We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Universit&#233; de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.

Tutte le procedure di gestione degli animali descritti di seguito aderire alla University of comitato cura degli animali del Western Ontario (2016-014). 1. Preparazione del tessuto e sezionamento <ol><li> Estratto tessuto cerebrale di ratto attraverso un processo noto come &quot;Fresh congelati estrazione&quot; (FFE). <ol><li> Euthanize il topo con una dose eccessiva di sodio pentobarbital e monitorare riflessi negli arti. Una volta che tutti i riflessi hanno cessato, recidere il capo del ratto usando una ghigliottina. </li><li> Attenzione separare i muscoli e altri tessuti dal cranio con un bisturi. Utilizzare pinze osso-taglio per rompere il cranio per esporre il cervello, partendo dalla base del cranio (occipitale) alla porzione anteriore. </li><li> Una volta che il cervello è esposto, scoop accuratamente fuori con una spatola chirurgica e collocare immediatamente in ghiaccio secco schiacciato per congelamento flash. NOTA: Il cervello sarà molto malleabile. Pertanto, prestare la massima attenzione quando si posiziona il cervello sughiaccio secco. Se il cervello è schiacciato o premuto contro una superficie, altera la sua forma e congelare in quella posizione. </li></ol></li><li> Rimuovere il tessuto fresco congelato (non perfusi con formaldeide o incorporato in OCT) da - 80 ° C freezer e luogo in ghiaccio secco. </li><li> Mettere alcune gocce di acqua su un supporto criostato e posto su entrambi ghiaccio secco o la barra di congelamento criostato. Premere il tessuto leggermente sul supporto criostato come si comincia a congelare e tenere premuto fino a quando l&#39;acqua gela intorno alla base del tessuto ed ancora in posizione. Aggiungere acqua supplementare per fissare ulteriormente il tessuto sul supporto se necessario. NOTA: dell&#39;acqua invece dell&#39;OCT mezzi per il tessuto di montaggio al fine di evitare la contaminazione del tessuto con composti che possono influenzare il rilevamento del segnale desiderato. </li><li> tessuti posizione nel criostato. tessuto Sezione fino alla posizione anatomica desiderata. Assicurarsi che lo spessore di taglio è compresa tra 8-12 micron. NOTA: quando sezionare il tessuto in criostato comunaledispositivi, è imperativo che i materiali separati come lame, spazzole, barre antirollio, e titolari essere utilizzati al fine di evitare la contaminazione con l&#39;incorporamento composti. L&#39;interno del criostato deve essere pulito anche accuratamente con etanolo prima dell&#39;uso. </li><li> Utilizzando la barra antirollio criostato, lentamente sezione appiattita sezioni di tessuto. Fori o segni sul tessuto può verificarsi se il posizionamento roll bar non è corretto o lama è ottuso. Spostare il tessuto verso il centro di affettare piattaforma usando pennelli puliti. </li><li> Montaggio <ol><li> Congelare diapositive conduttive o piastre di metallo inserendoli nel criostato mentre affettare. Quando la slitta è completamente congelato, spostare accuratamente il tessuto sezionato sulla superficie conduttiva del vetrino utilizzando pennelli puliti. Una volta che tutte le sezioni di tessuto sono posizionati correttamente sul vetrino, mettere un dito sotto il vetrino, di fronte al tessuto, e premere fino a quando la sezione si scioglie. NOTA: Le sezioni possono piegare o arricciare durante il processo di scongelamento quandoUtilizzando questo metodo di montaggio. Questo può essere ridotto mantenendo la slitta nella criostato quando scongelamento del tessuto. Se questi problemi diventano problematici, in alternativa, warm-mount metodo è elencato di seguito. </li><li> In alternativa, prendere una temperatura ambiente di indio-stagno Oxide (ITO) slitta (o piastra di metallo) e premere leggermente verso il basso sezione di tessuto congelato sulla superficie della piattaforma affettare, lato conduttivo verso il basso. Questo porterà alla scongelamento sezione di tessuto in modo uniforme sulla superficie del vetrino con poco arricciatura o ripiegamento del tessuto. NOTA: La condensa può apparire sotto la sezione per il montaggio si utilizza questo metodo, che possono portare alla perdita di alcune proteine ​​e lipidi. </li></ol></li><li> Collocare i vetrini con il tessuto in un essiccatore per 5 - 10 minuti. </li></ol> 2. sublimatore Apparato Set-up NOTA: Effettuare queste operazioni in una cappa aspirante. <ol><li> Inserire un bagno di sabbia in un contenitore di alluminio su una piastra calda, con la piastra su un elevatore di metallo forbicedi un&#39;adeguata superficie (cioè maggiore della piastra). Accendere la piastra calda e impostare la temperatura a 140 ° C. NOTA: Il punto di fusione per matrice DAN è compresa tra 187-190 ° C. Non superare questa temperatura sulla piastra. <ol><li> Se la piastra è dotata di una sonda di retroazione di temperatura, utilizzarlo per monitorare la temperatura della sabbia tutto l&#39;esperimento e garantire la coerenza della temperatura. Questa caratteristica può aiutare con l&#39;esperimento riproducibilità attraverso vari esperimenti di sublimazione. NOTA: Il bagno di sabbia deve essere contenuta all&#39;interno di un contenitore di alluminio come un contenitore di vetro possono rompersi a temperature elevate. </li></ol></li><li> Mettere 300 mg di matrice DAN sulla superficie inferiore dell&#39;apparecchio sublimazione. Posizionare la matrice al centro dell&#39;apparato e sparsi in uno strato uniforme nella larghezza approssimativa e la lunghezza della slitta essendo sublimata. ATTENZIONE: matrix DAN è tossico. Pertanto, è importante indossare guanti, maschere, e sicurezzaocchiali di protezione in ogni momento durante la manipolazione della matrice in polvere. DAN deve essere conservato al buio in quanto è sensibile alla luce. </li><li> Nastro una piastra di metallo sulla superficie interna dell&#39;apparecchio con la piastra di entrare in contatto diretto con la parte inferiore del condensatore al fine di garantire una distribuzione uniforme di raffreddare tutta la superficie del vetrino durante sublimazione temperatura. In alternativa, la sabbia sul fondo del condensatore al fine di garantire una superficie piana. <ol><li> Posizionare il nastro lungo i bordi esterni della piastra e aderire ai lati del vetro interno. Se il nastro viene posizionato sotto la piastra e aderisce al fondo della superficie di vetro interna, la distribuzione della temperatura non può essere uniforme e può causare distribuzione matrice uniforme su tutta la superficie del vetrino. </li><li> Nastro uno spazio (test) scivolare diagonalmente attraverso la superficie della piastra metallica con il nastro nuovo posto sui bordi esterni della slitta. </li></ol></li><li> Collegare le porzioni superiore e inferiore dell&#39;apparecchiatura, with un O-ring in gomma nel mezzo per garantire una tenuta completa. </li><li> Inserire un metallo giunto cardanico attorno al centro dell&#39;apparato e serrare vizi fino alla metà superiore e inferiore dell&#39;apparecchiatura sono sigillati ermeticamente insieme. Mettere in O-ring di metallo sopra il bagno di sabbia. </li><li> Prendete una manciata di ghiaccio tritato e metterlo nel condensatore. Riempire condensatore ¼ a ½ con acqua fredda per creare granita di ghiaccio. La fanghiglia ghiaccio raffreddare la piastra metallica all&#39;interno dell&#39;apparecchio e successivamente il vetrino aderito ad esso. Attendere almeno 5 minuti per la temperatura di raggiungere uno stato stazionario. </li><li> Versare 300 mL di etanolo nel contenitore trappola fredda e posizionare il vetro nel contenitore. Goccia 2 - 3 piccoli pezzi di ghiaccio secco in etanolo nel fondo del contenitore trappola fredda. L&#39;ingresso trappola fredda ha un tubo di vetro in esecuzione al fondo del cilindro, mentre l&#39;uscita no. </li><li> Collegare la pompa del vuoto al freddo uscita trappola utilizzando tubi in gomma. Utilizzare un altro pezzo di gommatubo per collegare l&#39;ingresso trappola fredda all&#39;apparato sublimazione. Assicurarsi che il tubo sia ben fissato con fascette metalliche, se disponibile. </li><li> Utilizzare la pompa a vuoto per fornire un vuoto di 30 - 50 mt. Lasciare che la pompa di funzionare per almeno 5 minuti per il raggiungimento dell&#39;equilibrio di pressione. Morse su U-ring di apparecchi sublimazione possono essere serrati nuovamente dopo la pompa da vuoto viene attivato a causa della riduzione della pressione nell&#39;apparecchiatura. NOTA: Si raccomanda che un vacuometro essere collegato alla pompa per monitorare la pressione di vuoto durante l&#39;esperimento e testare perdite in pressione al fine di ottenere la massima riproducibilità possibile tra esperimenti. Tuttavia, la maggior parte delle pompe sono progettati per mantenere una pressione costante, quindi l&#39;indicatore non sia essenziale per gli utenti esperti. Inoltre, il grasso guarnizione di vuoto può essere utilizzato per aiutare a mantenere la pressione di vuoto. </li></ol> 3. sublimazione <ol><li> Assicurarsi che la temperatura del bagno di sabbia ha stabilzata a 140 ° C e che l&#39;apparecchio sia fissato nella O-ring di metallo sopra il bagno di sabbia con tutti i tubi collegati e il vuoto acceso. </li><li> Impostare il timer per 7 minuti ma non avviare il timer. Lentamente sollevare la forbice e sabbia vasca fino all&#39;apparato sublimazione finché il giunto a U del sublimatore è ben sopra l&#39;O-ring di metallo. Questo spazio permette di regolare l&#39;apparecchio sulla sabbia. <ol><li> Premere rapidamente il sublimatore delicatamente sulla superficie di sabbia per assicurare che l&#39;apparecchio è seduto uniformemente sulla sabbia, e quindi iniziare immediatamente il timer. </li></ol></li><li> Quando il timer suona, spegnere la pompa del vuoto e con attenzione abbassare il sollevatore a forbice fino alla sublimatore non è a contatto con il bagno di sabbia ed è seduto saldamente l&#39;O-ring in metallo. <ol><li> Lentamente allentare la valvola di micro-sfogo per scaricare la pressione nell&#39;apparato. Allentare la fascetta metallica attorno al tubo di gomma dell&#39;apparato sublimazione e lentamente cominciano ad allentare il tubo. Una volta che il rutubo bBER è stato allentato un po &#39;, piegare il tubo da un lato per consentire pressione residua di fuoriuscire. </li><li> Quando ritorna a pressione ambiente, rimuovere con attenzione il tubo di gomma dall&#39;apparato sublimazione. </li></ol></li><li> Allentare i vizi sul giunto cardanico dell&#39;apparecchiatura e rimuovere. separare con cautela le due metà dell&#39;apparato sublimazione ed estrarre il vetrino dalla parte superiore del vetro interno. Esaminare scivolo per confermare una distribuzione uniforme della matrice. NOTA: Se matrice è irregolare, la matrice in polvere in fondo alla sublimatore può essere riposizionato o dell&#39;apparato sublimatore può essere riposizionata nella sabbia per la diapositiva successiva. Il processo di sublimazione può essere ripetuto più volte usando la stessa matrice, tuttavia, la matrice finirà per diventare più scura da calore ripetuta e la quantità di polvere diminuirà tale che il tempo sublimazione dovrà essere lievemente modificate per compensare. Per questa ragione, è importante controllare la quantità di matrice being sublimato dopo ogni esperimento per garantire la coerenza nella deposizione di matrice tra le diapositive </li><li> Se la distribuzione e la quantità di matrice sublimato è sufficiente, il nastro una nuova diapositiva con il tessuto sulla parte interna del sublimatore e ripetere Sezione 3. NOTA: Per controllo di qualità (QC) scopi, la quantità di matrice sublimato può essere misurata dopo ogni esperimento pesando il vetrino prima e dopo sublimazione e dividendo il peso di matrice sublimato con la superficie del vetrino 2, va notato che a causa della mancanza di precisione della maggior parte delle scale oltre 4 punti decimali e la variabilità tra le scale, queste misure dovrebbero essere essere utilizzato solo una guida per la deposizione ottimale della matrice piuttosto che un mezzo completamente quantificabili di controllo di qualità a meno che non si utilizzi un equilibrio di alta precisione (si veda la Figura 3). </li></ol> 4. tessuto di stoccaggio / reidratazione <ol><li> Dopo sublimazione, negozio scivola in un contenitore sigillato o piccola cassette in sacchetto di plastica sigillato. </li><li> Incubare i vetrini a -20 ° C freezer per 2 ore o durante la notte. NOTA: L&#39;obiettivo del processo di congelamento è di agire come una fase di reidratazione per il desorbimento di materiali tessuti nella matrice. Il processo di congelamento è stato anche dimostrato di prevenire il degrado dei segnali di lipidi per fino a 1 settimana, se conservato a -80 ° C 12. Per questo motivo, la quantità di tempo i campioni vengono conservati nel congelatore può essere variato in una certa misura per soddisfare le esigenze dello sperimentatore senza alterare significativamente rilevazione del segnale (come osservato nel nostro laboratorio). Tuttavia, abbiamo notato un po &#39;di scolorimento della matrice quando i campioni sono congelati per più di 24 ore a -20 ° C. Così, si consiglia l&#39;imaging del tessuto sublimato prima di quel momento o conservare il tessuto a -80 ° C per periodi di incubazione più lunghi. </li><li> Estrarre i vetrini dal congelatore (e contenitore) e posto in un essiccatore per 5 - 10 minuti. </li></ol> 5. Imaging e AANALISI <ol><li> Estrarre i vetrini da essiccatore e applicare standard strumento per garantire l&#39;accuratezza di massa dello strumento MALDI durante l&#39;imaging. Il tipo di standard varierà secondo strumentazione. Gli standard sono generalmente applicati in modo uniforme su tutta scorrevole, tessuto circostante per essere ripreso (Figura 3D). </li><li> Inserisci diapositiva in strumento MALDI e seguire le istruzioni del produttore per esperimenti di imaging (metodi strumento dovrebbe essere ottimizzati per una 1.000 - 2.000 range di massa). Risultato rappresentativo (figura 4) è stata acquisita in modalità negativa reflectron con un raster 70 micron e 20 colpi / spettro (acquisizione in tempo ~ 2 h). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dettagli Questo lavoro un protocollo standardizzato di matrice sublimazione sul tessuto per la rilevazione di lipidi carichi negativamente, come gangliosidi, in esperimenti MALDI IMS. Preparazione del campione per MALDI IMS è altamente variabile e deve essere personalizzato per soddisfare le proprietà uniche del analita di interesse. L&#39;applicazione della matrice sulla superficie del campione di tessuto è un aspetto cruciale del processo di preparazione del campione per quanto riguarda la qualità dei risultati in IMS. Particolare attenzione dovrebbe essere presa quando si seleziona matrici, assicurando che la matrice è compatibile con l&#39;analita di interesse e sia privo di artefatti matrice di derivazione dello spettro. Sublimazione è una tecnica di deposizione di matrice secca che fornisce un alto grado di cristallo matrice omogeneità con poco delocalizzazione dei lipidi sul tessuto. matrix DAN in particolare mostra un alto grado di sensibilità per il desorbimento di un gruppo di lipidi di membrana carica negativa chiamato gangliosidi, come dimostrato nel cervello di rattosezioni, ed è stabile sotto vuoto per lunghi periodi di tempo, permettendo per la compatibilità con la maggior parte delle applicazioni di imaging. Matrix DAN ha l&#39;ulteriore vantaggio di avere anche una elevata affinità per specie lipidi caricati positivamente, aumentando così la versatilità di questa matrice per applicazioni MALDI IMS 2. Va inoltre osservato che specie multiple lipidi, tra fosfolipidi, possono essere rilevati contemporaneamente quando si utilizza questo protocollo IMS. Un esame approfondito delle proprietà di matrice DAN rispetto ad altre matrici 9 comunemente usati è stato precedentemente pubblicato 2. In questo articolo, gli autori evidenziano l&#39;accresciuta sensibilità della matrice DAN in modalità ioni negativi rispetto alle altre matrici esaminate nonché la capacità di imaging ad alta risoluzione usando DAN. matrice DAN è stato trovato per avere la più alta performance complessiva per gli ioni di polarità negativa. È interessante notare, ha eseguito Equally bene per gli ioni di polarità positiva. Altre matrici comuni che hanno dimostrato elevata affinità per gli ioni di polarità negativi includono DHA, DHB, e 9-AA. L&#39;efficienza di DHA come matrice è limitata dalla scarsa stabilità sotto vuoto che rende impraticabile per molte applicazioni di imaging 2. 9-AA ha il vantaggio di produrre a basso rumore di fondo e l&#39;arricchimento dimostrato di segnali sulfatide nel 750 - 950 range di massa in modalità negativo rispetto alla matrice DHB 13. Sebbene DHB ha dimostrato di essere molto efficace in modalità positiva, produce minore segnale ioni polarità negativa rispetto al DAN matrice 2. Matrice DAN ha anche dimostrato una maggiore sensibilità in modalità ioni negativi nel range di massa inferiore (650-950) rispetto al DHB 2. Inoltre, è stato riportato che DHB può formare significativi cluster matrice in ioni negativi modalità fino a 750 Da 2. et al. , In cui matrice terra viene fatto passare attraverso un setaccio fine e depositato sulla superficie del campione. Gli autori hanno confrontato questo metodo a secco di deposizione di matrice ad una tecnica a spruzzo manuale di matrice bagnato e ha scoperto che hanno dato il segnale paragonabile per fosfolipidi nel 450 - intervallo di massa 1.200 14. Uno studio ha utilizzato sia sublimazione e secco rivestimento con un setaccio per esaminare l&#39;espressione fosfolipidi, tuttavia, gli autori non hanno commentato su come le due tecniche a confronto in termini di risoluzione o segnale di ioni resa 15. Al fine di assicurare la più ampia gamma possibile di applicabilità, il protocollo presentato è il flusso di base che permetterà nuovi e più specializzati utenti di MALDI IMS per ottenere risultati altamente riproducibili per un&#39;ampia varietà di applicazioni di imaging lipidi. Tuttavia, i protocolli di sublimazione possono essere modificati per soddisfare le unique le circostanze di questo esperimento. Ad esempio, la deposizione di cristalli di matrice multa prevista per sublimazione consente la possibilità di invertire l&#39;ordine di preparazione del campione da slitte pre-rivestimento / piastre con matrice prima di montare il tessuto. La matrice può essere sublimata sulla superficie conduttiva in anticipo e conservato in un ambiente buio per un uso successivo riducendo così il tempo di preparazione del campione post-sezionamento pur mantenendo elevata sensibilità per il rilevamento lipidi 16, 17. Un&#39;altra modifica che può essere fatto a questo protocollo per migliorare il segnale per il rilevamento dei lipidi è un 2 min lavata con ammonio formiato 8. Sebbene sublimazione può aggirare molti degli inconvenienti della maggior tecniche di deposizione di acqua, alla più piccola, più omogenea deposizione di cristalli di matrice 1, diminuita delocalizzazione di analiti, e basso costo rispetto a spruzzatori automatizzati, cosìme variabilità nel processo di preparazione del campione è inevitabile. Nel caso di sublimazione, ci sono diversi fattori che possono causare differenze minute da un esperimento all&#39;altro e può includere le seguenti, che sono stati osservati nel nostro laboratorio. Ci possono essere differenze nella posizione dell&#39;apparecchio sublimazione sulla sabbia. Quando si esegue diversi esperimenti sublimazione back-to-back, la sabbia nel bagno di sabbia può iniziare a spostare la sua posizione che può influenzare la dispersione del calore in tutto il bagno di sabbia. Appiattendo la sabbia prima di ogni turno di sublimazione può anche cambiare la dispersione del calore, come la sabbia che è stato spostato può prendere tempo per tornare a una temperatura uniforme. tempo sublimazione potrebbe dover essere regolato leggermente tra ogni round per compensare lo spostamento della sabbia nella vasca di sabbia. In alternativa, l&#39;uso di un bagno d&#39;olio può causare dispersione di calore più omogeneo. In secondo luogo, la quantità di matrice nella parte inferiore della sublimatore può variare. DAN matrix ha un aspetto grigio clumpy e ha la tendenza a formare grandi cluster. Questi gruppi possono essere suddivisi manualmente e disposti nella parte inferiore del sublimatore ma non possono essere completamente eliminati. Grandi gruppi di matrice ci vorrà più tempo per riscaldare e sublimare di pezzi più piccoli che possono influenzare il prodotto finale della sublimazione. L&#39;uscita del vuoto sull&#39;apparato sublimazione è un altro fattore critico. La maggior parte sublimatori sono realizzati con una sola uscita vuoto sulla quale tubo è collegato a collegarlo alla pompa a vuoto durante la sublimazione. Poiché la pressione viene regolata su quel lato dell&#39;apparecchio, ci può essere una leggera irregolarità della deposizione di matrice, con più che viene depositata sul lato con l&#39;uscita del vuoto. Questo può essere in qualche modo compensata spostando o la posizione dell&#39;apparecchio nella sabbia, la posizione della matrice in fondo alla sublimatore, o cambiando la posizione della slitta / piastra sul condensatore. questi infattiors sono i principali inconvenienti della tecnica sublimazione e per questo motivo è fondamentale per eseguire una diapositiva di prova attraverso il processo di sublimazione prima dell&#39;esecuzione campione sperimentale in modo che il tempo può essere regolato per compensare queste variabili. Un altro inconveniente segnalato di sublimazione è che la rilevazione di maggiori analiti massa è limitato mediante estrazione analita insufficiente e / o miscelazione con matrice. Un passo reidratazione dopo sublimazione può aiutare a tirare fuori questi analiti di massa più elevati per aggirare questo problema. Ciò si ottiene in genere utilizzando una camera umida 18. Tuttavia, in questo protocollo, viene aggiunta una fase di congelamento dopo sublimazione che realizza lo stesso scopo. Il congelamento e successivo scongelamento (in essiccatore) dei campioni prima dell&#39;inserimento nello strumento MALDI provoca la formazione di condensa sulla superficie del campione, che reidrata temporaneamente il campione per consentire l&#39;estrazione dei lipidi elevati massa preservando il tiSSUE per l&#39;analisi 12, 17. Nel complesso, la sublimazione è un metodo efficace altamente sensibile e costi delle applicazioni matrice per la rilevazione di lipidi negli esperimenti MALDI IMS. In effetti, il nostro gruppo ha notato miglioramenti significativi risultati IMS quando abbiamo spostato di utilizzare un metodo di aria spruzzo 3 ad un metodo di sublimazione 4 per la deposizione di matrice. Il presente Protocollo è appropriata per un numero di applicazioni di imaging lipidico, ma può essere modificata per adattarsi alle esigenze dello sperimentatore.

Matrix-Assisted Laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) sta diventando una tecnica molto ricercato per la visualizzazione della distribuzione spaziale dei lipidi, peptidi e proteine ​​su superfici campione intatte. MALDI IMS era precedentemente conosciuto come una tecnica analitica per analiti pre-purificato, ma negli ultimi anni, ha attirato l&#39;attenzione in molte altre discipline causa della capacità di combinare la precisione della spettrometria di massa ad alta risoluzione punti di riferimento anatomici / visivi senza bisogno di alcuna etichettatura esterna. Come la piscina scientifica dei ricercatori che utilizzano questa tecnica continua a crescere, vi è una maggiore necessità di standardizzati, protocolli facili da seguire per assistere nello sviluppo e ottimizzazione di esperimenti IMS. I gangliosidi, un gruppo di lipidi di membrana altamente abbondanti nel sistema nervoso centrale, sono ideali per esperimenti MALDI IMS come loro ubicazione, incorporato all&#39;interno della membrana, rende certi species impossibile da rilevare con i convenzionali Immuno-etichettatura. Inoltre, abbiamo dimostrato, utilizzando MALDI IMS, che questi lipidi, che funzionano come modulatori di segnalazione cellulare, tra le altre cose, hanno modelli di distribuzione anatomica unici nel cervello dei roditori sani che vengono modificate dopo lesione cerebrale 3, 4, 5. I gangliosidi sono situati in un range di massa più elevata rispetto alla maggior parte delle specie di lipidi, e sono quindi più adatto alla piattaforma di imaging MALDI. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> Figura 1: Flusso di lavoro di MALDI IMS Experiment. Diagramma dello schema generale di un esperimento MALDI IMS tramite sublimazione. Tessuti congelati a -80 ° C è sezionato in un criostato e 10 sezioni micron sono disgelo montato su vetrini ITO conduttivo. Il vetrino viene quindi posto in un essiccatore fino sublimazione. Slides sono inseriti nell&#39;apparecchiatura sublimazione e uno strato uniforme di matrice viene applicata alla superficie del campione di tessuto. I campioni sono congelati durante la notte in un congelatore C -20 ° poi messo in essiccatore per 10 minuti. Una volta applicate norme, i campioni vengono inseriti nello strumento MALDI cui un laser è diretto attraverso il tessuto causando molecole desorbiti nella matrice a ionizzare. Gli ioni viaggiano lungo un tubo di volo e separati in base alla loro massa (tempo di volo / TOF) fino a raggiungere il rilevatore. Le informazioni sulla abbondanza ionica di analiti in un intervallo predeterminato di massa-carica (m / z) viene visualizzata come sia un&#39;immagine molecolare e spettro di massa. Questi dati possono essere utilizzati sia per visualizzare e quantificare l&#39;abbondanza ionica dell&#39;analita di interesse all&#39;interno del tessuto con immagini stampate. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> preparazione del campioneper MALDI IMS è molto variabile in ogni fase del processo deve essere personalizzato per gli analiti di interesse. La caratteristica distintiva di esperimenti MALDI-base è l&#39;uso di un rivestimento a matrice depositata sulla superficie del campione prima dell&#39;analisi. Oltre al ruolo di assorbire e trasferire energia di radiazione dal laser durante il processo di ablazione, la matrice serve anche ad isolare vari analiti dal campione, facilitando così l&#39;analisi di composti di interesse 6, 7. applicazione omogenea della matrice alla superficie del campione è il passo più importante nel processo di preparazione del campione. Deposizione di matrice non corretta può portare a grandi formazioni eterogenee cristallo matrice e lo sviluppo di artefatti, ionico segnale basso, e scarsa riproducibilità 7. A causa della affinità di alcune matrici per isolare analiti specifici, il tipo di matrice selezionata per un esperimento puòalterare in modo significativo l&#39;esito. Le matrici utilizzate per l&#39;imaging di proteine ​​e peptidi spesso differiscono da quelli utilizzati per i lipidi di imaging e il processo è ulteriormente complicata dalla necessità di procedure aggiuntive come lavaggio e reidratazione passaggi per rilevare correttamente i segnali dal tessuto. Sebbene esistano fasi di lavaggio per la valorizzazione dei segnali lipidi 8, non sono un prerequisito per la rilevazione della maggior parte delle specie di lipidi. Quando si seleziona una matrice per un esperimento di imaging lipidi, è importante considerare la polarità del lipide di interesse come questo restringere la gamma di matrici adatte. Ad esempio, gangliosidi contengono residui di acido sialico che conferiscono loro una polarità negativa complessiva. Ci sono una serie di matrici che possono efficacemente desorbire e ionizzare gangliosidi dal tessuto; Tuttavia, fattori come picchi matrice derivata nello spettro e stabilità della matrice sotto vuoto devono essere presi in considerazione. 1,5-diaminonapthalene (DAN matrice) è sufficientemente stabile in condizioni di vuoto strumento per la maggior parte delle applicazioni di imaging e ha dimostrato un alto grado di sensibilità per lipidi desorbimento e può essere utilizzato per l&#39;analisi dei lipidi in entrambe le modalità di ioni positivi e negativi 2. matrix DAN, rispetto ad altre matrici negative lipidico affinità come acido diidrossibenzoico (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), e 5-cloro-2-mercaptobenzotiazolo (CMBT), era in grado di desorbire più efficiente gangliosidi di cervello di ratto tessuto in modalità ioni negativi (manoscritto in preparazione). Selezione del metodo appropriato di deposizione di matrice è di uguale importanza alla selezione matrice stessa. Wet metodi di deposizione di matrice in cui la matrice solida viene disciolto in un solvente organico, e depositato dal pneumatico o spruzzatori o spotters automatizzate, sono particolarmente efficaci per il desorbimento di proteine ​​e peptidi come liquido permea il campione per consentire supplementarection di composti e co-cristallizzazione con la matrice. Sebbene queste tecniche possono essere usate anche per applicazioni lipidici, analita delocalizzazione e formazioni cristalline matrice irregolare sono fenomeni comuni a causa della grande abbondanza e la solubilità dei lipidi in solventi, particolarmente nel tessuto 2, 9. Poiché i lipidi sono facilmente ionizzati dal tessuto, secco tecniche di deposizione di matrice, come sublimazione, offrono una semplice, economica alternativa alla irroratrici che aggirano molti lo svantaggio di queste tecniche. Il successo di sublimazione in esperimenti MALDI IMS è attribuita a caratteristiche quali la morfologia matrice microcristallina che aumenta la superficie di matrice analita vincolante, maggiore purezza della matrice, e la deposizione di matrice omogenea che aumentano la riproducibilità rispetto alle tecniche matrice umido 1, 10. sublimazione involves riscaldamento di una matrice di polvere sotto vuoto immediatamente sotto una superficie del campione raffreddato con conseguente solida transizione in fase gas della matrice polvere seguita dalla deposizione sulla superficie del campione di tessuto. Durante sublimazione, deposizione di matrice può essere controllata da diversi fattori quali tempo, temperatura e pressione per fornire risultati altamente riproducibili. Un singolo esperimento sublimazione può richiedere da 5 a 20 min a seconda del tipo di matrice selezionata, che può essere riutilizzato più volte prima dello smaltimento. L&#39;apparecchio può essere acquistato commercialmente ad una frazione del prezzo delle irroratrici automatizzate ed è facilmente smontato per pulizia e manutenzione. Il basso costo e la relativa semplicità di questa tecnica di deposizione di matrice rendono ideale per i ricercatori che iniziano o in espansione su applicazioni di imaging di lipidi in MALDI IMS. Anche se le informazioni in dettaglio i protocolli per sublimazione dei tessuti per IMS sono stati riportati 11, alcuni protocolli standardizzati esistono which concentrarsi sul flusso di lavoro di base coinvolto con la realizzazione di un esperimento di sublimazione per l&#39;imaging lipidi alta massa in modalità di ioni negativi, il che rende difficile stabilire la tecnica senza vasta tentativi ed errori. Il seguente è un protocollo sperimentale che mira a colmare questa lacuna per la sublimazione della matrice di DAN su sezioni di cervello di ratto per imaging ad alta risoluzione e la rilevazione dei gangliosidi. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> Figura 2: sublimazione Apparatus. Fotografico (A) e schema (B) dell&#39;apparecchiatura sublimazione. La pompa per vuoto è collegata con un tubo in gomma per una trappola a freddo riempito con 300 mL di etanolo. La trappola fredda è poi collegata con un tubo in gomma per l&#39;apparato sublimazione. L&#39;apparecchiatura è costituita da due pezzi separati di vetro che sono sigillati insieme con un metallo giunto cardanico. La metà superiore della sublimatorecontiene il condensatore che è riempito di fanghiglia di ghiaccio. La piastra campione viene registrato sul fondo del condensatore, all&#39;interno dell&#39;apparato di vetro sigillato. La metà inferiore del dispositivo sublimazione contiene la matrice DAN, distribuite in modo uniforme di fronte al piatto del campione. Durante sublimazione, l&#39;apparecchio di vetro è posto su un bagno di sabbia riscaldata a 140 ° C da una piastra calda direttamente sotto di esso. La sonda di temperatura aiuta a mantenere una temperatura stabile durante l&#39;esperimento sublimazione attraverso il feedback della temperatura del bagno di sabbia rispetto alla temperatura preimpostata per l&#39;esperimento. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sublimator</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG3038-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5- Diaminonapthalene (DAN) matrix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D21200&#160;</td>
			<td>100 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CryoStar NX50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate with temperature feedback</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>HP88857290</td>
			<td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100-120v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Jack</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>2216479</td>
			<td>10x10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Trap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom built on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Franklin Electric</td>
			<td>1102180403</td>
			<td>Savant VP100 Two Stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium-tin-oxide (ITO) Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI 1111000</td>
			<td>type II, 1.1mm/25 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI TOF/TOF 5800 Instrument</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2797</td>
			<td>tabletop desiccator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sublimation of dan matrix for the detection and visualization of gangliosides in rat brain tissue for maldi imaging mass spectrometry

La preparazione del campione è la chiave per la rilevazione ottimale e la visualizzazione di analiti a laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) esperimenti di Matrix-assistita. Determinare il protocollo appropriato per seguire tutto il processo di preparazione del campione può essere difficile in quanto ogni passo deve essere ottimizzato per rispettare le caratteristiche uniche di analiti di interesse. Questo processo implica non solo trovare una matrice compatibile che può desorbire e ionizza le molecole di interesse in modo efficiente, ma anche selezionando la tecnica di deposizione matrice appropriata. Ad esempio, una tecnica di deposizione di matrice bagnata, che comporta sciogliendo una matrice in solvente, è superiore per desorbimento maggior parte delle proteine ​​e peptidi, che secchi tecniche di deposizione di matrice sono particolarmente efficaci per la ionizzazione di lipidi. Sublimazione stato segnalato come un metodo altamente efficiente di deposizione di matrice secca per la rilevazione di lipidi nei tessuti di MALDI IMS causa della homogeneity di deposizione di cristalli di matrice e minimale delocalizzazione analita rispetto a molti metodi di deposizione bagnata 1, 2. In generale, si prevede che il campione e la matrice in polvere in una camera sottovuoto con i campioni pressati contro una superficie fredda. L&#39;apparecchiatura viene quindi abbassata in un bagno riscaldato (sabbia o olio), risultando in sublimazione della matrice polvere sulla superficie del campione di tessuto raffreddata. Qui si descrive un protocollo sublimazione usando matrice 1,5-diamminonaftalene (DAN) per il rilevamento e la visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto utilizzando MALDI IMS.

Al termine dell&#39;esperimento sublimazione, le due metà del apparecchio di vetro vengono separati nella cappa e la slitta, registrato al condensatore, può essere rimosso (Figura 3A). A questo punto, il vetrino deve essere esaminato per la distribuzione uniforme della matrice e il tempo, la temperatura, o il posizionamento dell&#39;apparecchio in bagno di sabbia può essere adeguato per la diapositiva successiva. Un esperimento sublimazione successo DAN comporterà uno strato uniforme di matrice grigio / marrone lungo la superficie del vetrino in cui le caratteristiche anatomiche del tessuto possono essere chiaramente visualizzati e la quantità di matrice sul vetrino è analogo a quello sul tessuto (Figura 3B). Ad esempio, se troppo matrice è stata sublimata sul tessuto, lo spessore della matrice riguarderà le caratteristiche del tessuto e solo la forma generale sarà distinguibile. Tuttavia, se troppo poco matrice è sublimata, il tessuto sarà HAve un aspetto più scuro del resto della diapositiva (Figura 3C). Sia troppo e troppo poco matrice si provocherebbe un calo del segnale nello strumento MALDI. Ai fini del controllo di qualità, Thomas et al. pesato la quantità di matrice depositata sul vetrino e diviso il peso per la superficie del vetrino. Hanno riferito una quantità ottimale di deposizione di matrice per diverse matrici tra cui DAN (110 mg / cm²) 2. Anche se la maggior parte dei saldi non hanno la precisione necessaria per replicare tali risultati, abbiamo cercato questo metodo di controllo di qualità; tuttavia, a causa di un alto grado di variabilità, possiamo consigliare solo una gamma appropriata di deposizione di matrice trovato per essere associato successo contro esperimenti sublimazione infruttuosi con matrice DAN come determinato mediante il rilevamento del segnale nello strumento. Una misurazione a matrice di sotto di 100 mg / cm² è stato associato a condizioni di &quot;troppo poco&quot; matrice mentre una misura di superiore a 140 mg / cm² eraassociata a &quot;troppo&quot;. deposizione di matrice tra 100 e 140 mg / cm è risultato essere una quantità ottimale per l&#39;imaging a matrice DAN. Norme Calibrazione dovrebbero essere applicati sul vetrino attorno ai campioni di tessuto per assicurare l&#39;accuratezza di massa dei segnali rilevati IMS (Figura 3D) In un esperimento MALDI IMS, l&#39;immagine molecolare permette la visualizzazione della distribuzione spaziale dell&#39;analita di interesse lungo con qualsiasi specie sconosciute che possono essere presenti in un dato intervallo di massa. Le immagini molecolari di gangliosidi in questo esperimento sono stati sovrapposti utilizzando il software ImageJ per mostrare la distribuzione anatomica di diverse specie gangliosidi attraverso le regioni corticali e subcorticali del cervello di ratto (Figura 4A). I gangliosidi più abbondanti nel cervello sono le specie di serie A e GD1a GM1 ma contengono anche gangliosidi GM2 e GM3, che si possono trovare tra il1000-2000 m / z gamma di massa, un range di massa superiore alla maggior parte dei lipidi cerebrali comuni, rendendo questi gangliosidi semplici per identificare lungo lo spettro (Figura 4B). L&#39;abbondanza ionica di ciascuna specie gangliosidi può essere usato per quantificare i semi-differenze o variazioni specie gangliosidici all&#39;interno della stessa immagine. Poiché una certa variabilità in prep campione non può essere evitato in IMS, tra i confronti di scansione sono considerati semi-quantitativa. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig3.jpg" /> Figura 3. DAN sublimazione. Risultati rappresentativi di sublimazione di matrice DAN sul tessuto del cervello di ratto. (A) Al completamento della sublimazione, le due metà dell&#39;apparato sono separati e la slitta viene rimosso dal condensatore. Matrice (B) DAN distribuisce uniformemente su più sezioni di tessuto cerebrale di ratto sulla superficie del vetrino per permettere altamente reprrisultati oducible (tra 100 - 150 g / cm²). (C) Esempi di esperimenti falliti di sublimazione in cui troppo poco matrice (sinistra - &lt;90 mg / cm²) (a destra o troppo a matrice -&gt; è stato depositato 150 g / cm²). Troppo poco matrice comporterà insufficiente desorbimento di analiti, mentre troppo matrice non permetterà il laser di penetrare al tessuto durante l&#39;acquisizione, con conseguente rilevazione bassa ione. (D) diapositiva contenente sezioni di tessuto di cervello di ratto sublimati con Matrix e di taratura standard DAN applicate è pronto per l&#39;inserimento in strumento MALDI per l&#39;imaging. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55254/55254fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig4.jpg" /> Figura 4. MALDI IMS dei gangliosidi nel cervello di ratto. Representative immagine molecolare e spettro di massa dei gangliosidi nel cervello di ratto dopo sublimazione con matrice DAN MALDI IMS. L&#39;immagine molecolare è un composto di specie multiple gangliosidi nello spettro sovrapposto e pseudocolored utilizzando software Immagine J per mostrare la distribuzione anatomica unica di specie gangliosidi tutto il cervello. Specie GM1d18: 1 (colore rosso, la massa ~ 1.547 Da), GM1d20: 1 (verde, massa ~ 1.573 Da), GM3d18: 1 (blu, massa ~ 1.178 Da), e GM3d20: 1 (verde acqua, massa ~ 1.207 Da) sono rappresentato. Lo spettro di massa mostra abbondanza ionica di analiti all&#39;interno di un 1.000 - 2.000 range di massa. I principali gangliosidi A-serie sono etichettati lungo lo spettro. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55254/55254fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

sublimation-dan-matrix-for-detection-visualization-gangliosides-rat

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  The University of Western Ontario. A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Video: Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ricerca

Neuroscienze

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

La chirurgia stereotassica della lesione eccitotossico di specifiche aree cerebrali nel ratto adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Non invasiva parenchimale, vascolare e metabolica ad alta frequenza ad ultrasuoni e fotoacustico Rat profonda Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

Visualizzazione dei depositi β amiloide nel cervello umano con Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging spettrometria di massa

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Adsordimento molecolare indotto dalla luce delle proteine utilizzando il sistema PRIMO per micro-patterning per studiare le risposte cellulari alle proteine a matrice extracellulare

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

Etichettatura e imaging di placche amiloidi nel tessuto cerebrale utilizzando la curcumina polifenolo naturale

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...