Riconosciamo il sostegno offerto dai laboratori e dalla struttura animale dell&#39;Istituto di Neurofisiologia. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Walter und Marga Boll-Stiftung, dalla Köln Fortune e dalla Deutsche Stiftung für Herzforschung.

La manipolazione degli animali deve essere conforme alle linee guida del comitato locale per la protezione degli animali e alla direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo. 1. Preparare soluzioni <ol><li> Preparare la soluzione di Tyrode senza Ca 2+ (composizione in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl2 1, glucosio 10, HEPES 5, 2,3-butanedione monoxime (BDM) 30. Regolare il pH a 7,4 Con NaOH a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di Tyrode con Ca 2+ (composizione in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl2 1, glucosio 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl2 0,9. Regolare il pH a 7,4 con NaOH a 4 ° C. </li><li> Preparare agarosio a basso contenuto di fusione al 4%: inserire 0,6 g di agarosio a bassa percentuale di fusione in soluzione di Tyrode da 15 ml senza Ca 2+ . Scaldare la miscela in un forno a microonde due volte a 750 W per 10-15 s finché l&#39;agarosio non si scioglie. Tenere la soluzione a una temperatura costante di 37 &amp;# 176; C e mescolare continuamente. </li><li> Mantenere il Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) senza siero a 37 ° C in bolle con carbogeno (5% CO 2 , 95% O 2 ). </li></ol> 2. Preparare il Microtomo <ol><li> Accendere il microtomo. </li><li> Riempire la camera esterna del microtomo con ghiaccio. </li><li> Riempire la camera interna del microtomo con la soluzione di Tyrode ghiacciata senza Ca 2+ e continuamente ossigenare la soluzione con 100% O 2 . </li><li> Mettere una lamiera d&#39;acciaio nel porta-lama del microtomo. </li></ol> 3. Isolamento del cuore del mouse <ol><li> Iniettare 2,500 U di eparina sottocutanea. Attendere 15 min. </li><li> Sacrificare l&#39;animale per dislocazione cervicale. </li><li> Apri il petto con la sternotomia. </li><li> Separare con attenzione il pericardio usando piccole forbici e una pinza # 5. </li><li> Inserire una cannula nell&#39;arto ascendente e perfezionare le arterie coronarie in situ con Tyrode&#39;s ghiaccio freddoSoluzione senza Ca 2+ fino a rimuovere il sangue rimanente. </li><li> Rescondare delicatamente il cuore con una pinza e forbici e trasferire il cuore in soluzione fredda di Tyrode, guidata senza Ca 2+ . </li><li> Separare l&#39;atria dai ventricoli con un bisturi o forbici. </li></ol> 4. Incorporazione dei ventricoli in agarosio a basso contenuto di fusione del 4% <ol><li> Posizionare i ventricoli con l&#39;apice rivolto verso l&#39;alto nello stampo agarosio ( Figura 1 ). Posizionare il perno in mezzo dello stampo nella camera ventricolare sinistra. </li><li> Riempire lo stampo con agarosio a basso contenuto di fusione al 4% a 37 ° C, finché il cuore non sia completamente coperto. </li><li> Posizionare lo stampo sul ghiaccio per una tempra più rapida dell&#39;agarosio che impedisce il galleggiamento del tessuto. </li><li> Rimuovere il blocco di agarosio contenente i ventricoli dallo stampo con un bisturi. </li><li> Girare il blocco capovolto e riempire le camere ventricolari e il divario sul retro del blocco agarosio, cheS lasciata dal perno del molt, con agarosio a basso contenuto di fuso al 4% utilizzando una siringa con un ago da 20 G. </li><li> Tagliare il blocco di agarosio con uno scalpello per ottenere un fondo piatto del blocco e in posizione verticale dell&#39;apice cardiaco. </li></ol> 5. Sezione del tessuto ventricolare <ol><li> Fissare il blocco sul supporto del campione del microtomo con una goccia di colla cianoacrilato. Affrontare l&#39;apice cardiaco verso l&#39;alto. </li><li> Posizionare il supporto del campione nella camera del campione interno del microtomo, che è riempito di Tyrode senza ghiaccio senza Ca 2+ . Completamente coprire il blocco di agarosio con la soluzione di Tyrode. </li><li> Preparare le fette di asse corto a uno spessore di 150-400 μm, a seconda dell&#39;ulteriore applicazione (per registrazioni di elettrodo nitido 150-200 μm), mantenere la frequenza di vibrazione della lama a 60-70 Hz e spostare la lama in avanti in modo più lento possibile . </li><li> Utilizzare una spazzola fine per rimuovere attentamente l&#39;agarosio residuo dalle fette. </li><li> Trasferisce delicatamenteR sezioni con una pipetta Pasteur nella soluzione Tyrode con 0,9 mM Ca 2+ aerata con 100% O 2 e conservarle per almeno 30 minuti in ghiaccio per recuperare dalla procedura di affettatura. </li><li> Successivamente, tenere le fette per 30 minuti in DMEM a 37 ° C, aerata con carbogeno, per lavare BDM prima dell&#39;uso successivo. </li></ol> 6. Preparazione dell&#39;installazione dell&#39;elettrodo Sharp <ol><li> Per il pre-riscaldamento, accendere tutti i dispositivi elettrici 30 minuti prima che le registrazioni inizieranno. </li><li> Mettere un piatto di coltura da 3 cm sulla piastra riscaldante posta sul microscopio invertito. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo ad anello su misura ( figura 2 ) nel piatto e collegare i fili di messa a terra del preamplificatore e dell&#39;elettrodo di stimolazione. </li><li> Collegare i tubi flessibili del sistema di perfusione al piatto. </li><li> Riempire il serbatoio del sistema di perfusione con DMEM, aerato con carbogeno. </li><li> Accendere la pompa di perfusione e impostare la perfusioneTe a 2-3 ml / min. </li><li> Regolare la temperatura del DMEM nel piatto a 37 ° C regolando il riscaldatore di flusso e la piastra riscaldante. </li></ol> 7. Potenziali registrazioni di azione <ol><li> Mettere una fetta ventricolare nel piatto riempito con DMEM. </li><li> Controllare l&#39;integrità strutturale e la vitalità (sulla base della funzione contrattile) del tessuto con il microscopio invertito. </li><li> Riempire un elettrodo di vetro di registrazione con 3 M KCL. </li><li> Riempire un elettrodo di stimolazione con DMEM. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo di registrazione e l&#39;elettrodo di stimolazione sui supporti degli elettrodi. </li><li> Posizionare con cura l&#39;elettrodo di stimolazione sulla fetta e accendere lo stimolatore elettrico. Inizia con una frequenza di stimolazione di 1-2 Hz. </li><li> Spostare l&#39;elettrodo di registrazione con il micromanipolatore sulla posizione di registrazione desiderata. </li><li> Abbassare lentamente l&#39;elettrodo di registrazione fino a quando la punta tocca il tessuto. </li><li> Applicare un breve impulso elettrico rettangolare attraverso laL&#39;elettrodo di registrazione per penetrare nella membrana cellulare. </li><li> Riposizionare con cautela l&#39;elettrodo di registrazione fino a garantire un segnale stabile. </li><li> Avviare la registrazione dei potenziali di azione. </li></ol>

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	<li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro.">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+tissue+slices+as+a+tool+to+predict+metabolism+of+novel+drugs.">Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiopulmonary+toxicity+of+peat+wildfire+particulate+matter+and+the+predictive+utility+of+precision+cut+lung+slices.">Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices.</a> Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).</li><li>Nembo, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+chronotropic+effects+of+Erythrina+senegalensis+DC+(Fabaceae)+aqueous+extract+on+mouse+heart+slice+and+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+slices+from+adult+mammalian+hearts+as+a+model+for+pharmacological+drug+testing.">Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).</li><li>Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recordings+on+rat+cardiac+muscle+slices.">Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices.</a> Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).</li><li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation.">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).</li><li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+heart+slices.+A+robust+model+to+study+ventricular+isometric+contractions.">Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions.</a> Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts--a+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies.">Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+maturation+and+integration+of+murine+fetal+cardiomyocytes+after+transplantation.">Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation.</a> Circ. Res. 101, 484-492 (2007).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+electrophysiological+maturation+and+integration+of+transplanted+cardiomyocytes.">Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+persistence+and+electrical+integration+of+transplanted+fetal+cardiomyocytes+from+different+developmental+stages.">Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages.</a> Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li><li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2,3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes.">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+2,3-butanedione+monoxime+(BDM)+on+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes.">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li><li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development.">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li><li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage:+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Le fetture ventricolari consentono studi elettrofisiologici, farmacologici e meccanici con una struttura tissue preservata in vivo e accesso diretto della tecnologia di misura a tutte le regioni del cuore. Le proprietà del potenziale fisiologico di azione sono state dimostrate in fette embrionali, neonatali e adulti 9 , 10 , 11 . La vitalità delle fette, ad eccezione degli strati superficiali direttamente danneggiati dalla procedura di affettamento, è stata confermata dalla colorazione della vitalità 9 . Le registrazioni potenziali di azione all&#39;interno delle fette usando elettrodi di vetro taglienti possono essere utilizzati per indagare l&#39;integrazione e la maturazione dei cardiomiociti trapiantati come descritto qui, o per studi farmacologici dopo l&#39;aggiunta di composti cardioattivi. Sono possibili registrazioni a lungo termine con durata di un&#39;ora o più in una singola cellula. Questa durata della registrazione è sufficiente per verificareL&#39;impatto dei diversi composti farmacologici su una cellula per perfusione sequenziale e lavaggio. Fasi di preparazione critiche Per ottimizzare la qualità della fetta, evitare danni ai tessuti ischemici. Pertanto, la perfusione del cuore in situ con la soluzione di Tyrode, la resezione rapida del cuore e la conservazione immediata nella soluzione di tyrode ossigenata con ghiaccio freddo sono considerati cruciali. L&#39;immobilizzazione del cuore battente utilizzando il 2,3-butanedione monoxime può ulteriormente ridurre la suscettibilità all&#39;ischemia ed è necessaria per un incorporamento solido in agarosio a bassa fusione. Incorporare in agarosio a bassa scienza potrebbe ostacolare l&#39;offerta di tessuti limitando la diffusione, ma è essenziale per stabilizzare il tessuto cardiaco morbido prima di affettare. Piccole cavità all&#39;interno del blocco del campione, ad es. Camere ventricolari non completamente riempite con agarosio o residui di bolle d&#39;aria, potrebbero ostacolare la stabilizzazione dei tessuti. Il tessuto miocardico non stabilizzato non offre resistenza sufficienteLa lama vibrante, che provoca gravi disturbi e danni ai tessuti. Per garantire un taglio chiaro e per ridurre al minimo i danni ai tessuti, le lame devono essere taglienti ( vale a dire non riutilizzate più di tre volte) e il movimento in avanti della lama attraverso il blocco del campione dovrebbe essere il più lento possibile, in quanto le lamierine o l&#39;overspeeding Ventricoli incorporati o lacerazione del tessuto. Per garantire risultati affidabili e riproducibili, la qualità delle fette dovrebbe soddisfare criteri specifici, tra cui l&#39;integrità strutturale del tessuto, che può essere confermata dalla microscopia e la risposta alla stimolazione elettrica a frequenze fisiologiche di battimento fino a 10 Hz. Le fette possono essere tagliate a uno spessore di 150-400 μm a seconda dell&#39;applicazione. Mentre le fette più sottili possono prevenire le condizioni ipossiche nel nucleo del tessuto e consentire una più facile individuazione delle cellule trapiantate con un microscopio a fluorescenza e un posizionamento più preciso diGli elettrodi di registrazione 15 , le fette più spesse possono fornire una migliore integrità della struttura del tessuto e una maggiore stabilità del tessuto, che sarà vantaggioso per le misure di forza 10 e l&#39;ulteriore trattamento istologico dopo le registrazioni. Per prevenire potenziali influssi di concentrazioni elevate di BDM sui canali ionici e sulle proteine ​​di trattamento Ca 2+ 16 , 17 , lavaggio BDM mediante incubazione di fette in DMEM libero da BDM per almeno 30 minuti prima di essere ulteriormente impiegato. Sorprendentemente, la contrazione e il successivo movimento del tessuto dopo il lavaggio BDM non ostacolano registrazioni di elettrodo nitide. limitazioni In contrasto con i modelli comuni di coltura delle cellule, le fette offrono una struttura intatta del tessuto, tra cui cellule elettriche e meccaniche conservate a connessioni cellulari, matrici extracellulari e distribuzione di cardiomiocchiTes e non miociti all&#39;interno del tessuto nativo 6 . Tuttavia, le fette di tessuto cardiaco non corrispondono esattamente alla situazione in vivo , in quanto sono di spessore di soli 150-400 μm, fornite da un mezzo artificiale e potrebbero essere danneggiate durante il processo di preparazione. La colorazione del Trypan blu e la valutazione immunohistologica del frammento attivo di caspasi-3 e PARP p85 hanno rivelato che le cellule in fette embrionali, ad eccezione di quelle degli strati superficiali, erano vitali dopo l&#39;affettatura 9 . Il sistema di conduzione non è conservato in fette ventricolari, e la diffusione dell&#39;eccitazione è piuttosto tridimensionale rispetto a tridimensionale nelle fette piatte. Le fette di cuori embrionali mostrano una battuta spontanea fino a due settimane nella cultura 9 . Possono verificarsi anche contrazioni spontanee di fette adulte e non è chiaro se siano indotti da cellule del sistema di conduzione o possono indicare danni cellulari e Ca 2+ overlOad 18 . Applicazioni future Oltre agli studi elettrofisiologici con elettrodi taglienti e matrici di microelettrodi che possono essere utilizzati per esperimenti farmacologici per analizzare l&#39;impatto dei farmaci sulle proprietà potenziali di azione e sulla diffusione di eccitazione 11 , studi di sviluppo 19 o caratterizzazione dei cardiomiociti trapiantati 15 come mostrato in precedenza, fette ventricolari di neonatali I cuori sono stati utilizzati per misure di contrazione della forza 10 , che potrebbero essere applicate anche a fette adulte. Ulteriori potenziali applicazioni future includono (I) studi a lungo termine di microscopia in fette coltivate, per esempio per valutare l&#39;integrazione strutturale dei cardiomiociti derivanti da cellule staminali iniettate, (II) iniezione di coloranti periferici di giunzione delle giunzioni all&#39;accoppiamento intercellulare studiato o (III) studi di endoteliali E la funzione vascolare della coronaImbarcazioni all&#39;interno delle fette. In conclusione, le fetture ventricolari sono un valido modello di tessuto multicellulare con struttura conservata in vivo , che può aiutare a superare le limitazioni dei modelli comuni di coltura cellulare e sono applicabili ad una vasta gamma di studi farmacologici, fisiologici, di sviluppo e di terapia cellulare.

Le fette di tessuto sottile sono state utilizzate frequentemente nella scienza di base poiché Yamamot e Mcllwain hanno mostrato nel 1966 che l&#39;attività elettrica delle fette del cervello è mantenuta in vitro 1 . Da allora, studi elettrofisiologici e farmacologici sono stati condotti su fette da cervello 2 , fegato 3 , polmone 4 e tessuto miocardico 5 , 6 , 7 . Le prime registrazioni di patch-clamp in fette ventricolari da cuori di ratto neonatale sono state descritte nel 1990 8 , ma questa tecnica è caduta nell&#39;oblio per un certo tempo. Più di un decennio più tardi, il nostro gruppo ha stabilito un nuovo metodo per preparare le embrioni murine 9 , le neonate 10 e le 11 fette di cuore adulte. Queste fette di tessuto vitale possono essere utilizzate per esperimenti acuti (fetta adultaS possono essere coltivati ​​per diverse ore) o esperimenti di coltura a breve termine (fette embrionali e neonatali possono essere coltivate per alcuni giorni). Le fette mostrano in vivo caratteristiche elettrofisiologiche simili e una diffusione di eccitazione omogenea valutata con potenzialità di azione dell&#39;elettrodo acuto e registrazioni a matrice di microelettrodi 11 . Grazie alla loro morfologia &quot;bidimensionale&quot;, consentono l&#39;accesso diretto degli elettrodi di registrazione a tutte le regioni del ventricolo, che li rende uno strumento interessante per le indagini elettrofisiologiche e solleva nuove opzioni sperimentali rispetto ai cuori interi perfezionati da Langendorff. La risposta del farmaco delle fette ai bloccanti del canale ionico come verapamil (bloccante canale L-tipo Ca 2+ ), lidocaina (bloccante Na + -cannel), 4-aminopiridina (bloccante K + -kanelare dipendente dalla tensione non selettiva) e linopirdina (KCNQ K + - blocco canale) 9 , 11 </suP&gt; corrispondevano a effetti noti sui cardiomiociti dissociati. Le misure di forza isometrica hanno rivelato una relazione positiva di frequenza di forza e suggerito fortemente la funzione contrattuale intatta 10 . Questi risultati hanno dimostrato che le fettine ventricolari murine sono adatte come un modello di tessuto in vitro per studi fisiologici e farmacologici. Inoltre, le fetture ventricolari di cuori riceventi in combinazione con registrazioni di elettrodo nitide hanno dimostrato di essere uno strumento molto utile per caratterizzare l&#39;integrazione elettrica e meccanica, nonché la maturazione dei cardiomiociti fetali 12 , 13 e 14 trapiantati. In sintesi, le fetture ventricolari sono un prezioso e ben consolidato modello di tessuto multicellulare e devono essere considerati complementari ai cardiomiociti dissociati e ai cuori perfezionati da LangendorffNella ricerca cardiovascolare, con il grande vantaggio di fornire una struttura tissutale in vivo (in contrasto con le cellule dissociate), nonché l&#39;accesso diretto delle tecnologie di misura come le registrazioni di elettrodo nitido a tutte le regioni del cuore (in contrasto con i preparati cardiaci interi).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>Microtome with vibrating blade.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blades</td><td>Campden Instruments, Loughborough, England</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Fine brush, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; size 6 (4/32&quot;)</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Preparation table</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>Molt for embedding ventricles in agarose</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4`` Needles</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2`` Needles</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small scissor</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen gas (medical grade O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbogen gas (95 % O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-melt Agarose</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplifier</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low magnification Micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>High magnification, three-axis micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic perfusion pump</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2-channel temperature controller</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Square pulse stimulator</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

murine short axis ventricular heart slices for electrophysiological studies

Cardiomiociti murini sono stati ampiamente utilizzati per studi in vitro di fisiologia cardiaca e nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, le preparazioni multicellulari di cardiomiociti dissociati non rappresentano la struttura complessa in vivo di cardiomiociti, non miociti e matrice extracellulare, che influenza sia le proprietà meccaniche che elettrofisiologiche del cuore. Qui descriviamo una tecnica per preparare fette ventricolari vitali di cuori adulti con un tessuto tissutale in vivo e dimostrare la loro idoneità alle registrazioni elettrofisiologiche. Dopo l&#39;escissione del cuore, i ventricoli vengono separati dall&#39;atria, perfezionati con soluzione Ca 2+ -libera contenente 2,3-butanedione monoxime e incorporati in un blocco agarosio a basso contenuto di fusione al 4%. Il blocco è posto su un microtomo con una lama vibrante, e fettine di tessuto con uno spessore di 150-400 μm sono preparate mantenendo la vibrazione freDella lama a 60-70 Hz e spostare la lama in avanti in modo più lento possibile. La spessore delle fette dipende dall&#39;ulteriore applicazione. Le fette vengono conservate in soluzione di Tyrode ghiacciata con 0,9 mM Ca 2+ e 2,3-butanedione monoxime (BDM) per 30 minuti. Successivamente, le fette vengono trasferite a 37 ° C di DMEM per 30 minuti per lavare il BDM. Le fette possono essere utilizzate per studi elettrofisiologici con elettrodi taglienti o matrici di microelettrodi, per misurare le forze per analizzare la funzione contrattile o per indagare l&#39;interazione tra i cardiomiociti derivanti dalle cellule staminali trapiantati e il tessuto ospite. Per registrazioni di elettrodo nitide, una fetta viene posta in un piatto di coltura da 3 cm sulla piastra riscaldante di un microscopio invertito. La fetta è stimolata con un elettrodo unipolare e potenziali d&#39;azione intracellulari di cardiomiociti all&#39;interno della fetta sono registrati con un elettrodo di vetro nitido.

L&#39;infarto miocardico porta ad una perdita praticamente irreversibile di cardiomiociti. La terapia sostitutiva cellulare che utilizza cardiomiociti derivanti da cellule staminali per la rigenerazione cardiaca esogena è un approccio terapeutico promettente. L&#39;integrazione elettrica e la maturazione delle cellule trapiantate sono fondamentali per la sicurezza e l&#39;efficienza della terapia sostitutiva delle cellule. Per valutare l&#39;integrazione e la maturazione, abbiamo trapiantato cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCM; 2 iniezioni di 0,5 x 10 6 iPSCM / 10 μL) che esprimono una maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) nei cuori sani di topi adulti (vedi Peinkofer et al. Per una descrizione dettagliata dei metodi 15 ). Sei giorni dopo il trapianto, fette ventricolari di cuori riceventi sono state preparate usando il protocollo descritto. Viene visualizzata una registrazione rappresentativaFigura 3. Una fetta contenente iPSCM trapiantato è stata collocata in DMEM a 37 ° C e focalizzata a stimolo da un elettrodo unipolare collocato nel tessuto ospite ( figura 3A , sinistra). I potenziali d&#39;azione intracellulari sono stati registrati con microelettrodi di vetro taglienti pieni di 3 M KCl in iPSCM trapiantato positivo eGFP e il tessuto ospite vicino nelle fette ( Figura 3A , a destra). La persistenza e l&#39;integrazione elettrica di iPSCM trapiantati nei cuori riceventi potrebbero essere dimostrati. IPSCM sono stati considerati elettricamente integrati, se fosse presente un&#39;interdipendenza temporale di artefatti e potenziali di azione stimolati intracellulariamente nei cardiomiociti trapiantati ( Figura 3B ). La qualità dell&#39;integrazione elettrica potrebbe essere quantificata dal ritardo dell&#39;attivazione elettrica, vale a dire il ritardo tra lo stimolo e l&#39;inizio del thE la massima frequenza di stimolazione senza blocchi di conduzione, vale a dire la frequenza di stimolazione massima che porta ad una generazione di potenzialità d&#39;azione di 1: 1 dopo ogni stimolo. IPSCM trapiantati in questo esperimento rappresentativo sono stati integrati elettricamente, come indicato da una frequenza di stimolazione massima senza blocchi di conduzione di circa 5 Hz ( Figura 3B , a destra), ma la qualità dell&#39;accoppiamento non era tanto buona quanto all&#39;interno del tessuto ospite come indicato dalla più lunga Ritardo tra artefatto di stimolazione e salto potenziale d&#39;azione (tessuto ospite: 8 ms; iPSCM: 20 ms). Le potenzialità d&#39;azione dei cardiomiociti ospitanti avevano 84 mV di ampiezza, -74 mV potenziale diastolico massimo, durata di 11 ms a repolarizzazione del 50%, durata di 108 ms a repolarizzazione del 90% e velocità di salita di 114 V / s. L&#39;aumento della frequenza di stimolazione da 1 a 5 Hz porta ad una diminuzione del potenziale di azione duratIon a 90% repolarizzazione (86 ms). IPSCM trapiantato ha mostrato differenze significative nelle proprietà del potenziale di azione. In confronto alle cellule ospite, l&#39;ampiezza era minore (53 mV), potenziale diastolico massimo negativo (-54 mV), durata a 50% repolarizzazione aumentata (14 ms), durata a 90% repolarizzazione più breve (90 ms) e velocità di salita Più lento (57 V / s). Un aumento della frequenza di stimolazione da 1 a 5 Hz ha causato una diminuzione della durata del potenziale d&#39;azione al 90% di repolarizzazione (67 ms). In conclusione, in questo esempio rappresentativo a 6 giorni dopo il trapianto, iPSCM analizzato mostrava caratteristiche tipiche di cardiomiociti immaturi. Questo risultato aneddotico è in linea con le misurazioni in un numero statisticamente sufficiente di cellule e preparati, che sono stati riportati prima del 15 . <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig1.jpg" /> Figura 1: </Strong&gt; Stampo su misura per l&#39;inserimento di ventricoli in agarosio. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig2.jpg" /> Figura 2: Elettrodo ad anello su misura (messa a terra) per le registrazioni degli elettrodi Sharp. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig3.jpg" /> Figura 3: Integrazione elettrica del iPSCM trapiantato . ( A ) Fetta ventricolare del cuore (a sinistra) contenente iPSCM positivo eGFP (a destra). SE:Elettrodo di stimolazione. Punti rossi contrassegnano la posizione delle registrazioni. ( B ) Registrazioni potenziali di azione nei tessuti sani dell&#39;ospite (tracce superiori) e iPSCM trapiantati (tracce inferiori). La fetta è stata stimolata focalizzata con un elettrodo di stimolazione collocato nel tessuto ospite a circa 2 Hz (tracce di sinistra) e 5 Hz (tracce di destra). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Qui descriviamo la preparazione di fette ventricolari vitali da topi adulti e il loro utilizzo per registrazioni potenziali di azione elettrodo. Queste preparazioni multicellulari forniscono una struttura tissutale conservata in vivo , che li rende un prezioso modello per studi elettrofisiologici e farmacologici in vitro .

Fette di cuore ventricolare dell&#39;asse corto dell&#39;urina per gli studi elettrofisiologici

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.3K Views.  University of Cologne.  Qui descriviamo la preparazione di fette ventricolari vitali da topi adulti e il loro utilizzo per registrazioni potenziali di azione elettrodo. Queste preparazioni multicellulari forniscono una struttura tissutale conservata in vivo , che li rende un prezioso modello per studi elettrofisiologici e farmacologici in vitro . 

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Ricerca

Bioingegneria

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Medicina

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Biologia

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or bradycardia. Reliable identification of cardiac pacemaking defects requires the measurement of intrinsic heart rates by largely preventing the influence of the autonomic nervous system, which can mask rate deficits. Traditional methods to analyze intrinsic cardiac pacemaker function include drug-induced autonomic blockade to measure in vivo heart rates, isolated heart recordings to measure intrinsic heart rates, and sinoatrial strip or single-cell patch-clamp recordings of sinoatrial pacemaker cells to measure spontaneous action potential firing rates. However, these more traditional techniques can be technically challenging and difficult to perform. Here, we present a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate by performing microelectrode array (MEA) recordings of whole-mount sinoatrial node preparations from mice. MEAs are composed of multiple microelectrodes arranged in a grid-like pattern for recording in vitro extracellular field potentials. The method described herein has the combined advantage of being relatively faster, simpler, and more precise than previous approaches for recording intrinsic heart rates, while also allowing easy pharmacological interrogation.

This protocol aims to describe a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate using microelectrode array recording of the whole sinoatrial node tissue to identify pacemaking defects in mice. Pharmacological agents can also be introduced in this method to study their effects on intrinsic pacemaking.

Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Generation of Porcine Ventricular Slices: A Vibratome-based Technique to Prepare Ultra-thin Slices of Pig Heart Tissue

Source: Ou, Q. et. al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60913">Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based procedure to generate viable, ultra-thin sections of pig heart. The prepared tissue slices can be cultured and used as model systems for pharmacological testing.

Generazione di fette ventricolari suine: una tecnica basata sul vibratomo per preparare fette ultrasottili di tessuto cardiaco di maiale

Source: Ou, Q. et. al., Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based ...

Fette di cuore ventricolare dell'asse corto dell'urina per gli studi elettrofisiologici

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Mappatura ottico dei potenziali d'azione e transitori Calcio nel Cuore mouse