Questo protocollo è il metodo più efficiente ed economico per etichettare accuratamente le placche beta-amiloide, rispetto agli anticorpi specifici dell'amiloide, che sono attualmente il gold standard per l'etichettatura di queste placche. Questa tecnica richiede meno tempo ed è altrettanto efficace di uno qualsiasi dei metodi di etichettatura amiloide comunemente usati. La curcumina si lega fortemente alle placche amiloide e può essere utilizzata come sonda di imaging durante le scansioni PET del cervello e per screening relativamente non invasivi utilizzando la scansione retinica.
La curcumina si lega anche al neurofibrillare o al groviglio tau nel morbo di Alzheimer, alla sinuleina alfa nel morbo di Parkinson e alle proteine mutanti di Huntington nella malattia di Huntington. A dimostrare la procedura con Panchanan Maiti ci saranno Zackary Bowers, una studentessa laureata, e Alexandra Plemmons, una ricercatrice del mio laboratorio. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del dolore in un topo modello anestetizzato del morbo di Alzheimer di 12 mesi, posizionare il topo in posizione supina su un vassoio chirurgico e fare un'incisione nell'addome e attraverso il diaframma.
Inserire un ago perfusione calibro 21 nell'incisione e fare una piccola incisione al padiglione auricolare destro per consentire al fluido perfusione di drenare dal corpo. Utilizzare un sistema di perfusione alimentato a gravità per consentire al fluido PBS molare ghiacciato da 0,1 per fluire nell'ago per cinque o sei minuti a una portata da 20 a 25 millilitri al minuto. Se la perfusione viene eseguita correttamente, si osserverà un fegato chiaro.
Una corretta perfusione animale è essenziale perché se il sangue non viene rimosso completamente, la curcumina può legarsi ai vasi sanguigni e provocare un segnale di fondo fluorescente verde. Una volta che tutto il PBS è stato consegnato, passare la valvola tampone a una soluzione di paraformaldeide al 4% ghiacciata per otto-10 minuti prima di utilizzare forbici e forcep per liberare il cervello dal cranio. Quindi utilizzare una spatola per posizionare il cervello in una fiala del 4% di paraformaldeide almeno 10 volte il volume del tessuto per quattro gradi celsius di conservazione fino all'elaborazione.
Per ottenere sezioni per la sessatura del criostato, immergere in sequenza il cervello in soluzioni di saccarosio graduato a quattro gradi Celsius per 24 ore per concentrazione prima di utilizzare un criostato a -22 gradi celsius per ottenere sezioni di 40 micrometri, posizionando da 10 a 20 sezioni per pozzo in una piastra di sei pozzi contenente PBS integrata con lo 0,02% di azide man mano che si ottengono. Una volta acquisiti tutti i campioni, conservare le sezioni a quattro gradi celsius fino a un'ulteriore elaborazione. Per ottenere sezioni per la sessatura di paraffina, disidratare il tessuto cerebrale perfuso post-fisso con soluzioni di alcol graduato sequenziale per due ore per concentrazione, seguito da due immersioni al 100% di alcol di un'ora e due immersioni in xilene di un'ora a temperatura ambiente.
Dopo l'ultima immersione in xilene, penetrare nel tessuto con una soluzione da uno a uno di xilene per paraffina due volte per un'ora per incubazione a 56 gradi celsius in un vetro conico di vetro ricoperto di foglio di alluminio prima di immergere i tessuti in paraffina di 56 gradi celsius per quattro o sei ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare un microtomo rotante a temperatura ambiente per ottenere cinque sezioni spesse cinque micrometri posizionando le sezioni in un bagno d'acqua tissutale di 45 gradi Celsius man mano che vengono raccolte. Per l'etichettatura della curcumina delle placche beta amiloide nelle sezioni del tessuto criostato, sciacquare le sezioni con PBS tre volte per cinque minuti per lavaggio prima di immergere le sezioni in etanolo al 70% per due minuti a temperatura ambiente.
Mentre le sezioni sono in incubazione, sciogliere un millimolare di curcumina stock in metanolo e diluire la soluzione a una concentrazione di lavoro finale di 10 micromolare con 70% di etanolo. Al termine dell'incubazione, immergere le sezioni nella soluzione di curcumina di lavoro per 10 minuti a temperatura ambiente a 50 rotazioni al minuto. Al termine del periodo di colorazione, scartare la soluzione di curcumina e lavare le sezioni con tre lavaggi di due minuti in etanolo al 70%.
Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le sezioni su vetri rivestiti in polilisina e montare un coperchio su ogni scivolo con un mezzo di montaggio organico appropriato. Quindi visualizzare le sezioni su un microscopio a florescence utilizzando un obiettivo 10 o 20x e gli opportuni filtri di eccitazione ed emissione. Per l'etichettatura istochimica di sezioni di tessuto paraffinato profondo, immergere le sezioni spesse cinque micrometri in xilene due volte per cinque minuti a temperatura ambiente per immersione, seguite da reidratazione con immersioni in soluzione alcolica di un minuto graduate.
Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni con soluzioni alcoliche classificate per due minuti per concentrazione seguite da schiarite con due immersioni in xilene di cinque minuti. Dopo la seconda immersione in xilene, montare ogni sezione su uno scivolo al microscopio con un coperchio e un mezzo di montaggio appropriato per l'imaging della microscopia a florescence, come dimostrato. Per l'etichettatura di campioni di sezione criostatica con anticorpi anti-A-beta, lavare i campioni tre volte con PBS fresco per lavaggio in singoli pozzi di una piastra di 12 pozza prima di bloccare qualsiasi legame non specifico con siero di capra normale al 10% in PBS e 0,5% tritone x-100 per un'ora a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, scartare la soluzione di blocco e incubare i campioni con anticorpi specifici a beta durante la notte a quattro gradi Celsius e 150 rotazioni al minuto. La mattina seguente, lavare le sezioni con tre lavaggi di 10 minuti in PBS fresco per lavaggio, seguito da incubazione con un anticorpo secondario appropriato coniugato con un fluoroforo rosso per un'ora a temperatura ambiente protetto dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte con PBS seguito da un lavaggio con 70% di alcol.
Dopo il lavaggio dell'alcol, incubare le sezioni con 10 curcumina micromolare per 10 minuti a temperatura ambiente seguita da tre lavaggi al 70% alcool di un minuto. Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare le sezioni con 90% e 100% di alcol per un minuto per concentrazione e sgombro le sezioni due volte per cinque minuti per immersione con xilene fresco per incubazione. Quindi montare e immagini le sezioni come dimostrato.
Per la co-localizzazione beta amiloide intracellulare, macchiare le sezioni con anticorpo beta anti amiloide seguita dalla colorazione con curcumina a temperatura ambiente e 50 rotazioni al minuto protette dalla luce come dimostrato. Al termine dell'incubazione, controsostenere con un colorante nucleare appropriato per 10 minuti a temperatura ambiente e 50 rotazioni al minuto protette dalla luce seguite da tre lavaggi in PBS. Quindi montare e imageare le sezioni mediante microscopia a fluorescenza come dimostrato.
Sebbene l'aumento del tempo di incubazione con curcumina aumenti leggermente l'intensità di fluorescenza delle placche beta A, il numero di placche osservate non è significativamente diverso tra uno e cinque minuti di tempo di colorazione. La curcumina può essere utilizzata per macchiare le placche beta A e i campioni di tessuto criosezione, paraffina incorporata e morbo di Alzheimer umano. L'etichettatura con un anticorpo beta specifico prima della colorazione della curcumina rivela che la curcumina è completamente co-localizzata con una beta alle stesse placche che legano l'anticorpo.
Dopo la colorazione con curcumina etichettata come oligomeri beta, la co-localizzazione della curcumina con gli oligomeri può essere osservata in placche beta A. Allo stesso modo, la curcumina co-localizza anche con l'anticorpo A beta specifico negli spazi intracellulari, confermando che la macchia può etichettare la beta intracellulare A. L'etichettatura della curcumina è anche più prominente dei coloranti convenzionali per legatura amiloide.
I derivati della curcumina presenti negli estratti tumerici etichettano le placche beta A relativamente alla curcumina nel tessuto cerebrale del morbo di Alzheimer umano, indipendentemente dal tipo di mezzo di montaggio utilizzato. Inoltre, i segnali di immunofluorescenza della curcumina e l'intensità di controsottenimento vengono mantenuti anche dopo la colorazione con le tipiche macchie nucleari e altri marcatori cellulari. Abbiamo incontrato che le sezioni costanti dovrebbero essere più sottili di 40 micron.
Questa procedura di allenamento deve essere mantenuta sotto i 30 minuti e la concentrazione ottimale di curcumina è da uno a due micromolare. I biomarcatori ritardati a doppio livellamento possono essere eseguiti sullo stesso tessuto e possono fornire una maggiore specificità di quali tipi di cellule cerebrali vengono livellati. Dato che la curcumina può ridurre il carico della placca amiloide, i meccanismi precisi di come si verifica questo processo sono attualmente allo studio sia a livello cellulare che molecolare.
