PUC19N, oligonucleotidi contenenti CPD e p44 sono stati gentilmente forniti da Samuel Wilson, Korbinian Heil e Thomas Carell, e rispettivamente da Gudrun Michels e Caroline Kisker. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 e TE-671/4 a IT.

<ol>
	<li>Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machines+of+DNA+repair:+scanning+force+microscopy+analysis+of+their+architecture.">The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture.</a> J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+bending+and+unbending+by+MutS+govern+mismatch+recognition+and+specificity.">DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).</li><li>Tessmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+MutS+searching+for+DNA+mismatches+and+signaling+repair.">Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.</a> J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).</li><li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer.">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li><li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility.">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li><li>Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD50+and+NBS1+form+a+stable+complex+functional+in+DNA+binding+and+tethering.">RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering.</a> Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).</li><li>Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+volumetric+methods+for+the+characterization+of+proteins+and+nucleic+acids.">AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids.</a> Methods. 60, 113-121 (2013).</li><li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+binding+of+single-stranded+DNA-binding+protein+to+its+target.">Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target.</a> Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).</li><li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition.">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li><li>Kuper, J., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+recognition+in+nucleotide+excision+DNA+repair.">Damage recognition in nucleotide excision DNA repair.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).</li><li>Buechner, C. N., Tessmer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+substrate+preparation+for+atomic+force+microscopy+studies+of+protein-DNA+interactions.">DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions.</a> J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).</li><li>Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+RecG+Helicase+at+the+DNA+Replication+Fork+by+SSB+Protein.">Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein.</a> Sci. Rep. 5, 9625 (2015).</li><li>Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+DNA+transcription+using+atomic+force+microscopy.">Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy.</a> Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).</li><li>Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+and+an+activator+form+discrete+subcomplexes+in+a+transcription+initiation+complex.">RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex.</a> EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).</li><li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).</li><li>Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+UvrB,+a+DNA+helicase+adapted+for+nucleotide+excision+repair.">Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair.</a> EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).</li><li>Kuper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+TFIIH,+XPD+helicase+is+exclusively+devoted+to+DNA+repair.">In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair.</a> PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).</li><li>Shlyakhtenko, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silatrane-based+surface+chemistry+for+immobilization+of+DNA,+protein-DNA+complexes+and+other+biological+materials.">Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials.</a> Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).</li><li>Roth, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPB+helicase+regulates+DNA+incision+by+the+Thermoplasma+acidophilum+endonuclease+Bax1.">XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1.</a> DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).</li><li>Ratcliff, G. C., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Single-Molecule+Study+to+Determine+Protein-Protein+Association+Constants.">A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).</li><li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules:+MutS-DNA+interactions.">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li><li>Caron, P. R., Grossman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+a+cryptic+ATPase+activity+of+UvrB+and+its+proteolysis+product,+UvrB*+in+DNA+repair.">Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair.</a> Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UvrB+domain+4,+an+autoinhibitory+gate+for+regulation+of+DNA+binding+and+ATPase+activity.">UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity.</a> J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).</li><li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging.">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li><li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB.">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li><li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation.">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li><li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands.">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li><li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes:+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition.">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li><li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair.">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Analisi statistiche AFM di posizioni di legame di proteine ​​su lunghi frammenti di DNA che contengono siti target specifici possono rivelare dettagli interessanti sulle strategie particolari impiegate dalla proteina per riconoscere questi siti 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Per interpretare le distribuzioni di posizione risultanti, le posizioni degli obiettivi nel DNA devono essere conosciute con precisione. Ciò è ottenuto introducendo siti specifici in posizioni di sequenza ben definite nel DNA plasmidico circolare e tagliando un frammento del DNA compreso questo sito specifico, utilizzando la tecnologia di restrizione enzimatica. Nelle analisi di AFM delle posizioni di legame delle proteine ​​possono essere inclusi solo frammenti di DNA con lunghezze corrette (in linea con la piena lunghezza del frammento tagliato), perché solo per questi è nota la posizione del sito di destinazione. Vale la penaChe la procedura di preparazione qui descritta produce substrati lineari di DNA con due estremità di frammenti indistinguibili. Le distribuzioni di posizione possono pertanto essere misurate e tracciate da 0 x lunghezza del DNA (proteine ​​legate alla fine del frammento di DNA) fino a 0,5 x lunghezza del DNA (proteine ​​legate al centro dei frammenti). Inoltre, per le posizioni di bersaglio che non si trovano esattamente al centro del substrato, queste distribuzioni contengono sempre un piccolo fondo di proteine ​​non specificamente associate alla stessa distanza dall&#39;altra estremità del DNA. Tuttavia, il montaggio di una curva gaussiana alla distribuzione distribuita sulla base dell&#39;altezza media di sfondo (proteine ​​legate in modo non specifico, figura 3 ) rappresenta questi complessi. In alternativa, una delle estremità del DNA può essere etichettata, ad esempio con piccoli picchi di volume dalla struttura secondaria che crea sgargianti ssDNA 24 . I limiti di risoluzione tipici di queste analisi di posizione sono nell&#39;intervallo di 100 volte la preferenza di target siOltre il legame non specifico del sito. Inoltre, i frammenti del DNA finiscono non costituiscono siti non specifici dsDNA, ma rappresentano invece interruzioni di dsDNA. Le proteine ​​di riparazione del DNA spesso si legano a queste finestre di frammento destabilizzate, oltre ai siti specifici di destinazione specifici introdotti internamente. Il legame del DNA può essere rivelato mediante analisi AFM e può fornire importanti informazioni sulla funzione di una proteina. Se il legame del DNA finale non è al centro dell&#39;interesse, queste posizioni possono essere comunque facilmente omesse dalle distribuzioni di posizione iniziando le trame in una posizione&gt; 0 ( es . Qui 0,02 lunghezze del DNA). Uno dei vantaggi particolari e, in effetti, la proprietà comune e definita delle tecniche di singola molecola è la risoluzione di singoli stati diversi presenti in un campione che possono possedere proprietà e attività molto diverse. Anche nei casi in cui la particolare specie di interesse possa essere solo infrequente in un campione, questi approcci consentono cosìConcentrarsi separatamente su questa specie i cui contributi sarebbero rimasti in una misura di insieme. Per i campioni di proteine, per esempio, l&#39;imaging AFM consente la distinzione diretta tra diversi tipi di complessi proteici basati su un volume complesso, se le dimensioni delle singole proteine ​​differiscono sufficientemente (limiti di risoluzione tipici sono di circa 20 kDa) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . I sistemi AFM possono essere calibrati per consentire la traduzione dei volumi misurati in peso molecolare di proteine ​​(Protocollo 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . In alternativa, le norme proteiche con dimensioni noti sono state utilizzate come riferimento diretto nelle immagini 1 , 6 . NelSistema focalizzato su di essi, posizioni vincolanti sul DNA potrebbero quindi essere determinate separatamente per il XPD monomerico inattivo dell&#39;elicasina e per i complessi XPD / p44 eterodimerici attivi con elicasi. Collegamento preferenziale a un sito di lesione in una posizione ben definita nel DNA riconosciuto dalla lesione del DNA da un complesso proteico. Poiché i siti di caricamento delle proteine ​​e lesioni venivano separati spazialmente, la traslocazione del DNA era un requisito necessario per il riconoscimento delle lesioni nei substrati del DNA qui impiegati. Solo i complessi eterodimeri XPD / p44 erano in grado di traslocazione del DNA ( Figura 3 ), coerenti con i risultati dei test di attività di elicasi 9 . L&#39;analisi del volume di AFM può quindi fornire importanti informazioni sulle attività differenziali di forme complesse di proteine. L&#39;interazione e il riconoscimento della lesione da parte del complesso XPD / p44 attivo con elicasi hanno determinato una maggiore legatura nel sito di destinazione a causa della stallo della traslocazione di elicasi ( Figura 3 </strong&gt;). È interessante notare che la variazione della posizione del sito di carico rispetto alla posizione della lesione ha determinato il riconoscimento della lesione da XPD prevalentemente quando il caricamento è avvenuto 5 &#39;dalla lesione per gli addotti ingombranti di fluoresceina, ma quando il carico è avvenuto 3&#39; dalla lesione per l&#39;unica piccola danneggiamento del DNA lesione. A causa della 5&#39;-3 &#39;direzionale di XPD helicase (vedi schema in figura 3 ), questa constatazione indica che l&#39;enzima rileva preferibilmente la fluoresceina sul filo traslocato, ma CPD preferibilmente sul filo opposto, non traslocato. L&#39;elicottero NER prokaryotico UvrB, invece, ha preferenzialmente riconosciuto sia le lesioni di fluoresceina che CPD al momento del caricamento da 5 &#39;dalla lesione, cioè sul filo traslocato ( Figura 3 ). Queste differenze distintive nelle loro proprietà di riconoscimento delle lesioni possono essere intese dalle diverse proprietà strutturali delle due elicasi. UvrB interagisce con i potenziali bersagli iN il DNA attraverso residui di aminoacidi all&#39;interno di una caratteristica β-forcella nell&#39;enzima dietro la quale il filo traslocato è probabilmente filettato 16 , 25 . XPD, d&#39;altro canto, ospita un piccolo poro in prossimità di un cluster di ferro-zolfo (FeS) 26 . Il filo di DNA ricostituito probabilmente attraversa questo poro 26 . Le lesioni più complesse come la fluoresceina possono bloccare la traslocazione di elicasi mediante interazioni con i residui all&#39;interno di questo poro, mentre meno lesioni CPD ingombranti possono essere identificate più facilmente attraverso interazioni con il cluster FeS. Nel sistema prokaryotico, si crede che due molecole di UvrB siano coinvolte nella ricerca di un sito di destinazione in un complesso UvrA 2 -UvrB 2 etero-tetramerico in cui ciascuno dei due monomeri UvrB è in grado di indagare un diverso filamento di DNA 27 . XPD in eucariotica NER probabilmente esiste come una singola copia nellaComplesso di riconoscimento della lesione TFIIH. La flessibilità negli approcci di interazione lesionica dell&#39;enzima eucariotica può pertanto essere necessaria per consentire il riconoscimento dello spettro di siti target estremamente ampio del sistema di riparazione NER. Dato che i fotogrammi AFM possono essere distinti in base ai loro posizionamenti sul DNA, i singoli complessi specifici possono essere analizzati separatamente e confrontati. La singola molecola AFM è uno degli approcci molto pochi che consentono di accedere alle proprietà strutturali di complessi proteici legati non specificamente al DNA a causa della loro natura spesso transienti o variabili. Qui, i cambiamenti conformazionali sul riconoscimento del sito di destinazione sono stati visualizzati e caratterizzati in XPD arcaico basato sulla flessione introdotta nel DNA dall&#39;enzima. I dati AFM hanno rivelato un piccolo ma distinto e significativo spostamento negli angoli di curvatura del DNA per il rilascio di XPD in un sito di lesione rispetto a XPD legato al DNA nonspecifico 5 . conformazionaleI cambiamenti nelle proteine ​​legate al DNA sull&#39;identificazione del sito di destinazione probabilmente innescano l&#39;assunzione delle endonucleasi NER (XPG e XPF in eucariotica NER) che effettuano l&#39;escissione di un breve tratto di ssDNA contenente la lesione. È interessante notare che questo cambiamento e quindi la riorganizzazione conformazionale hanno richiesto l&#39;associazione di ATP all&#39;enzima (ma non all&#39;idrolisi). Un approccio analogo di ATP-rebinding su identificazione del sito di destinazione e successivo reclutamento di endonucleasi UvrC è stato riportato per UvrB in prokaryotic NER 28 , 29 . In sintesi, l&#39;imaging a singola molecola AFM ha rivelato sottili differenze nel riconoscimento del sito di destinazione da parte delle elicasi NER prokaryotiche e eucariotiche. Una volta che una lesione target è stata identificata dagli enzimi, condividono una strategia simile di reclutamento delle endonucleasi NER mediante re-arrangiamenti conformazionali indotti da ATP in modo selettivo alla lesione. La tecnica di AFM in comBination con attento disegno del substrato del DNA per imitare le proprietà essenziali del sistema esaminato può quindi fornire informazioni sulle interazioni di siti di destinazione di non solo la riparazione del DNA, ma i sistemi proteici legati al DNA in generale. Le informazioni strutturali su complessi specifici e non specifici con risoluzioni nel campo di bassa nanometro (a livello molecolare, limitate dalla sonda AFM) possono contribuire in modo significativo alla comprensione dei meccanismi coinvolti.

La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica potente per l&#39;analisi delle interazioni proteine-DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Richiede solo basse quantità di materiale di campionamento per visualizzare direttamente campioni eterogenei con una risoluzione a livello di singola molecola. L&#39;eterogeneità può derivare da diversi stati conformazionali o oligomerici di una proteina. In particolare, nel contesto di campioni di proteine-DNA, i complessi proteici possono mostrare diverse stoichiometrie e / o conformazioni indotte dal legame del DNA in generale o che si legano ad un sito target specifico all&#39;interno del DNA. I campioni eterogenei possono anche contenere due (o più) diversi tipi di proteine ​​e diversi complessi proteiciForme ( ad esempio , costituite da un solo tipo di proteine ​​contro complessi eteromerici) possono interagire in modo diverso con il DNA. Gli studi qui discussi sfruttano l&#39;imaging AFM in aria su campioni statici e secchi di proteine ​​di riparazione del DNA legate a lunghi frammenti di DNA (~ 900 base paia, bp) che contengono una lesione che rappresenta un obiettivo di queste proteine. L&#39;elevata risoluzione molecolare di AFM consente di distinguere tra diversi tipi di complessi proteici e di determinare le posizioni di legame delle proteine ​​sui frammenti del DNA. Importante, le lesioni vengono introdotte nei substrati del DNA a posizioni ben definite. Poiché la posizione del sito di lesione nel DNA è nota, le distribuzioni di proteine ​​legate al DNA forniscono una visione delle proprietà di riconoscimento delle diverse lesioni (differenti) dei complessi proteici (diversi), ad esempio , quanto bene riconoscono un particolare tipo di lesione A DNA non danneggiato) 2 , 3 , <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 4 , 5 , 6 . Le loro posizioni sul DNA permettono anche la distinzione tra i complessi proteici legati specificamente alle lesioni e ai complessi legati in modo non specifico altrove sul DNA. La caratterizzazione separata di questi diversi tipi complessi (complessi legati specificamente al complesso lesionario o non specifico) possono rivelare potenziali variazioni conformazionali nei complessi indotti dall&#39;identificazione del sito di destinazione. Le proteine ​​di riparazione del DNA concentrate qui sono le elicasi che sono responsabili del riconoscimento delle lesioni nel percorso di riparazione delle escisioni del nucleotide (NER). Nei batteri, il NER è ottenuto dalle proteine ​​UvrA, UvrB e UvrC. UvrA è responsabile della rilevazione iniziale delle lesioni in un complesso di scansione DNA di UvaA 2 / UvrB 2 . Alla verifica della lesione da UvrB questo complesso si converte in UvrB monomerico legato al sito della lesione e questo complesso specifico può quindi reclutare la pRocaryotic NER endonucleasi UvrC. UvrC eccisce un breve tratto (12-13 nt) di DNA a singolo filamento (ssDNA) contenente la lesione. Il tratto mancante viene poi riempito dalla DNA polimerasi. Infine, la ligasi DNA sigilla il tratto appena sintetizzato con il DNA originale 9 , 10 . Negli eucarioti, la maggior parte delle proteine ​​della cascata NER fa parte del complesso multimerico di trascrizione II H (TFIIH). Dopo la rilevazione iniziale della lesione attraverso il complesso trimerico CEN2-XPC-HR23B, TFIIH viene reclutato nel sito di destinazione del DNA. Quando XPD all&#39;interno del complesso verifica la presenza di una lesione target NER, le endonucleasi eerichee NER XPG e XPF vengono reclutate per accusare un breve tratto (24-32 nt) di ssDNA contenente la lesione 9 , 10 . Qui, in particolare, sono state studiate le elicasi UvrB e XPD da NER prokaryotico e eucariotico. Queste elicasi richiedono una regione non distinta nellaDNA (una bolla del DNA) per filettare su uno dei due singoli filamenti del DNA e successivamente traslocare lungo questa fili alimentata da idrolisi ATP. Oltre alle lesioni del DNA, una bolla del DNA è stata quindi introdotta nei substrati che funge da luogo di caricamento per le proteine. La procedura per la preparazione di substrati specifici del DNA della lesione è stata descritta in precedenza 11 . Richiede un costrutto circolare del DNA (plasmide) con due siti di restrizione strettamente distanziati per un nickase. Nel contesto di questo studio è stato utilizzato il plasmide pUC19N (2729 bp) (creato dal laboratorio di S. Wilson, NIEHS). Questo plasmide contiene tre siti di restrizione strettamente distanziati per la nickel Nt.BstNBI che costituiscono un tratto di 48 nucleotidi (nt). Dopo l&#39;incubazione con il nickase, il tratto di ssDNA tra questi siti può essere rimosso e sostituito da un oligonucleotide contenente qualsiasi caratteristica di destinazione. Dopo ogni passaggio, la digestione enzimatica completa viene testata mediante gel agarosioelettroforesi. Il DNA circolare nichelato può essere distinto a causa della sua minore mobilità elettroforetica rispetto al plasmide originale supercoiled. Lo scorrimento del DNA e la sostituzione del tratto rimosso con l&#39;oligonucleotide specifico del substrato possono essere valutati tramite la digestione con un enzima di restrizione che incide il substrato esclusivamente all&#39;interno della regione tra i nicchie. La linearizzazione del plasmide circolare da parte dell&#39;enzima verrà quindi soppressa per il DNA scompattato e ripristinato dopo l&#39;inserimento del oligonucleotide specifico. Infine, due siti di restrizione endonucleasi (idealmente taglienti singoli) consentono la generazione di un substrato lineare del DNA, con lunghezza come desiderato e con il sito target specifico in una posizione definita, nonché una bolla del DNA a distanza dalla lesione in 5 &#39;O 3&#39; direzione. Il riconoscimento delle lesioni da parte delle elicasi NER può essere studiato tramite l&#39; imaging AFM. La traslocazione del DNA degli alligati a tIl sito della lesione è visibile come un picco nella distribuzione della posizione proteica sul DNA e indica il riconoscimento della lesione. Poiché la traslocazione del DNA di queste elicasi è inoltre direzionale, con polarità 5&#39;-3 &#39;, la dipendenza del riconoscimento della lesione sulla posizione del sito di carico (bolla del DNA a monte oa valle della lesione) indica anche se la lesione è preferenzialmente riconosciuta Sullo strato ssDNA traslocato o al contrario, non traslocato , 5 , 9 . Nelle sezioni seguenti vengono introdotti i metodi utilizzati e saranno discussi brevemente i principali risultati di questi esperimenti. Importante, analogo al lavoro esemplare sulla riparazione del DNA mostrato qui, l&#39;imaging AFM può essere applicato allo studio di diversi sistemi interattivi del DNA, come la replicazione del DNA o la trascrizione 8 , 12 , 13 , 14 </sup&gt;.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Molecular Force Probe (MFP) 3D</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>N/A</td>
			<td>atomic force microscope (AFM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision 390</td>
			<td>DELL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer and 1.5 ml block</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>heat block for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotilabo Block-Heater H 250 &#38; blocks for 0.5 ml tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Y264.1 &#38; Y267.1</td>
			<td>heat block for protein-DNA incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td>
			<td>1704467</td>
			<td>electrophoresis chamber with gel caster and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac Basic</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td>
			<td>1645050</td>
			<td>electrophoresis power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centifuge 5415 D with rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2262120-3</td>
			<td>table centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15</td>
			<td>Ultralum</td>
			<td>900-1322-02</td>
			<td>UV irradiation table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>UV spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TKAX-CAD with 0.2 &#956;m capsule filter</td>
			<td>Unity Lab Services</td>
			<td>N/A</td>
			<td>water deionization and filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFP software on Igor Pro</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AFM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (open source Java image processing)</td>
			<td>NIH Image</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel (Microsoft Office)</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin9 / Origin2016</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>statistical data analysis and graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMCL-AC240TS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OMCL-AC240TS</td>
			<td>AFM cantilevers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grade V-5 muscovite</td>
			<td>SPI Supplies</td>
			<td>1805</td>
			<td>mica sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell</td>
			<td>Millipore Ireland Ltd.</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td>centrifuge filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Extract II&#160;</td>
			<td>&#160;Macherey-Nagel GmbH</td>
			<td>740 609.250</td>
			<td>Agarose gel extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotilabo cellulose paper type 111A</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>AP59.1</td>
			<td>AFM deposition blotting paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatop 25 (0.02 &#956;m)</td>
			<td>Whatman GmbH</td>
			<td>6809-2102</td>
			<td>syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSpI, BspQI</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R0132, R0712</td>
			<td>restriction enzymes for DNA substrate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI, BglII</td>
			<td></td>
			<td>R0146, R0144</td>
			<td>restriction enzymes for DNA preparation controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nicking restriction enzyme Nt.BstNBI</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R0607</td>
			<td>nickase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4855, 9105</td>
			<td>buffer chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957, HN03, HN02, P026</td>
			<td>salt chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td>32318</td>
			<td>salt chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, TCEP, EDTA</td>
			<td></td>
			<td>6908, HN95, 8040</td>
			<td>chemicals/reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose, acetic acid, HCl</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>2267, 3738, K025</td>
			<td>reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#404;S</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-406</td>
			<td>nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K054</td>
			<td>nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide #1 in Table 1</td>
			<td>Biomers</td>
			<td>custom</td>
			<td>complementary DNA oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>custom</td>
			<td>fluorescein containing oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides #4&#160; and #5 in Table 1</td>
			<td>private (available from e.g. TriLink or GlenResearch)</td>
			<td></td>
			<td>CPD containing oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.704 and 72.706</td>
			<td>incubation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x concentrate gel loading dye purple</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>51406</td>
			<td>DNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green&#160;</td>
			<td>Nippon Genetics Europe GmbH</td>
			<td>999MG28055</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy investigations of dna lesion recognition in nucleotide excision repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.

Distinguere tra diversi tipi complessi basati su volumi complessi di proteine L&#39;attività elicolare dell&#39;elicasica NER prokaryotica UvrB è stimolata dal legame del DNA 22 , 23 . UvrB richiede una regione non distinta nel DNA (una bolla del DNA) per caricare correttamente su uno dei due singoli fili di ssDNA. In vivo , questa struttura del DNA è fornita dalle interazioni del DNA attraverso un&#39;altra proteina della cascata NER; In esperimenti in vitro , la bolla può essere introdotta artificialmente in frammenti dsDNA in prossimità di una lesione target. Le interazioni proteico-proteiche aumentano anche il legame del DNA con UvrB 9 . Tuttavia, una volta che UvrB è caricato sul DNA, la sua attività non sembra dipendere dai co-fattori proteici 9 . Al contrario, l&#39;elicottero eucariotico NER XPD richiede interazioneOn con la proteina p44, che come XPD fa parte del complesso multi-subunità di trascrizione IIH (TFIIH) in vivo , per l&#39;attivazione della sua attività di elicasi, ma questa interazione non influenza il legame di XPD al DNA 17 . Si prevede che solo XPD si caricherà sul DNA a una bolla del DNA, ma non si trasloca alla lesione (in assenza del suo co-fattore di attivazione di elicasi). XPD senza p44 non deve pertanto essere in grado di interagire con l&#39;identificazione della lesione quando viene caricata a distanza dal sito della lesione. Le incubazioni di XPD con p44 in presenza di lesioni contenenti il ​​substrato del DNA comportano un mix di complessi XPD o XPD / p44-DNA (e possibilmente una specie minore di p44 da sola legata al DNA). Per analizzare separatamente il riconoscimento delle lesioni da XPD / p44 e XPD, questi diversi tipi complessi possono essere distinti in base ai loro volumi nelle immagini AFM ( Figura 2 ) 9 , come descritto nel precedente protocollo 3.1. I sistemi AFM possono essere calibrati utilizzando una gamma di pRotelle con peso molecolare noto per rivelare una relazione lineare tra il volume AFM e la massa molecolare approssimativa di una proteina (complesso) 20 , consentendo un&#39;interpretazione dei volumi misurati. Le posizioni di legame sul DNA potrebbero quindi essere determinate separatamente per XPR monomerico inattivo elicasi (~ 95 kDa, coerente con le ~ 100 nm 3 specie di classe 2 in Figura 2 ) e per complessi XPD / p44 attivi con elicasi (~ 135 kDa, ~ 150 nm 3 specie di classe 3), in base ai diversi volumi AFM. Determinazione del riconoscimento delle lesioni dalle posizioni di legame delle proteine ​​sul DNA Qui sono stati impiegati substrati di DNA lunghi (916 bp) contenenti una lesione a ~ 30% della lunghezza del DNA. Il controllo sulla posizione esatta della lesione all&#39;interno del substrato del DNA consente la distinzione tra specifici (legati alla lesione, al 30% della lunghezza del DNA)(Ricerca della lesione) complessi dipendenti dalle loro posizioni sul DNA. Sono state scelte due diverse lesioni, che sono obiettivi di NER; I substrati del DNA contenevano o un addotto di fluoresceina (F) o un dimero di pirimidina ciclobutano (CPD). Oltre al sito della lesione, il DNA conteneva una regione non associata (8 nt bolla del DNA) che serviva come luogo di carico per le elicasi. Questo sito di caricamento era situato a una distanza di 26 nt (per i substrati del DNA contenente F) o 23 nt (per i substrati contenenti CPD) 5 &#39;o 3&#39; dalla lesione (vedi tabella 1 ). Il riconoscimento delle lesioni porta alla translocazione staminale del DNA degli elicasi UvrB e XPD nel sito di destinazione, apparente nella distribuzione della posizione della proteina AFM sul DNA come picco alla posizione della lesione. Le posizioni della lesione e delle bolle in questi substrati non possono per se distinguersi entro i limiti di risoluzione dell&#39;immagine AFM (&lt;10 nm di distanza). Tuttavia, la frazione di complessi specifici che rappresenta l&#39;aIl supporto di molecole bloccate alla lesione e indica il riconoscimento delle lesioni dipende fortemente dal fatto che la lesione sia stata posizionata 3 &#39;o 5&#39; dalla bolla ( figura 3 ) 9 . Dalla frazione di complessi del sito specifico (area sotto il picco di misura Gaussian rispetto all&#39;area del background vincolato non specificamente) è stata calcolata la specificità, S, UvrB e XPD per i due tipi di lesioni investigati (cfr. Protocollo 3.2 sopra). Per UvrB, il carico di 5 &#39;dalla posizione della lesione ha determinato specifiche più elevate (S B, F5 ~ 200 e S B, CPD5 ~ 400) rispetto al carico 3&#39; dalla lesione (S B, F3 e S B, CPD3 ~ 100) Entrambi i tipi di lesione. Per XPD sono stati distinti complessi che contengono solo XPD (classe 2 in figura 2 ) e complessi contenenti XPD così come la proteina co-fattore p44 (classe 3 in figura 2 ) che attiva l&#39;elicasiNella sezione precedente. I picchi di proteina della classe 2 (solo XPD, elicasi inattivi) non localizzarono preferenzialmente nei siti di lesione indipendentemente dal fatto che siano stati caricati 5 &#39;o 3&#39; e indipendenti dal tipo di lesione (dati non mostrati). Al contrario, le distribuzioni di posizione per i complessi XPD / p44 (classe 3) hanno mostrato una maggiore legame alle lesioni F per caricare 5 &#39;dalla lesione (S XPD / p44, F5 ~ 300 versus S XPD / p44, F3 ~ 100) Lesioni per il caricamento 3 &#39;dalla lesione (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 contro S XPD / p44, CPD5 ~ 100, Figura 3 ). Poiché UvrB e XPD sono 5&#39;-a-3 &#39;elicasi, questi dati forniscono informazioni su se i complessi sono bloccati attraverso interazioni con la lesione all&#39;interno del filo di ssDNA che essi traslocano (lo strato traslocato, per caricare 5&#39; dalla lesione) O all&#39;interno del fusto opposto, non traslocato (per il caricamento 3 &#39;dalla lesione). Il concetto è schematicamente illustrato in <stroNg&gt; Figura 3. È interessante notare che questi dati indicano perciò che il riconoscimento specifico si è verificato preferenzialmente sul filo traslocato indipendentemente dal tipo di lesione per UvrB, ma su diversi fili per XPD / p44 dipendenti dal tipo di lesione. Le lesioni di F bulky sono state rilevate preferenzialmente da XPD sul filo traslocato, ma le uniche lesioni del CPD distorte del DNA dolcemente sul lato opposto, non traslocato. Indagare i cambiamenti conformazionali sulla identificazione delle lesioni da XPD La misurazione della curvatura introdotta nel DNA sul sito dei complessi legati da immagini AFM (vedi Protocollo 3.3 sopra) può rivelare importanti informazioni sulle modifiche complesse conformazionali. Gli angoli di curvatura del DNA sono stati misurati per XPD 5 arcaico, che non richiede un&#39;interazione co-fattore di proteine ​​per l&#39;attività di elicasi. In questi studi, una lesione fluoresceina era localizzata direcNel contesto di una bolla del DNA per una maggiore carica delle proteine ​​alla lesione, a ~ 30% della lunghezza del frammento di DNA. La figura 4 mostra i parametri Gaussiani per le distribuzioni di angolo di curvatura del DNA ottenute per i complessi proteici a posizioni non specificate (non danneggiate) del DNA e al ~ 30% della lunghezza del DNA, coerenti con il rilascio di XPD alla posizione della lesione fluoresceina (complessi specifici). I dati dimostrano un angolo di curvatura media di ~ 50 ° per complessi non specifici contro ~ 65 ° per complessi specifici. Questo spostamento dell&#39;angolo della curva del DNA era dipendente dalla presenza di ATP o di ATP, indicando che l&#39;ATP (re-) legame, ma non l&#39;idrolisi, era necessaria per i riarrangiamenti conformazionali 5 . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55501/55501fig1.jpg" /> Figura 1: Preparazione dei substrati del DNA. Un divario di ssDNA viene introdotto nel DNA plasmidico circolare premendo il plasmide (qui con il nickname N.BstNBI) a cloE rimuovere il tratto di ssDNA incluso mediante filtrazione da centrifuga dopo destabilizzazione del calore in presenza di un eccesso di oligonucleotide complementare. Un oligonucleotide specifico contenente la caratteristica di scelta può quindi essere annealed e legato nella regione gap. Infine, la digestione con gli enzimi di restrizione (qui con SspI e BspQI) produce un substrato lineare di DNA con la caratteristica di bersaglio in una posizione ben precisa (qui al 30% della lunghezza del frammento di DNA). I controlli di controllo consentono di testare le singole fasi (sotto riportate) mediante elettroforesi con agarosio (freccia nera indica 3000 bp). Il nicking può essere testato dalla alterazione della mobilità elettroforetica del DNA circolare (controllo di battuta, corsia 2), inatteso e rilassato, rispetto al plasmide supercoppiato (corsia 1). La completa eliminazione del DNA e l&#39;inserimento successivo dell&#39;oligo specifico possono essere testati mediante digestione con un enzima di restrizione che taglia nella regione di gap (qui: XhoI, inLe corsie 2, 4 e 6) in modo che una mancanza di incisione del DNA indichi la formazione di spazi (corsie 1,2 nicked DNA, corsie 3,4 DNA colpite) e l&#39;incisione riposizionata indica l&#39;inserimento dell&#39;oligo specifico (corsie 5,6) . Il substrato lineare finale che contiene la caratteristica specifica può essere purificato dal gel dopo l&#39;elettroforesi del gel agarosio e testato per omogeneità e purezza tramite l&#39; imaging AFM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55501/55501fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55501/55501fig2.jpg" /> Figura 2: Distinguere diversi tipi complessi dai volumi AFM. ( A ) AFM di XPD / p44-DNA (freccia grigia) e XPD-DNA (freccia nera) complessi. ( B ) Esempi di tre diversi tipi di complessi legati al DNA, interpretati come p44 o semplici sovrastrutture del DNA (classe 1),XPD (classe 2, frame nero) e XPD / p44 (classe 3, struttura grigia) basati sui volumi AFM (mostrati a destra). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55501/55501fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55501/55501fig3.jpg" /> Figura 3: Differenti strategie di riconoscimento delle lesioni delle elicasi NER prokaryotiche e eucariotiche. La traslocazione competente del DNA di riconoscimento delle lesioni dalle elicasi NER UvrB e XPD (in complesso con il suo co-fattore di attivazione di elicasi p44) richiede il caricamento delle proteine ​​in una regione del DNA non associata (bolla del DNA). Le proteine ​​si muovono poi in direzione 5&#39;-3 &#39;lungo il filo di ssDNA su cui sono caricate. Riconoscimento di una lesione del DNA (qui: CPD) da parte delle elicasi sia sul filo traslocato (per il caricamento a 5 &#39;bolla) o sul lato opposto, non traslocato (perR caricamento a 3 &#39;bolla) si traduce in una translocazione staminale del DNA. Nelle distribuzioni di posizione questo si presenta come un picco (linee di misura Gaussiane), che indica una maggiore legatura nella posizione della lesione (a ~ 30% della lunghezza del DNA per i substrati del DNA qui mostrati). L&#39;elicottero NER prokaryotico UvrB e il suo equivalente eucariotico XPD mostrano diverse strategie di riconoscimento delle lesioni CPD che indicano diverse preferenze di filamenti di DNA. In particolare, le lesioni CPD sono riconosciute sul filo traslocato da UvrB, ma preferibilmente sul filo opposto, non traslocato da XPD. Figura modificata dal riferimento 9 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55501/55501fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55501/55501fig4.jpg" /> Figura 4: Cambiamenti conformi nei complessi XPD-DNA dopo l&#39;identificazione della lesione.<html> Le distribuzioni degli angoli di curvatura del DNA indotti da XPD indicano cambiamenti conformazionali nei complessi proteina-DNA a una lesione fluoresceina. Questi riarrangiamenti conformazionali dipendevano dalla presenza di ATP (B) o di ATP (S) (C). ( A ) In assenza di ATP, gli angoli di curvatura non specifici (grigi) e gli angoli di piegatura sul sito della lesione (angoli di curvatura specifici, neri) sono simili e sono adattati da una curva gaussiana con centro a ~ 50 °. ( B , C ) In presenza di ATP o ATP duranteS, la distribuzione dell&#39;angolo di curva specifico (nero) mostra uno spostamento significativo (P = 2,5 x 10 -7 ) ad un angolo di curvatura medio di ~ 65 °. Questo flessione del DNA nel sito della lesione era indipendente dal tipo di lesione (CPD o adduzione del fluoresceina) o dalla presenza o dall&#39;assenza di una bolla del DNA 5 . La figura è stata riprodotta dal riferimento 5 . L&#39;inserto in (C) mostra come sono stati determinati gli angoli di curvatura (180 ° -β).Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> numero </td><td colspan="3"> sequenza </td><td> descrizione </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC </td><td> parte inferiore </td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC </td><td> F / 5 &#39; </td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC </td><td> F / 3 &#39;bolla </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC </td><td> CPD / 5&#39;bubble </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC </td><td> CPD / 3&#39;bubble </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="3"> / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC </td><td> F / bolla </td></tr></tbody></table> Tabella 1: oligonucleotidi del DNA per il preparato del substrato del DNA. Tutti gli oligonucleotidi sono lunghi 48 nt e sono stati ottenuti fosforilati a fili superiori (oligonucleotidi 2-6) alla loro estremità 5 per la legatura nel DNA colato (vedi protocollo 1.1). F = la timina adduta di fluoresceina, TT = dimer di ciclobutano pirimidina (timina) (CPD), regioni non complementari (regioni di formazione delle bolle di DNA). F contenenti oligonucleotidi sono stati ottenuti da Integrated DNA Technologies (IDT), gli oligonucleotidi contenenti CPD sono stati gentilmente forniti dal laboratorio di Thomas Carell (Ludwig-Maximilian University Munich, Germania).

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Indagini al microscopio a forza atomica sul riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione per escissione di nucleotidi | Genetica | Video

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.

Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi

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The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. This approach to colorimetric DNA detection was based on the hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes (AuNP probes). The growth size and configuration of the AuNP are dominated by the number of DNA samples hybridized with the probes. Based on the specific size- and shape-dependent optical properties of the nanoparticles, the number of mismatches in a sample DNA fragment to the probes is able to be discriminated. The tests were conducted via droplets containing reagents and DNA samples respectively, and were transported and mixed on the pneumatic platform with the controlled pneumatic suction of the flexible PDMS-based superhydrophobic membrane. Droplets can be delivered simultaneously and precisely on an open-surface on the proposed pneumatic platform that is highly biocompatible with no side effect of DNA samples inside the droplets. Combining the two proposed methods, the multi-nucleotide polymorphism can be detected at sight on the pneumatic droplet manipulation platform; no additional instrument is required. The procedure from installing the droplets on the platform to the final result takes less than 5 min, much less than with existing methods. Moreover, this combined MNP detection approach requires a sample volume of only 10 &#181;l in each operation, which is remarkably less than that of a macro system.

This work presents a simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform. With the proposed method, the entire experiment, including droplet manipulation and detection of multi-nucleotide polymorphisms, can be performed near 23 &#176;C without the aid of advanced instruments.

Il colorimetrico rilevamento visivo del Multi-nucleotide polimorfismi su una piattaforma di manipolazione pneumatica Droplet

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In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em&gt; In Vitro</em&gt; Dai replica proteine ​​batteriofago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Valutazione della contaminazione da DNA a RNA campioni basati sul DNA Ribosomal

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

Un'analisi semplice, rapida e quantitativa per riparazione di misura di legami incrociati della DNA-proteina su plasmidi Transfected nelle cellule di mammifero

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi

Riepilogo

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