrazione di FBS del 10%. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare 1 L di tampone intracellulare (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl2) in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,25. Il finale [Ca 2+ ] sarà ~ 100 nM. Prima dell&#39;uso, aggiungere 0.5 mM ATP. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 1 l di tampone Ringer (121 mM NaCl, 2,4 mM K 2 HPO 4 , 0,4 mM KH 2 PO 4 , 10 mM HEPES e 1,2 mM MgCl2) in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,2. Conservare a temperatura ambiente. Per l&#39;uso, aliquota 50 mL in un tubo da 50 mL e aggiungere 1.8 mM Ca 2+ e 10 mM glucosio. </li><li> Preparare 1 L di soluzione di risciacquo KCl (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl2) in acqua deionizzata e regolare il pH a 7,25. </li><li> Sciogliere 5 mg di ionomicina in 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Aliquota 30 μL in microtubi e conservare a -206; C. </li><li> Preparare l&#39;acido ciclopiazonico (CPA) dissolvendo CPA in DMSO. Assicurarsi che il percentuale finale di DMSO sia ≤ 1% per il CPA aggiunto alle cellule per prevenire l&#39;apoptosi. Preparare 20 mM di 4-cloro-m-cresolo (4-cmc) sciogliendo in H 2 O filtrato e lasciandolo sciogliere a notte agitando a 37 ° C. Preparare lo stock di ATP sciogliendo in H 2 O filtrato fino a 100 mM. </li><li> Per determinare la K d in situ, preparare 15 ml di 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM e 100 mM Ca 2+ in tampone KCl utilizzando un 100 MM EGTA e uno stock di 1 M CaCl2 disciolti in acqua deionizzata. </li></ol> 3. Cultura cellulare <ol><li> Culture C2C12 myoblast e HEK293 cellule secondo protocolli ATCC per ciascuno utilizzando piatti di coltura cellulare da 10 cm in una cappa UV sterile. NOTA: Le cellule C2C12 non dovrebbero essere consentite di crescere al di sopra della confluenza del ~ 70% poiché i mioblasti inizieranno a differenziazioneTe in miotubi. Entrambe le cellule HEK293 e C2C12 crescono prontamente e non dovrebbero essere permesse di crescere oltre confluenza del 100% per mantenere l&#39;integrità cellulare. Inoltre, le cellule non devono essere passate più di 10 volte prima di usarle per un esperimento per preservare la salute delle cellule. </li></ol> 4. Trasfezione delle cellule HEK293 <ol><li> Le cellule HEK293 di seme su microscopio di vetro sterilizzato da 22 mm x 40 mm scivolarono in piatti da 6 cm in modo che siano ~ 70% confluenti il ​​giorno della trasfezione. </li><li> Il giorno dopo, seguire il protocollo del produttore per il reagente di transfezione per trasfettare le cellule usando 2 μg di CatchER + cDNA e un DNA di 1: 3 (peso / volume): rapporto di reagente di transfezione nei mezzi di siero ridotti ( ad esempio, Opti-MEM). </li><li> Svuotare il supporto DMEM dal piatto e aggiungere 3 ml di media sierica ridotta. Aggiungere il DNA: la miscela di reagente di transfezione al piatto e incubare per 4-6 h a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare le cellule con 5-6 ml di HBSS. Scartare l&#39;HBSS fIl piatto e sostituire con 3 ml di DMEM fresco e incubarli a 37 ° C per 48 ore per consentire l&#39;espressione del GECI. </li><li> Trasfezione di cellule miooblasto C2C12 <ol><li> Per le cellule miooblasto C2C12, trypsinizzare le cellule aggiungendo trypsina sufficiente per coprire il fondo del piatto (1-2 mL). Mettere il piatto in un incubatore a 37 ° C per 2-6 minuti per consentire alla tripsina di allentare le celle dal fondo del piatto. </li><li> Una volta completata l&#39;incubazione, togliere la tripsina e aspirare le cellule in 8 ml di DMEM. Pipettate le cellule con il DMEM per disperdere e ri-sospendere uniformemente le cellule te e seminarle su coperchi sterili in piatti da 6 cm di coltura cellulare contenenti 3 ml di DMEM in modo che la confluenza finale sia del 60%. </li><li> Trasfettare le cellule lo stesso giorno come descritto nel passaggio 4.2-4.3. Incubare per 24 h a 37 ° C. </li><li> Ripetere la fase 4.4. </li></ol></li></ol> 5. Preparazione del microscopio a scorrimento e fluorescenza <ol><li> Accendere mIcroscopio e sorgente luminosa, quindi aprire il programma Simple PCI. Lasciare che il microscopio si riscaldi per 15-20 min o fino a quando la fotocamera del dispositivo accoppiato a carica (CCD) si raffredda a -65 ° C. Preparare la camera e scivolare con le celle in attesa. </li><li> Coprire la parte inferiore della camera di imaging con vasca diamantata a basso profilo con un sottile strato di sigillante, utilizzando un tampone di cotone. </li><li> Prendere la diapositiva contenente le cellule trasfettate dall&#39;incubatore e sciacquare delicatamente tre volte con 1 ml di tampone di Ringer con 10 mM di glucosio e 1,8 mM di Ca 2+ preriscaldati a 37 ° C. </li><li> Lasciare 1 ml di tampone Ringer nel piatto, per impedire le cellule di essiccazione e utilizzare pinze per togliere la scivola dal piatto. Lasciare che la soluzione in eccesso si assorba a un tessuto di laboratorio toccando il bordo della slitta ad un tessuto di laboratorio. Quindi posizionare sul lato della camera contenente il grasso con le celle rivolte verso l&#39;alto verso il grasso e fissare la camera sul supporto a palo con un cacciavite. </li><li> Aggiungi 1Ml del tampone di Ringer alla camera per impedire alle cellule di essiccare durante il montaggio della camera sul palco e completare il resto della configurazione del microscopio. Una volta che il tubo di aspirazione del vuoto è fissato alla camera, il volume finale della camera è di ~ 450 μL. </li><li> Passare l&#39;obiettivo del microscopio all&#39;obiettivo di immersione a olio 40X. </li><li> Utilizzare la soluzione di pulizia dell&#39;obiettivo e della carta per pulire e asciugare l&#39;obiettivo. Non strofinare l&#39;obiettivo. Colare dolcemente finché la superficie non sia pulita. </li><li> Aggiungere una goccia dell&#39;olio di immersione all&#39;obiettivo. </li><li> Mettere il supporto sullo stadio del microscopio e aggiungere la punta del vuoto alla camera. Una volta che il tubo di aspirazione del vuoto è fissato alla camera e acceso, il volume finale della camera è di ~ 450 μL. Questo volume finale è a livello dei lati della camera. È indispensabile che la soluzione della camera sia, durante l&#39;esperimento, a livello, per impedire che la soluzione venga sparsa verso l&#39;obiettivo a causa del sovraffollamento. </li><lI&gt; Sollevare l&#39;obiettivo e utilizzare la regolazione grossolana finché l&#39;olio sull&#39;obiettivo non tocca il fondo della slitta. </li><li> Utilizzando la modalità campo luminoso, regolare il guadagno a 175 e il tempo di esposizione a 0,03 s per mettere a fuoco le celle. </li><li> Una volta che le cellule sono focalizzate, passare alla modalità di fluorescenza utilizzando l&#39;eccitazione di 488 nm. Cambiare il tempo di esposizione a 0,07 s. Individuare un campo di visualizzazione che dispone di cellule sufficienti che sono sane con una fluorescenza adeguata all&#39;immagine. </li><li> Una volta scelto un campo visivo, scattare foto in modalità fluorescenza e campo luminoso. </li><li> Cerchi una regione di interesse (ROI) nelle cellule o cerchi la cella intera per registrare l&#39;intensità dell&#39;area scelta. </li></ol> 6. Imaging dei transitori Ca 2+ indotti da farmaci e di calibrazione in situ <ol><li> Avviare la misurazione dell&#39;intensità con il frame rate impostato a ogni 5 s. </li><li> Lasciare che l&#39;intensità di base si stabilizzi per 20-30 fotogrammi (100-150 s). Se necessario, diminuisci il frDurante questa fase per prevenire la fotolibrazione. </li><li> Calcolare la quantità di 4 cm c necessaria da uno stock di 20 mM in base al volume della camera finale di ~ 450 μL per ottenere una concentrazione finale di 200 μM. Fare diluizioni dello stock se necessario. </li><li> Prendete con attenzione 60 μL di buffer di Ringer dalla camera e posizionati in un tubo di microcentrifuga. Diluire la quantità calcolata di 4 cmq con questa soluzione e riportare nuovamente alla camera per evocare la risposta prevista dalle cellule in scansione. </li><li> Aggiungere la quantità calcolata di 4 cm al tubo di microcentrifuga e mescolare pipettando. </li><li> Aggiungete delicatamente la soluzione sul campo visivo contemporaneamente aggiungendo l&#39;indicatore di eventi nella misura dell&#39;intensità. </li><li> Lasciare tempo affinché il farmaco si leghi al recettore e successivamente diminuisca il segnale, quindi lavati con 3-6 ml di tampone Ringer con 1.8 mM Ca 2+ e 10 mM glucosio, contemporaneamente aggiungendo il marker di eventi. Poiché il volume della camera è di 450 &amp;# 181; L ed è collegato ad un vuoto, aggiungendo 3-6 ml di tampone assicura che l&#39;ex soluzione contenente il farmaco sia stata lavata via e sostituita con la nuova soluzione aggiunta. </li><li> Ripetere 6.1-6.7 per 100 μM ATP e 15 μM CPA, utilizzando una nuova diapositiva di cellule trasfettate per ogni assaggio. </li><li> Una volta completata la misurazione, terminare la raccolta dati nella finestra di misurazione dell&#39;intensità nel programma Simple PCI. </li><li> Prendi fluorescenza e immagini luminose delle cellule. </li><li> Apri il file di dati per l&#39;esperimento. Qui, ricircolare le cellule o regioni di interesse per ricalcolare i valori di intensità, se necessario. </li><li> Per determinare la K d in situ nelle cellule miooblastiche C2C12, seguire il protocollo come descritto nella sezione 4.2 e sezione 5 e mettere 1 ml di 0 mM Ca 2+ Ringer&#39;s buffer nella camera. <ol><li> Permeabilizzare le cellule con 0,002-0,005% di saponina nel buffer intracellulare per 15-30 s per svuotare le cellule di qualsiasiCatchER + che può essere nel citosol. Lavare le cellule con 3-6 mL di 1 mL EGTA in buffer KCl con 10 μM ionomicina. Lasciare diminuire l&#39;intensità fino a raggiungere un plateau. </li><li> Sciacquare con 3-6 mL di buffer KCl con 10 μM di ionomicina e lasciare stabilizzare l&#39;intensità, quindi aggiungere ogni soluzione Ca 2+ dettagliata nel punto 2.7. Consentire l&#39;intensità di raggiungere un plateau tra ogni aggiunta. </li></ol></li><li> Per calibrare il sensore per la quantificazione basale [Ca 2+ ], seguire la fase 6.12. Utilizzare l&#39;EGTA e il tampone Ca 2+ di 100 mM dalla fase 2.7 per ottenere l&#39;intensità di fluorescenza minima e massima. </li></ol> 7. Elaborazione dei dati <ol><li> Scaricare il file del foglio di calcolo dei dati di misurazione dell&#39;intensità. </li><li> Normalizzare i dati per ogni cella all&#39;intensità di base (F / F 0 ). Tracciare i dati normalizzati rispetto al tempo in qualsiasi programma di grafica. </li><li> Per calcolare la variazione%, sottrarre la val di picco normalizzataUe da 1 e moltiplicare per 100. Calcolare la deviazione media e standard se sono state immagazzinate più celle. </li><li> Per calcolare il rapporto segnale / rumore, SNR, aprire il file immagine salvato dall&#39;esperimento in un software di elaborazione immagini, ad esempio ImageJ, e quindi misurare il segnale, le cellule trasfuse e il rumore, lo sfondo. Calcolare l&#39;SNR utilizzando l&#39;equazione SNR = segnale / rumore. </li><li> Per calcolare l&#39; in situ K d dai dati raccolti di dati di fluorescenza raccolti, mediate i dati di intensità, che comprendono gli altipiani, dopo l&#39;aggiunta di ciascuna concentrazione di Ca 2+ e di EGTA (0 mM Ca 2+ ). Calcolare la saturazione frazionaria (intensità relativa) utilizzando θ = (F - F min ) / (F max - F min ) dove θ è l&#39;intensità relativa, F è la fluorescenza in qualsiasi punto, F min è l&#39;intensità minima di fluorescenza e F max è l&#39;intensità massima di fluorescenza, per vedere la variazione dell&#39;intensità di tSonda con l&#39;aggiunta di Ca 2+ rispetto all&#39;intensità minima. Tracciare i relativi dati di intensità nei confronti del [Ca 2+ ] in qualsiasi programma di montaggio curva e grafica. Utilizzare l&#39;equazione di legame 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]) tradotto per qualsiasi programma di grafica e curva per calcolare il K d . M T è la concentrazione totale del metallo. </li><li> Per quantificare il calcio basale dalla calibrazione descritta al punto 6.13, mediare i dati di intensità, compresa gli altipiani, dopo l&#39;aggiunta di 1 mM EGTA (F min ) e 100 mM Ca 2+ (Fmax). Utilizzare l&#39;equazione di calibrazione [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ] / (F max - F)] per calcolare il calcio basale. </li></ol>

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J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. 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Gli autori non hanno niente da rivelare.

L&#39;imaging a cellule singole di sonde fluorescenti, come CatchER + , è una tecnica efficace per analizzare i processi di segnalazione intrinsecamente ER / SR Ca 2+ in ogni cellula in risposta a agonisti o antagonisti del recettore. Questa tecnica è utile anche per l&#39;imaging utilizzando più lunghezze d&#39;onda contemporaneamente, come è necessario per Fura-2 o per l&#39;immagine CatchER + e Rhod-2 insieme per monitorare rispettivamente i cambiamenti di calcio ER e citosolici. Ci sono diversi passi critici in questo protocollo; La transfezione cellulare può avere un grande effetto sulla vitalità dell&#39;immagine. I bassi tassi di trasfezione possono portare ad un&#39;espressione insufficiente del GECI per il monitoraggio delle risposte al calcio. D&#39;altra parte, l&#39;eccessiva espressione di CatchER + non avrà un effetto bufferizzante su ER / ER Ca 2+ , un problema associato a coloranti sintetici di calcio. Gli effetti di tampone delle sonde Ca 2+ sono influenzati dal [Ca 2+ ] nell&#39;organelle, il K d del pAbbigliamento e la concentrazione della sonda richiesta per la misurazione. Citocholic [Ca 2+ ] è tipicamente nella gamma bassa nanomolar, tuttavia, la concentrazione necessaria della sonda è in una gamma comparabile. In questo caso, la quantità di concentrazione di tinture e la sua capacità di tamponare il calcio citosolico era e rappresenta una preoccupazione importante per l&#39;imaging cellulare. Al contrario, ER / SR [Ca 2+ ] si trova nel 100s di gamma micromolare a millimola 31 come abbiamo determinato per diverse linee di cellule mammiferi 25 . Poiché l&#39;espressione di CatchER + da 0,1-1 μM è sufficiente per consentire la rilevazione del calcio ER, l&#39;effetto di bufferizzazione di CatchER è trascurabile. Così, CatchER + può monitorare il flusso di Ca 2+ in ambienti ad alta [Ca 2+ ] senza alcun effetto di buffering sulla luminal ER / SR Ca 2+ 32 . Diversi fattori possono influenzare l&#39;efficienza di transfection del GECI come il tempo di incubazione, thIl reagente di transfection, la temperatura di incubazione e la confluenza cellulare. La confluenza delle cellule, quando seminano le cellule sulla diapositiva, possono influenzare in modo significativo la qualità dell&#39;immagine. La bassa confluenza può portare a un numero minore di cellule (n) e meno accuratezza statistica, mentre elevati livelli di confluenza portano a strati sovrapposti di cellule che producono variabili di grandi dimensioni nell&#39;immagine. L&#39;ora e la temperatura per la trasfezione devono essere ottimizzati in base al tipo di cellula. Inoltre, l&#39;aggiunta di DMEM con supporti serici ridotti è ottimale per tempi di transfezione più lunghi per prevenire l&#39;apoptosi. La fluorescenza originale di GECI CatchER nelle cellule di mammiferi, quando è stata colta e transfettata, era solo 30 ° C. La fluorescenza di CatchER è stata ottimizzata e migliorata con successo per l&#39;espressione a 37 ° C, con conseguente nuova, migliorata variante CatchER + . È possibile eseguire una macchia Western utilizzando un anticorpo contro EGFP per confermare l&#39;espressione della sonda Ca 2+ . Inoltre, ioLa consistenza e la consistenza della fornitura del reagente è fondamentale. I reagenti possono essere aggiunti alla camera da perfusione, da piccole diffusioni di volume o da pompe meccaniche, che possono provocare risposte diverse. È indispensabile che la camera di soluzione sia correttamente sigillata applicando uno strato di grasso sigillante sul fondo della camera che sarà posizionato sullo scivolo. Per la sonda devono essere selezionate le lunghezze d&#39;onda corrette. Le lunghezze d&#39;onda di eccitazione e di emissione per CatchER + sono rispettivamente 395/488 nm e 510 nm. Per l&#39;imaging delle cellule, solo 488 nm viene utilizzato per l&#39;eccitazione per evitare l&#39;effetto dannoso della luce UV sulle cellule. Pertanto, utilizzare tutti i filtri ottici che eccitano a 488 nm e raccogliere l&#39;emissione a 510 nm sarebbe accettabile per l&#39;utilizzo con l&#39;immagine con CatchER + . Per prevenire la fotolibrazione, gli sforzi possono essere focalizzati per ottimizzare l&#39;intensità della luce e l&#39;esposizione della luce, ad esempio i fotogrammi 33 . Mentre questo protocollo è l&#39;ideale per analizzare l&#39;effEct delle modifiche ER / SR utilizzando la sonda fluorescente CatchER + Ca 2+ ER / SR, ci sono limitazioni come previsto in ogni esperimento. Poiché l&#39;imaging live in una sola cellula analizza solo un piccolo fotogramma delle cellule, il numero di cellule (n) può variare da 1 a 100 celle in media, ma può essere inferiore per le più grandi linee cellulari. Ciò porta a numeri di celle inferiori e risultati statisticamente variabili senza prove multiple. Un n&gt; 6 è richiesto per l&#39;accuratezza statistica. Per ottenere una maggiore n, molti piatti devono essere imaged o altre tecniche devono essere utilizzati, contemporaneamente. Inoltre, CatchER + è una singola sonda di lunghezza d&#39;onda ER / SR Ca 2+ , questo porta alle emissioni di altre sonde e tinte di lunghezza d&#39;onda singola, non essendo in grado di quantificare il segnale, non sapendo se il segnale è vero, opposto alla rottura delle cellule Artefatto e con rumore maggiore rispetto ai sistemi ratiometrici 34 . Questo lavoro mostra che queste sonde ottimizzate Ca 2+ possonoEssere applicato in diversi tipi di cellule o tipi di tessuto per monitorare il recettore mediato ER / SR Ca 2+ rilascio. CatchER + è una singola sonda di lunghezza d&#39;onda ER / SR Ca 2+ . Pertanto, è importante che i parametri e le impostazioni sperimentali siano coerenti per la misurazione quantitativa. Una calibrazione dettagliata della concentrazione di calcio e K d del sensore di calcio nelle linee cellulari sono ulteriori misurazioni importanti per l&#39;analisi quantitativa. Questi sviluppati sensori di calcio possono anche essere mirati a posizioni specifiche all&#39;interno dell&#39;ER / SR per monitorare i transienti Ca 2+ molto diversi rispetto ai cambiamenti Ca 2+ globali in varie condizioni biologiche e patologiche. Questi risultati continueranno a spingere i campi della progettazione di immagini e di sonde Ca 2+ in avanti per fornire strumenti futuri per la diagnosi di malattie legate alla Ca 2+ . I protocolli riportati e il sensore sviluppato possono anche essere adattati per la droga dDisturbi contro le malattie associate alla segnalazione di calcio.

Gli attributi spazio-temporali dei transitori intracellulari del calcio (Ca 2+ ) attivano varie funzioni biologiche 1 . Questi eventi di segnalazione Ca 2+ vengono scatenati extracellulari attraverso diversi stimoli e controllati intracellulariamente dalle principali organelle di stoccaggio Ca 2+ e da numerose Ca 2+ pompe, canali e proteine ​​leganti Ca 2+ . I transitori Ca 2+ possono essere alterati in modo significativo a causa di difetti con la modulazione del segnale, portando a diverse malattie 2 . A causa della velocità e dell&#39;intricacy del sistema di segnalazione Ca 2+ , con il reticolo endo- (ER) e sarcoplasmatico (SR) al centro, sono necessarie sonde Ca 2+ geneticamente codificate che sono state ottimizzate per l&#39;espressione dei mammiferi con una rapida cinetica Per osservare i cambiamenti globali e locali di Ca 2+ in cellule diverse 3 . L&#39;ER e la SR, La sua controparte nelle cellule muscolari, sono i principali organoli di storage Ca 2+ intracellulari e fungono da pozzetti Ca 2+ che aiutano ad amplificare il segnale Ca 2+ 4 . L&#39;ER / SR è parte integrante della segnalazione Ca 2+ con doppio ruolo come trasmettitore e ricevitore di segnali 5 . Il recettore del ryanodine (RyR) e il recettore inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3 R) sono recettori di rilascio Ca 2+ situati sulle membrane del ER / SR regolate da Ca 2+ 6 . Altri agenti stimolano direttamente o indirettamente la funzione di questi recettori. 4-cloro-m-cresolo (4-cmc) è un potente agonista della RyR, con una sensibilità più alta di 10 volte rispetto alla caffeina per indurre la liberazione di SR Ca 2+, dove entrambi sono regolarmente impiegati per studiare la rilascio Ca 2+ mediata da RyR Cellule sane e malate 7 . ATP aumenta il Ca 2+ re mediato da IP 3Leasing attraverso il IP 3 R 8 . ATP si lega al recettore purinergico P2YR, un recettore accoppiato a proteine ​​G (GPCR), innescando la produzione di IP 3 che si lega all&#39;IP 3 R per rilasciare Ca 2+ dalla ER 9 , 10 . La pompa di calcio ATPase (SERCA) di tipo reticolare sarco-endoplasmatico è una pompa ATPasi tipo P, situata anche sulla membrana ER / SR che riduce la Ca 2+ citosolica e ricarica l&#39;ER / SR attivamente pompando lo ione nel lumen ER / SR 11 . Gli inibitori specifici della pompa SERCA includono thapsigargin, da Thapsia garganica e acido ciclopiazonico (CPA), da Aspergillus e Penicillium . La CPA ha una bassa affinità per la pompa e reversibilmente blocca il punto di accesso Ca 2+ 12 . Thapsigargin, d&#39;altro canto, si lega irreversibilmente alla pompa libera Ca 2+ al residuo F256 nell&#39;elica M3 con nanomoloAffinità 11 . Analizzare e quantificare i cambiamenti coinvolti negli eventi stimolati da Ca 2+ è stato e rimane una sfida. Dal momento che l&#39;ER / SR è il principale contenitore subcellulare Ca 2+ contenente una funzione centrale nella propagazione del segnale Ca 2+ , molti lavori sono stati focalizzati sulla comprensione del segnale ER / SR Ca 2+ 5 . La creazione di coloranti sintetici Ca 2+ ha contribuito a promuovere il campo e la pratica dell&#39;immagine Ca 2+ . Anche se i coloranti, come Mag-Fura-2, sono stati ampiamente utilizzati per misurare Ca 2+ compartimentalizzati in diverse cellule, 13 , 14 , 15 hanno limitazioni quali il caricamento di tinte non uniformi, la fotolibrazione e l&#39;incapacità di essere destinati a specifici organelli . La scoperta della proteina fluorescente verde (GFP) e l&#39;avanzamento delle proteine ​​fluorescenti-Sonde Ca 2+ ha spinto il campo di Ca 2+ in avanti 16 . Alcuni dei GECI esistenti sono coppie di trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) che coinvolgono la proteina fluorescente gialla (YFP), la proteina fluorescente cianica (CFP), il calmodulina e il peptide legante M13 17 , 18 . I GECI a base di Troponin C sono disponibili anche come coppia FRET di CFP e Citrine e come singole sonde di fluoroforo 19 , 20 , 21 . Altri, come GCaMP2 e R-GECO, sono singoli sensori fluorofori coinvolgenti la calmodulina 22 , 23 . Per superare le limitazioni della sintonizzazione stretta di K d e di legame cooperativo associato a più siti di legame Ca 2+ trovati nei loro domini 24 legati alla Ca 2+ , una nuova classe di calcio senI disordini sono stati creati progettando un sito di legame Ca 2+ sulla superficie del barile beta in una posizione sensibile al cromoforo di proteine ​​fluorescenti verde avanzate (EGFP) 25 , 26 . Questo sensore altamente protetto, chiamato CatchER, ha un K d di ~ 0,18 mM, ak vicino al limite di diffusione e ak off di 700 s -1 . CatchER è stato usato per monitorare il rilascio di calcio ER / SR mediato dal recettore in diverse linee cellulari di mammiferi come HeLa, HEK293 e C2C12 25 . A causa della sua rapida cinetica, CatchER è stato utilizzato in fibre muscolari flexor digitorum brevis (FDB) di topi giovani e vecchi Friend Virus B NIH Jackson (FVB) per rivelare che più Ca 2+ rimane nella SR dopo 2 s di depolarizzazione nella FDB Fibre di vecchi topi rispetto a quelli dei giovani topi 27 . Per superare la sua bassa fluorescenza a 37 ° C, che ostacola le sue applicazioni nell&#39;immagine del calcio di mammiferiAbbiamo sviluppato una versione migliorata di CatchER chiamata CatchER + . CatchER + mostra una migliore fluorescenza a 37 ° C per una migliore applicazione nelle cellule dei mammiferi. Ulteriori mutazioni sono state incorporate in CatchER per migliorare la termostabilità e la fluorescenza a 37 ° C 28 , 29 , per creare CatchER + . CatchER + mostra un aumento del suo rapporto segnale / rumore (SNR) di sei volte rispetto a CatchER 30 . Qui vengono presentati i protocolli per la cultura e la trasfezione delle cellule HEK293 e C2C12 con CatchER + e la sua applicazione per il monitoraggio dei transienti di calcio mediati dal recettore ER / SR. I risultati rappresentativi sono mostrati per CatchER + espresso in cellule HEK293 trattate con 4-cmc, CPA e ATP. Inoltre forniamo un protocollo per la determinazione del in situ K d di CatchER + in cellule miooblasto C2C12 e quaDi basale [Ca 2+ ].

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C55402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515DCXR dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>NC338059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>102382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>239805</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>41095-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &#38; Sealant</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) 
			tetraacetic Acid (EGTA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>409911000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;12-544B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4891</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>391340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil without autofluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Free Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-230-5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26GLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51985034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1565</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterivex-GV 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SVGVB1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Till Polychrome V Xenon lamp</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15090046</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

I transitori intracellulari di calcio (Ca 2+ ) evocati da stimoli extracellulari iniziano una moltitudine di processi biologici negli organismi viventi. Al centro del rilascio di calcio intracellulare sono i principali organici intracellulari di stoccaggio del calcio, il reticolo endoplasmatico (ER) e il reticolo sarcoplasmatico più specializzato (SR) nelle cellule muscolari. La liberazione dinamica del calcio da questi organelli è mediata dal recettore del ryanodine (RyR) e dall&#39;inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3 R) con ricarico che si verificano attraverso la pompa sarco / endoplasmatica calcio ATPase (SERCA). Un sensore di calcio geneticamente codificato (GECI) chiamato CatchER è stato creato per monitorare il rilascio rapido del calcio dalla ER / SR. Ecco i protocolli dettagliati per la trasfezione e l&#39;espressione del migliorato GECI CatchER + targeting ER / SR nelle cellule HEK293 e C2C12 e la sua applicazione nel monitoraggio del transitorio di calcio mediato dalla pompa IP 3 R, RyR e SERCAIn cellule HEK293 utilizzando microscopia a fluorescenza è descritto. L&#39;agonista del recettore o l&#39;inibitore della scelta è disperso nella soluzione della camera e i cambiamenti di intensità sono registrati in tempo reale. Con questo metodo si osserva una diminuzione del calcio ER con attivazione di RyR con 4-cloro-m-cresolo (4-cmc), l&#39;attivazione indiretta di IP 3 R con adenosina trifosfato (ATP) e l&#39;inibizione della pompa SERCA con ciclopiazonico Acido (CPA). Discutiamo anche i protocolli per la determinazione del K d in situ e la quantificazione basale [Ca 2+ ] nelle cellule C2C12. In sintesi, questi protocolli, usati in combinazione con CatchER + , possono elicitare il rilascio di calcio mediato dal recettore dalla ER con applicazione futura nello studio delle patologie correlate al calcio ER / SR.

Questa sezione illustrerà i risultati ottenuti utilizzando i metodi precedentemente descritti usando il GECI CatchER + mirato ER / SR mirato per monitorare i cambiamenti in ER / SR Ca 2+ attraverso diversi percorsi mediati dal recettore. La figura 1 illustra lo svuotamento ER attraverso il RyR stimolato con 200 μM di 4 cm. 4-cmc è un agonista del RyR. L&#39;aggiunta del farmaco induce una diminuzione del calcio ER come misurato dalla diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza di CatchER + . Come indicato, il protocollo qui descritto consente di visualizzare e misurare i transitori Ca 2+ mediati dal recettore utilizzando CatchER + che fornisce informazioni sulle modifiche di ER Ca 2+ . Come illustrato nella figura 2 , l&#39;aggiunta di 15 μM CPA, per bloccare reversibilmente la pompa SERCA, produce una notevole diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza che forma un plateau. Poiché la funzione della pompa SERCA è inibita, i canali di rilascio ER Ca 2+ stanno ancora liberando attivamente Ca 2+ nel citosolo causando una diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza. Le cellule recuperano dopo la lavaggio del CPA con il buffer di Ringer contenente 1,8 mM Ca 2+ e 10 mM di glucosio. Questi risultati confermano la capacità di CatchER + di monitorare i transitori Ca 2+ specifici della pompa SERCA. La Figura 3 mostra dati rappresentativi per l&#39;attivazione indiretta del IP 3 R con 200 μM ATP nelle cellule HEK293 trasfettate con CatchER + . L&#39;ATP si lega al recettore P2Y, un recettore accoppiato a G-proteina, che genera IP 3 che attiva la rilascio di Ca 2+ attraverso l&#39;IP 3 R. Anche se la modificaÈ piccolo, l&#39;aggiunta di 200 μM ATP produce una diminuzione visibile dell&#39;intensità del segnale. Il lavaggio delle cellule con il buffer di Ringer contenente 1,8 mM di Ca 2+ e 10 mM di glucosio consente all&#39;ER di ricaricare e il segnale per tornare alla linea di base. Questi risultati evidenziano la capacità di CatchER + di monitorare il rilascio di calcio mediato da IP 3 R tramite stimolazione indiretta. Nella figura 4 , CatchER + è stato trasfuso in cellule miooblasto C2C12 per determinare l&#39; in situ K d . I dati sono stati raccolti come descritto nel protocollo. Le cellule miooblasto C2C12 sono state permeabilizzate con 0,005% di saponina per 15-30 s poi lavate con 1 mM EGTA in buffer KCl contenente 10 μM ionomicina. Le varie concentrazioni di Ca 2+ sono state preparate in tampone KCl contenente 10 μM ionomicina e sono state aggiunte in modo graduale. I dati sono stati normalizzati e montati utilizzando il legame 1: 1L&#39;equazione. La media K d era di 3,1 ± 1,4 mM per 7 cellule. L&#39;affinità debole di CatchER + permette di sentire Ca 2+ in organi Ca 2+ elevati come ER o SR. Per determinare il basale [Ca 2+ ] nelle SR, le cellule C2C12 sono state permeabilizzate con 0,005% di saponin per 15-30 s, lavate con tampone KCl e poi lavate con 1 mM EGTA in tampone KCl contenente 10 μM ionomicina per ottenere F min . Dopo aver lavato l&#39;EGTA con un buffer KCl, è stato aggiunto un massimo di Fmax di 100 mM Ca 2+ con 10 μM ionomicina. Il basale Ca 2+ è stato calcolato per essere 0.4 ± 0.2 mM. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig1.jpg" /> Figura 1: Stimolazione di RyR utilizzando 4-cmc nelle cellule HEK293. ( A ) Rappresentazione dell&#39;attivazione di RyR con 4 cm. ( B ) Registrazione di intensità delle cellule HEK293Trasfettata con CatchER + , localizzata nell&#39;ER, trattata con 200 μM di 4 cm. La stimolazione del RyR con 4 cmc provoca una diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza normalizzata che direttamente correlata a una diminuzione di [Ca 2+ ] ER . N si riferisce al numero di celle immagazzinate. La diminuzione media del segnale è stata di 12,0 ± 2,2%. La presenza di 1,8 mM Ca 2+ nel tampone di Ringer ha facilitato il riempimento della ER riflessa nel recupero di intensità alla linea di base. Le immagini insetiche mostrano le cellule prima e dopo il trattamento con 4 cm. La SNR è stata calcolata per essere 4.3 ± 0.8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig2.jpg" /> Figura 2: Diminuzione di [Ca 2+ ] ER utilizzando il SERCA p. ReversibileInibitore CPA in cellule HEK293. ( A ) L&#39;inibizione della pompa SERCA da CPA. ( B ) L&#39;imaging in diretta di cellule HEK293 trasfettate con CatchER + , localizzate nell&#39;ER, trattate con 15 μM CPA. Poiché Ca 2+ può ancora fluire attraverso l&#39;IP 3 R e RyR, bloccando la pompa SERCA con CPA provoca una diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza normalizzata che direttamente correlata a una diminuzione di [Ca 2+ ] ER . N si riferisce al numero di celle immagazzinate. Le immagini insetti sono le cellule HEK293 trasfettate con CatchER + prima e dopo il trattamento. La diminuzione media del segnale è stata di 21,0 ± 0,3%. La presenza di 1,8 mM Ca 2+ nel tampone di Ringer ha facilitato il riempimento della ER riflessa nel recupero di intensità alla linea di base. La SNR è stata calcolata per essere di 5,5 ± 0,8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di</a>questa figura. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig3.jpg" /> Figura 3: ATP diminuisce [Ca 2+ ] ER nelle cellule HEK293. ( A ) Schema dell&#39;attivazione indiretta di IP 3 R con ATP attraverso il recettore purinergico P2YR. P2YR è un GPCR che genera IP 3 quando si lega ATP. L&#39;IP 3 attiva l&#39;IP 3 R, stimolando il rilascio del calcio dalla ER. ( B ) Imaging in tempo reale di cellule HEK293 trasfettate con CatchER + , localizzate nell&#39;ER, trattate con 200 μM ATP. La stimolazione indiretta dell&#39;IP 3 R attraverso il recettore P2Y con ATP provoca una diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza normalizzata che direttamente correlata a una diminuzione di [Ca 2+ ] ER . N si riferisce al numero di celle immagazzinate. La diminuzione media del segnale è stata di 6,0 ± 3,0%. SNR era cAlcullato per essere 6.7 ± 2.7. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig4.jpg" /> Figura 4: In situ K d di CatchER + in cellule miooblasto C2C12. Traccia rappresentativa per l&#39;intensità normalizzata raccolta da cellule miooblasto C2C12 permeabilizzate trasfettate con CatchER + . Le cellule sono state permeabilizzate con saponina 0,005% in tampone intracellulare per 15-30 s. Le soluzioni EGTA e Ca 2+ sono state preparate in tampone KCl, n si riferisce al numero di cellule immagazzinate. ( A ) Le immagini di fluorescenza insetiche rappresentano le cellule prima e dopo il trattamento. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 e 100 mM Ca 2+ è stato aggiunto alle cellule miooblasto C2C12 permeabilizzate in presenza di 10 μMIonomicina per ottenere un K d di 3,1 ± 1,4 mM. ( B ) Le immagini di fluorescenza in insetto rappresentano le cellule a valori minimi e massimi, dopo l&#39;aggiunta di 1 mM EGTA e 100 mM Ca 2+ rispettivamente con 10 μM ionomicina. Il basale Ca 2+ è stato calcolato per essere 0.4 ± 0.2 mM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Presentiamo protocolli per l&#39;applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER + per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K d in situ .

Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

monitoring-ersr-calcium-release-with-the-targeted-ca2-sensor-catcher

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

14.8K Views.  Georgia State University.  Presentiamo protocolli per l'applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER + per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K d in situ . 

Video: Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

Ricerca

Biologia

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

Caricamento terminazioni nervose Drosophila con gli indicatori di calcio

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

Imaging funzionale con rinforzo, eyetracking e monitoraggio fisiologico

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

Il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

Whole-Cell Registrazione del calcio Release-Activated di calcio (CRAC) Correnti in Human Linfociti T

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Vivere Imaging calcio cella Combinato con il silenziamento del gene mediata siRNA Identifica Ca 2 + Canali di perdite nella membrana ER e nei relativi meccanismi regolatori

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...