Estamos muy agradecidos a Chun-lan Hsu y Yu-Chi Yang para la preparación de la comida marcha y el mantenimiento de las poblaciones de moscas, y para Su-Ping Lee y el IMB Imaging Core por su ayuda con la microscopía confocal. Este estudio fue apoyado por becas a YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102 a 2321-B-001 -002, MOST 103 a 2311-B-001 -035 -MY3) del Consejo Nacional de Ciencia y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República de China.

Configuración 1. Pre-experimental <ol><li> Recoger un huevo de mosca que expresa la proteína verde fluorescente nuclear (GFP) bajo mδ0.5-Gal4 y de cultivo a 25 ° C durante 5 días. </li><li> Microondas 0,7 g de bajo punto de fusión de agarosa en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) hasta que la agarosa se disuelva completamente. Mantener el gel bajo punto de fusión 0,7% en una incubadora a 37 ° hasta su uso. </li><li> Esterilizar todo el equipo, incluyendo fórceps, tijeras, 42 mm cubreobjetos x 0,17 mm, una placa de punto de vidrio 9-bien, y una cámara de cultivo magnético, con 70% de etanol durante más de 12 h. </li><li> Preparar el medio de cultivo 3: medio Drosophila de Schneider suplementado con 2% de suero bovino fetal (FBS), 0,5% de penicilina-estreptomicina y 1,25 mg / ml de insulina. Para evitar la contaminación, preparar el medio en una campana de cultivo de células. Almacenar el medio de cultivo preparado a 4 ° C y se utiliza dentro de un mes. </li><li> Limpiar la plataforma de disección y el experimentador&#39;s manos con etanol al 70% antes de comenzar la disección. </li></ol> Disección 2. Disco <ol><li> Aire seco en todo el equipo de 70% de etanol. </li><li> Seleccione una larva de tercer estadio de un vial mosca. Para evitar la contaminación del vial mosca, lavar la larva en 1x PBS 3x para eliminar los residuos. </li><li> Diseccionar la larva limpiado en 1 ml de medio de cultivo (a temperatura ambiente) en la placa de punto de vidrio 9-bien bajo un microscopio de disección. </li><li> Agarre la larva con un par de pinzas en alrededor de un tercio de la distancia desde el extremo posterior y otros fórceps en el gancho de la boca. Tire de las dos pinzas en direcciones opuestas para liberar los tejidos internos. <ol><li> Retire las glándulas salivales, la grasa corporal, y la cutícula del complejo ojo-cerebro en el gancho de la boca. Si el cordón nervioso ventral está todavía conectado, se corta con tijeras. </li></ol></li><li> Utilice un par de pinzas para agarrar el gancho de la boca y un par de fórceps para retirar una pieza de tejido que connects los cerebros y discos de los ojos en la parte dorsal. NOTA: Si no se elimina este tejido, los dos discos de ojo-antenal estarán cerca uno del otro y el cerebro. Los discos de los ojos entonces no estar planos sobre el cubreobjetos porque este tejido, el cerebro, y el disco de ojo-antenal formarán un triángulo. </li><li> Girar todo el complejo a una posición ventral hacia arriba. Retire el filamento que conecta el gancho o el disco al cerebro. NOTA: Si no se elimina el filamento, el disco ojo-antenal se dividirá en dos piezas cuando se retira el gancho de la boca. <ol><li> Retire el gancho de la boca. Tenga cuidado de no dañar el ojo de disco durante el proceso. NOTA: El disco ojo es ahora libre en el medio y sólo conectado a cerebro por el tallo óptico. </li></ol></li></ol> 3. montaje <ol><li> Aire seco y montar los componentes de la cámara con un 42 mm x 0,17 mm cubreobjetos. Adjuntar una doble capa de juntas tóricas para el centro de la hoja de la cubierta para mantener ºe agarosa. </li><li> Montar la cámara con cubreobjetos. Ponga la 42 mm x 0,17 mm cubreobjetos sobre el aceptor etapa. Coloque la junta tórica de silicio sobre la hoja de la cubierta. Coloque la base. Bloquear el armario de sellado y colocar la cubierta (Figura 1). </li><li> transferir cuidadosamente el complejo ojo-cerebro diseccionado al centro de la junta tórica usando una micropipeta 20! l con una punta de 10-200 l. </li><li> Eliminar la mayor parte del medio y añadir 12 l de 0,7% de agarosa de bajo punto de fusión (a 37 ° C) a la muestra. NOTA: La posición del ojo de disco puede ser cambiada con unas pinzas antes de la solidificación de la agarosa. La agarosa se solidificará dentro de 5 min. <ol><li> Añadir 1 ml de medio de cultivo a temperatura ambiente al centro de la junta tórica; cada junta tórica puede cargar hasta 4 muestras. Asegúrese de que la agarosa se pega a la junta tórica para evitar la deriva de la muestra. NOTA: No se aireación o circulación del medio es necesario. </li></ol></li></ol>4. Microscopía Confocal <ol><li> Coloque la cámara sobre la platina de un microscopio confocal invertido durante 30 minutos para equilibrar la temperatura. Esto puede evitar que la deriva del eje Z durante la formación de imágenes. </li><li> Antes de imágenes en vivo a largo plazo, puede comprobar si el tejido está intacto por diferencial microscopía de contraste de interferencia. </li><li> Para evitar la fototoxicidad, utilice una fuente de láser por debajo de 2 mW. Utilice un objetivo de 40X para la imagen. </li><li> Adquirir 62 micras imágenes Z en pila en 12 min en un intervalo óptico de 1 m. Adquirir 40 ciclos de exploraciones en un total de 10 h. Asegúrese de que cada ciclo contiene 12 min de formación de imágenes y 3 min de reposo. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este estudio, proporcionar un protocolo detallado para un experimento de imágenes en vivo a largo plazo en los discos imaginales de Drosophila. Pasamos mucho tiempo practicando la disección cuidadosa para evitar el daño del disco y para permitir la fijación del disco cerca de los cubreobjetos. Tratamos de poli-L-lisina (PLL) y bajo punto de fusión de agarosa para mantener el tejido; al final, la agarosa de bajo punto de fusión mostró una mejor capacidad para mantener el tejido. Aunque se usó sólo el ojo disco en el presente documento para demostrar la ocurrencia normal de la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial durante el período de formación de imágenes en vivo 10 h, este método también se puede aplicar a al menos otro disco, el disco del ala, como se demuestra en una 3 estudio previo. Por otra parte, la preparación de medio de cultivo y la configuración de imágenes en vivo son simples y no requieren aireación o circulación del medio. imágenes en vivo continua puede proporcionar una clara secuencia temporal de la víspera biológicaNTS. En nuestro informe anterior de la diferenciación de células gliales y la migración en el ojo de disco, hemos proporcionado una prueba directa de que la glía envolver diferencian de glía existente después de migrar a la parte anterior del ojo disco 3. Cultivo a largo plazo ex vivo permite el etiquetado por láser activado específica de células, como la foto-conversión de la proteína fluorescente KAEDE, a seguir sus comportamientos 3. También puede acomodar el ensayo de productos químicos que se añaden directamente al medio de cultivo; Por lo tanto, se puede utilizar como una plataforma de cribado de fármacos. Dado que algunos proceso dinámico se produce en cuestión de minutos o segundos, se requiere una alta resolución temporal. Para mejorar la resolución temporal, microscopía de lámina de luz 15, 16 o girando la microscopía disco 17 puede ser una buena opción. La condición de la cultura actual no es perfecto. No es compatible con el crecimiento del disco. p celularroliferation sólo se admite para un máximo de 12 h 3. Después de 12 h en cultivo ex vivo, la tasa de diferenciación de los fotorreceptores comienza a disminuir 3. Esto puede ser debido a la falta de ciertos nutrientes u hormonas. Dado que la principal diferencia en este medio de cultivo es la alta concentración de la insulina, la insulina de mamífero puede ser parcialmente imitando la función de los péptidos endógenos similares a la insulina. La adición de extracto de mosca, el insecto trehalosa azúcar en la sangre, y diversas concentraciones de la hormona de la muda 20 hidroxiecdisona, no fueron beneficiosos 3. Sin embargo, el periodo de cultivo de 12-18 h es suficiente para estudiar muchos procesos de desarrollo. Métodos de cultivo alternativos para el cultivo de discos imaginales larvas se han comparado 3, y nuestra condición de cultivo y de imagen proporciona la ventana de tiempo más largo y claridad para imágenes en vivo. Aunque los discos dentro de larvas vivas y pupas se pueden visualizar directamente18, 19, 20, 21, 22, la ventana de resolución y el tiempo para las observaciones son limitados. Late larvas y pupas discos pueden cultivarse durante mucho tiempo 23, 24, pero los discos se someten a la morfogénesis significativo. Para aprovechar las ventajas de los discos de larvas planas, 2D, nuestro método de cultivo y la imagen es la mejor solución hasta el momento.

Los discos imaginales de Drosophila larvas han sido un sistema experimental favorecido para el estudio de una amplia variedad de mecanismos biológicos. Estos discos se invaginan desde el epitelio embrionario y se convierten en estructuras en forma de saco como construido por dos capas epiteliales, peripodial Epitelio (PE) y el disco adecuada (DP) 1, 2. Las células del disco imaginal proliferan y se diferencian progresivamente durante las etapas de larva y pupa y eventualmente se convierten en las estructuras del cuerpo adulto. Debido a la estructura de dos capas plana y simple de los discos imaginales, que son fáciles de observar cuando disecados de larvas. Sin embargo, a pesar de varios esfuerzos de muchos grupos, los métodos actuales para el cultivo a largo plazo de los discos imaginales no han sido satisfactorios. Recientemente hemos desarrollado un método de cultivo que pueda sostener el desarrollo normal de múltiples discos imaginales para un máximo de 18 horas y que permite obtener imágenes en vivo 3 </sarriba&gt;. El método de cultivo puede apoyar la diferenciación celular y la migración, pero que puede soportar la proliferación celular por sólo 7-12 h y no puede soportar el crecimiento del disco. La principal diferencia en el medio de cultivo es la alta concentración de insulina 3. El método es simple, y no se requiere aireación especial o circulación del medio. Uno de los discos imaginales mejor estudiados es el ojo de disco-antenal. El ojo de Drosophila se construye de aproximadamente 800 ommatidia. Cada ommatidium se compone de ocho células fotorreceptoras (R1-R8). En el disco ojo larval, las células fotorreceptoras diferenciar siguiendo el paso de la morfogenética Surco (MF), que barre a través del disco ojo de posterior a anterior 4, 5. Los fotorreceptores en un ommatidium diferencian en secuencia, comenzando con R8, seguido por R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, y R7 6. El ommatidia en el dorsal y VEmitades ntral del disco ojo se someten a una rotación de 90 ° en direcciones opuestas, lo que resulta en quiralidad opuesta 7, 8. El proceso de rotación se produce en dos etapas: primero, una rotación de 45 ° comienza en y se completa en el sexto ommatidia fila detrás de la MF; la segunda rotación de 45 ° se completa en alrededor de fila 16 9, 10. Este estudio utilizó rotación ommatidial, marcado por el R3 / 4-específica mδ0.5-GA4 11, para demostrar la diferenciación celular normal y la dinámica que puede ser observado a través de este método a la cultura y vivir-imagen del disco ojo.

<table><tbody><tr><td>Low-melting agarose</td><td>AMRESCO&amp;nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm cover slips&amp;nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Culture chamber&amp;nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 Cell Cultivation System</td></tr><tr><td>40X objective</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fly strain:nls.GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

Imágenes en vivo ofrece la posibilidad de rastrear continuamente los procesos celulares y de desarrollo dinámicos en tiempo real. Drosophila discos imaginales de larvas se han utilizado para estudiar muchos procesos biológicos, tales como la proliferación celular, la diferenciación, el crecimiento, la migración, la apoptosis, la competencia, la señalización célula-célula, y la formación de límite compartimental. Sin embargo, los métodos para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales no han sido satisfactorios, a pesar de muchos esfuerzos. Recientemente, hemos desarrollado un método para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales para un máximo de 18 h. Además de utilizar una alta concentración de insulina en el medio de cultivo, una agarosa de bajo punto de fusión también se utilizó para incrustar el disco para evitar que la deriva durante el período de formación de imágenes. Este informe utiliza los discos ojo-antenal como un ejemplo. expresión mδ0.5-GA4 / 4-específica de fotorreceptores R3 se siguió para demostrar que fotorreceptor differenciación y rotación ommatidial pueden ser observados durante un período de formación de imágenes en vivo 10 h. Este es un protocolo detallado que describe este método simple.

<html> En este ejemplo, los fotorreceptores R3 / R4 se marcaron con mδ0.5-GA4 para monitorizar la diferenciación de los fotorreceptores. mδ0.5-GA4 impulsa fuerte expresión en R4 y la expresión más débil en R3 11, por lo que es un excelente marcador para R3 y R4, así como para el proceso de rotación ommatidial. En la película 1, R3 y R4 se marcaron con GFP. Al comienzo de la 10 h sesión de formación de imágenes en vivo, había 8 filas de grupos ommatidial (Figura 2A y de película 1) y 14 filas de grupos ommatidial en el extremo (Figura 2B). La tasa de diferenciación ommatidial fue de 1,67 h por fila, que está cerca de la velocidad de 1,5-2 h / fila de discos en vivo 7, 8, 9, 10, 11,s = &quot;xref&quot;&gt; 12, 13, 14. Sobre la base de las posiciones relativas de R3 y R4, rotación ommatidial ocurrió en el disco ex vivo se cultivaron durante de imágenes en vivo (Figura 2A &#39;A &#39;&#39;, B&#39;, y B &#39;&#39;). Un clúster sola R3 / R4 se marcó con una esfera blanca en el primer fotograma de la película 2. En el principio, el eje R3 / R4 parece ser perpendicular al ecuador (Figura 2C y Película 2). A continuación, parece girar 15 °, 30 °, y 45 ° en 3 (Figura 2C &#39;), 6 (Figura 2C &#39;&#39;), y 9 (Figura 2C &#39;&#39;&#39;) h, respectivamente. Estos datos sugieren que este método puede sostener la diferenciación de los fotorreceptores durante la proyección de imagen en directo 10 h. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figure 1: Diagrama esquemático de conjunto de la cámara. Diagrama esquemático del conjunto de la cámara: (1) Coloque el cubreobjetos unido-O-ring de doble capa en el aceptor etapa. (2) Colocar la junta tórica de silicio sobre la hoja de la cubierta. (3) Colocar la base. (4) Bloquear el armario de sellado. (5) Cargar la muestra en el centro de la junta tórica y coloque la cubierta. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Figura 2: imágenes en vivo de R3 / R4 Diferenciación y Rotación. R3 / R4 marcado con mδ0.5-Gal4 expresando-forma nuclear GFP durante 10 h de formación de imágenes en vivo. Todas las figuras se capturaron a partir de la película 1. (A) La imagen captada por el principio. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A &quot;) Imagen ampliada del área de la caja a la izquierda ( A &#39; ) y derecha ( A&quot; ). ( B ) Imagen tomada al final del período de 10 h. ( B&#39;-B ) Imagen ampliada del área de la caja de la izquierda ( B &#39; ) y la derecha ( B &quot; ). ( CC &#39;&#39; &#39; ) Un solo par R3 / R4 (marcado con una flecha en A&#39;) se sigue a través del tiempo para mostrar la rotación del par R3 / R4. Barras de escala = 15 μm, 10 μm y 5 μm en A, B y C, respectivamente. Todas las figuras son proyecciones z de intensidad máxima. La escala de tiempo se muestra en h: min. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Película 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Película 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Haga clic aquí para descargar esta película. <img alt="película 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Película 1: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K vistas.  National Yang-Ming University.  Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa. 

Video: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biología

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

Una novela RFP reportero para ayudar en la visualización del disco imaginal del ojo en Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imágenes en vivo extendidas de la morfogénesis de las patas de la pupa de Drosophila sin pupario

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Descubriendo estructuras epiteliales dinámicas durante el desarrollo de Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

A largo plazo de imágenes en vivo

Resumen

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Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos