This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.

Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Consiglio di Ricerca Etica degli animali alla McMaster University in accordo con il Consiglio Canadese Animal Care (CCAC) le linee guida. 1. radiomarcatura di ligandi Tz-tridentati con 99m Tc NOTA: Le seguenti procedure richiedono l&#39;uso di composti radioattivi. Il lavoro dovrebbe essere fatto solo in un laboratorio autorizzato con aderenza alle norme di sicurezza e di smaltimento. reazioni microonde devono essere eseguiti in un forno a microonde specificamente progettato per sintesi chimica. <ol><li> Sintesi di [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20 <ol><li> In una fiala forno a microonde, unire 8 mg K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg di Na 2 CO 3, 20 mg di Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O, e 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. spurgo la fiala per 10 minuti con gas argon. </li><li> Aggiungere 4 ml di 99m TcO 4 - (~ 1.100 MBq, ~ 30 MCI) in soluzione fisiologica 0,9% al flaconcino. </li><li> Riscaldare la reazione in un forno a microonde per 3,5 min a 110 ° C dopo 10 s di agitazione per assicurare una completa miscelazione dei reagenti. </li><li> Regolare il pH della soluzione a 3,5-4 utilizzando ~ 400 ml di 1 M HCl. Verificare utilizzando carta pH. </li></ol></li><li> Radiomarcatura di tetrazina ligandi 1-5 <ol><li> Sciogliere 2 mg di ciascun ligando (composti 1-5) in 250 ml MeOH 21. </li><li> Aggiungere 250 ml di [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 MCI) a ogni soluzione. </li><li> Riscaldare la miscela di reazione utilizzando un forno per 20 minuti a 60 ° C. NOTA: Questo passaggio era identica per tutti i 5 tetrazines. </li><li> Per composti 2- 5, si evapora il solvente e re-dissolve i prodotti risultanti in 1 ml di 1: 1 v / v DCM: TFA. </li><li> Riscaldare i prodotti di reazione disciolti (2-5) a 60 ° C in un forno a microonde per 6 minuti (2-4) o 10 min (5). </li><li> Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, si evapora il solvente usando un evaporatore (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6.000 rpm) e sciogliere il composto essiccato in 1: 1 ACN: H 2 O o 1: 1 MeOH: H 2 O, prima purificazione HPLC. </li><li> Purificare i 99m Tc-marcato composti (1-5), tra cui la separazione del prodotto etichettato da senza etichetta ligando tetrazina, utilizzando HPLC (C 18 in fase inversa). Tipicamente, utilizzare un gradiente di eluizione di 30:70 ACN: H 2 O (entrambi con 0,1% TFA) a 40:60 ACN: H 2 O oltre 20 min (18 min) e una analitica colonna C 18 4,6 x 100 mm. Utilizzare sia UV (254 nm) e la rilevazione di gamma. <ol><li> Prendere un piccolo campione di ciascun prodotto etichettato e confrontare il suo tempo di ritenzione HPLC a quella di un co-injette, non radioattivo, standard di Re-marcato (0,125 mg nel 20% di metanolo-H 2 O). Lo standard Re-marcato è identificato nella traccia UV HPLC, e verrà eluire al tempo stesso come il 99m Tc composto marcato nella traccia γ-HPLC. Questa co-iniezione mostra picchi a tempi di ritenzione comparabili, confermando l&#39;identità del 99m Tc-etichettato compound. </li></ol></li><li> Evaporare il solvente dalle frazioni HPLC utilizzando un evaporatore (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6,000 rpm). </li><li> Formulare il composto purificato ad una concentrazione di 7,4 kBq / ml in PBS, contenente 0,5% di BSA e 0,01% Tween-80. </li><li> Per garantire i composti marcati sono stabili, effettuare uno studio in vitro stabilità. Incubare il composto formulato a 37 ° C per 1, 4 e 6 h, iniettando una piccola quantità (3,7 MBq) della miscela sulla HPLC ad ogni tempo per valutare la stabilità. </li></ol></li></ol> 2. Studi Bio-Pre-distribuzione mirati <ol><li&gt; Preparazione degli animali <ol><li> Utilizzando 7-9 settimane di età, i topi femmina BALB / c (n = 3), amministrare TCO-BP formulato in soluzione salina (20 mg / kg) (5 mg / mL), mediante iniezione coda vena. </li><li> Posizionare il mouse in un dispositivo di contenzione fisica, e identificare le vene situate sulle superfici laterali della coda e pulire con un tampone imbevuto di alcol. A circa 2 cm dall&#39;estremità della coda, inserire un ago da 30 gauge con un angolo basso, parallelamente alla vena. Premere lentamente lo stantuffo per iniettare, rimuovere l&#39;ago ed applicare pulita garza al sito di iniezione con una leggera pressione fino a quando si arresta l&#39;emorragia. </li><li> Al 1 ore dopo l&#39;iniezione di TCO-BP, amministrare ~ 0,74 MBq (20 pCi) di 99m Tc-tetrazina formulati in 100 ml di 0,5% di BSA, 0,01% di Tween-80 in PBS, tramite iniezione coda vena. </li></ol></li><li> Studi Bio-distribuzione <ol><li> Al punto di tempo desiderato (t = 6 h), anestetizzare i topi utilizzando 3% isoflurano e miscela gassosa di ossigeno 2%. Dimostrare un ae un pizzico di ritiro sul mouse anestetizzato per assicurare che siano in aereo chirurgico di anestesia. </li><li> Raccogliere il sangue (1 mL) mediante puntura cardiaca usando una siringa pre-trattati con eparina. Posizionare il mouse sul dorso con il naso nel cono di naso per continuare l&#39;anestesia e individuare il processo xifoideo sull&#39;animale. <ol><li> Inserire un ago G 25, leggermente a sinistra della linea mediana dell&#39;animale sotto il processo xifoideo, ad un angolo di 20 °. Inserire completamente l&#39;ago, e lentamente tirare indietro lo stantuffo per vedere il sangue nel mozzo ago se il cuore è stato perforato. Leggermente regolare nuovamente l&#39;ago tenendo lo stantuffo se necessario, forare il cuore. Lentamente prelevare il sangue nella siringa. </li></ol></li><li> Eutanasia dell&#39;animale mediante dislocazione cervicale, mentre sotto anestesia. </li><li> Mettere ogni animale in un sacchetto di plastica e utilizzare un calibratore di dosi (99m impostazione Tc) per misurare tutto il livello di attività del corpo. </li><li> Raccogliere i seguenti tessuti e fluidi in pre-pesareEd contando tubi: sangue, midollo (ginocchio e della spalla), cistifellea, reni, fegato, dello stomaco (con il contenuto), piccolo intestino (con il contenuto), intestino crasso e cieco (con il contenuto), tiroide e trachea, vescica urinaria con l&#39;urina , e la coda. </li><li> Risciacquare tessuti idonei (ad esclusione del sangue, della cistifellea e vescica urinaria) in PBS per rimuovere il sangue e asciugare prima di mettere i tessuti nelle provette di conteggio appropriati. </li><li> Mettere carcassa animale in un sacchetto di plastica e misurare l&#39;attività residua di tutto il corpo con un calibratore di dosi. </li><li> Pesare ciascuna provetta contenente un campione di tessuto. Sottrarre peso iniziale del tubo per ottenere la massa del tessuto. </li><li> Utilizzare un calibratore di dosi (99m Tc impostazione) per misurare la quantità di attività in un campione di prova (100 mL) al momento dell&#39;iniezione per ogni mouse. NOTA: Questo campione è uguale al volume di iniezione, dando così il conteggio attività al momento dell&#39;iniezione. </li><li> Al momento della misurazione del tessuto, unliquot 5 ml di campione usato in precedenza. Utilizzare un contatore gamma multi-detector (99m impostazione Tc) e contare per ottenere il conteggio al minuto (CPM) per il campione 5 ml. </li><li> Utilizzare i due valori ottenuti in 2.2.9 e 2.2.10 per calcolare l&#39;attività e rapporto CPM con l&#39;equazione 1 per ottenere un fattore di conversione (CPM pCi -1). (1) <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" /></li><li> Utilizzare il contatore gamma per misurare la quantità di radioattività in ogni tessuto o campione di fluido. </li><li> Utilizzare equazione 1 per calcolare la quantità di attività in ciascun tessuto o fluido al momento della misura relativa alla dose totale iniettata. Questo valore viene quindi normalizzata per il peso degli organi e riportato come la dose percentuale iniettata per grammo (cioè,% ID / g) di tessuto. </li><li> Seguire i passaggi 2.1.2 a 2.2.13 per condurre un esperimento di controllo negativo utilizzando i 99m Tc-marcato ligandi tetrazina nel Absence di TCO-BP. topi sacrificio (n = 3) a 0.5, 1, 4 e 6 ore dopo l&#39;iniezione ed ottenere tessuti o fluidi come sopra descritto. </li></ol></li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

Una collezione di tetrazina linked chelati tridentati di polarità variabile è stata preparata, e l&#39;utilità dei loro complessi 99m Tc nella reazione IEDDA con un derivato TCO in vivo è stata valutata. Un metodo di etichettatura 99m Tc efficace e riproducibile stato sviluppato per cinque tetrazina chelati, dove la concentrazione del ligando era 10 -3 M. Il passo etichettatura è stata seguita da deprotezione del t-butil (per i composti 2-5). L&#39;elevata concentrazione di ligando è stato usato per migliorare la resa radiochimica e ridurre i tempi di reazione che minimizzare la degradazione della tetrazina 21. Il prodotto è stato isolato e separato dal ligando non marcato ed eventuali impurità radiochimica per HPLC, comportino rese radiochimica vanno dal 31-83%, con tutti aventi&gt; 99% di purezza radiochimica e un&#39;alta attività specifica di ~ 1,48 MBq / ug. Tutti i composti hanno dimostrato di essere stabile in PBS contenente 0.5% BSA e 0,01% Tween80 fino a 6 ore (Figura 3). composti bifosfonati, come TCO-BP, localizzano alle regioni del metabolismo osseo attivo o lesioni, che includono articolazioni del ginocchio e della spalla nei topi. TCO-BP fornisce quindi un mezzo semplice per valutare l&#39;efficacia di nuovi tetrazines radioattivi per fornire isotopi in vivo. Valutazione della bio-distribuzione di tutti i cinque 99m Tc-tetrazines assorbimento mostrato in articolazioni del ginocchio e della spalla 6 h dopo l&#39;iniezione, dimostrando successo pre-targeting osso in vivo (Figura 4). Precedenti studi hanno confermato che radiomarcato TCO-BP accumula all&#39;osso 18, mentre il costrutto 99m Tc-tetrazina (2) proposta da solo non fa (Figura 5). Questo permette di concludere che l&#39;assorbimento osseo era dovuta alla reazione IEDDA. I costrutti più lipofile 1 e 2 </strong&gt; avuto dati distribuzione simile compresa alto assorbimento nel ginocchio (9,1 ± 1,9 (1); 7.6 ± 2.7 (2)) e la spalla (4,6 ± 1,4 (1); 4,8 ± 1,9 (2)). Elevate concentrazioni di radioattività sono stati osservati anche nella cistifellea, fegato e intestino, che è coerente con la distribuzione del 99m Tc-lipofilo tetrazina composto 2 in assenza di TCO-BP (Figura 5). Altri tessuti non bersaglio e organi come il muscolo scheletrico e la milza non hanno mostrato alcun significativo assorbimento (&lt;1%) quando gli studi bio-distribuzione sono state eseguite sulle 99m Tc-tetrazines in assenza del TCO-BP (Figura 5) , in modo da questi organi non sono state prese per gli esperimenti pre-targeting. Inoltre, esperimenti di bio-distribuzione con i 99m Tc-alone tetrazines hanno rivelato una buona distanza dai tessuti non bersaglio a iniezione postale 6 h. Di conseguenza, this punto di tempo, che è entro un tempo di dimezzamento dell&#39;isotopo, è stata scelta come punto di tempo per confrontare i differenti ligandi tetrazina radiomarcati. Il 99m Tc-polare tetrazina composto più 3 recante una PEG 5 linker ha mostrato molto alto ginocchio e spalla assorbimento (16.2 ± 4.8 e 20.7 ± 4.9, rispettivamente). C&#39;era anche minore attività osservata nel fegato e nell&#39;intestino. La corrispondente PEG 10 derivato anche mostrato vincolante per l&#39;osso e ridotto assorbimento nel fegato rispetto ai composti 1 e 2. Il derivato più polare 5, mostrato inferiori vincolante rispetto a tutti gli altri costrutti che è probabile dell&#39;osso a causa della sua rapida clearance. La captazione ossea elevata e ossa: rapporti sangue (Tabella 1), in particolare per composti 3 e 4 dimostrano che pre-targeting e la reazione IEDDA possono essere utilizzati per loccomposti alize 99m Tc-etichettati in vivo. I metodi qui riportati possono essere utilizzati per valutare eventuali tetrazina radiomarcato compresa prossima generazione di Tc (I) ligandi -tetrazine. Va notato che per la classe di leganti che sono stati utilizzati in questo studio, le strutture possono essere facilmente variate cambiando la natura dei gruppi donatori e linker tra il complesso metallico e tetrazina, senza alterare significativamente il metodo di sintesi legante 21. Una volta che una molecola di piombo è identificato, un metodo kit istante, che probabilmente includerà metodi di purificazione in fase solida, può essere sviluppato per supportare traslazione clinica. Il TC (I) complessi riportati qui creano l&#39;opportunità di preparare nuovi radiofarmaci 99m Tc utilizzando una vasta gamma di diverse molecole TCO-derivato mira, tra cui gli anticorpi. Anticorpi, nonostante le loro proprietà di targeting eccellenti prima della creazione di tecnezio marcato tetrazines, non sarebbe typically essere utilizzato con 99m Tc causa della loro lenta clearance (giorni), che è molto più lungo del tempo di dimezzamento dell&#39;isotopo (~ 6 h). Un ulteriore applicazione della chimica qui riportato è che la stessa classe di ligandi può essere preparato con la beta emettitori radionuclidi 186 Re e 188 Re. I isostructural Re (I) analoghi degli agenti Tc (I) quando combinati con il tumore cerca proprietà di TCO-BP possono essere usati per trattare metastasi ossee.

99m Tc rimane il radioisotopo dominante utilizzato in medicina nucleare diagnostica, con oltre 50 milioni di procedure di imaging condotti ogni anno in tutto il mondo 1, 2, 3. La maggior parte degli agenti 99m Tc usati clinicamente sono di tipo perfusione radiofarmaci. Ci sono un numero limitato di composti mirati attivamente in cui 99m Tc è diretto ad associare un biomarker specifico mediante legatura ad un costrutto targeting. La creazione di 99m mirata Tc radiofarmaci è spesso ostacolato dalla influenza di 99m complessi Tc-ligando sulla capacità della molecola targeting impegnare la biomarker di interesse, o gli isotopi emivita non è sufficiente per l&#39;utilizzo con elevate biomolecole peso molecolare come gli anticorpi. Quest&#39;ultimo richiede tipicamente diversi giorni prima immagini sono acquisite in modo che la biomolecola cancellare da non bersaglio tiss<html> UES. Pre-targeting offre un approccio alternativo per superare queste sfide. Pre-targeting combinato con la chimica bioorthogonal ha dimostrato di essere un modo efficace per sviluppare nuove sonde imaging molecolare sia per fluorescenza e radio imaging 4, 5, 6, 7, 8. La domanda di elettroni inversa Diels-Alder (IEDDA) reazione tra 1,2,4,5-tetrazina (Tz) e derivati -cyclooctene trans (TCO), come mostrato nella Figura 1, ha dimostrato di essere particolarmente efficace 6. La reazione IEDDA con questi componenti può esibire una rapida cinetica in PBS (k 2 ≈ 6.000 M -1 s -1) e alta selettività, che lo rende ideale per in vivo pre-targeting applicazioni 9, 10. e_content &quot;&gt; L&#39;approccio più comune utilizzato implica la gestione di un vettore targeting TCO-derivati e dopo un periodo di ritardo sufficiente, un tetrazina radioattivo viene somministrato. tetrazines radioattivo sulla base di 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, e 111 sono stati segnalato 11, 12, 13, 14, 15. al contrario, c&#39;è solo un rapporto di un 99m Tc-etichettato Tz, che è stato preparato utilizzando un tipo ligando HYNIC richiedere l&#39;uso di co-ligandi per prevenire legame proteico e la degradazione in vivo 16. in alternativa, riportiamo qui la sintesi di 99m Tc (I) etichettato tetrazines utilizzando una famiglia di leganti che formano complessi stabili con tridentati [99m Tc (CO) 3] + nucleo. Figura 1: La reazione IEDDA bioorthogonal tra tetrazina e -cyclooctene trans. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> La famiglia di leganti preparati contengono chelati tridentati che variano in polarità e la natura del gruppo linker tra la regione di legame del metallo e Tz (Figura 2). L&#39;obiettivo era quello di individuare una 99m Tc-tetrazina costrutto che potrebbe efficacemente localizzare e reagire con i siti TCO-etichettati in vivo e rapidamente chiaro non collegate, al fine di produrre alta target-to-non-bersaglio rapporti. Per testare i ligandi, un TCO-derivato di un bisfosfonato (TCO-BP) è stato utilizzato 17. Abbiamo dimostrato in precedenza che il TCO-BP localizza alle aree di metabolismo osseo attivo e può reagire contetrazines radiomarcati in vivo 18. È un reagente conveniente per testare nuove tetrazines, perché può essere preparato in un&#39;unica fase e gli esperimenti può essere eseguita in topi normali dove localizzazione luogo soprattutto nelle articolazioni (ginocchia e spalle).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1378">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Argon gas&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Alphagaz</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2CO3</td>
			<td style="width:255px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:199px;">106395</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2B4O7.10H2O</td>
			<td style="width:255px;">Anachemia</td>
			<td style="width:199px;">S9640</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KNaC4H4O6.4H2O</td>
			<td style="width:255px;">Anachemia</td>
			<td style="width:199px;">217255</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Technelite 99mTc generator</td>
			<td style="width:255px;">Lantheus medical imaging</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td>Source of 99mTcO4-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">0.9% Saline</td>
			<td style="width:255px;">Lantheus medical imaging</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td>To elute generator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M HCl</td>
			<td style="width:255px;">Lab Chem</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MeOH</td>
			<td style="width:255px;">Caledon</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACN</td>
			<td style="width:255px;">Caledon</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Millipore H2O</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Barnstead Nanopure</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DCM</td>
			<td style="width:255px;">Caledon</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TFA</td>
			<td style="width:255px;">Caledon</td>
			<td style="width:199px;">---</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PBS</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:199px;">10010023</td>
			<td>pH 7.4 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">BSA</td>
			<td style="width:255px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">A7906</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tween80</td>
			<td style="width:255px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">P8047</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:255px;">CDMV</td>
			<td style="width:199px;">108737</td>
			<td>Supplier: Fresenius Kabi Animal Health&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:367px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Waters&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4</td>
			<td style="width:255px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:199px;">00G-4435-E0</td>
			<td>Gemini&#174; 5 &#181;m C18 110 &#197;, LC Column 250 x 4.6 mm,</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5</td>
			<td style="width:255px;">Waters&#160;</td>
			<td style="width:199px;">186003115</td>
			<td>XBridge BEH C18 Column, 130 &#197;, 5 &#181;m, 4.6 mm X 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microwave Reactor&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Biotage&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Initiator 8</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Biotage V10 Evaporator</td>
			<td style="width:255px;">Biotage&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Serial # V1041</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Dose calibrator</td>
			<td style="width:255px;">Capintec, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:199px;">CRC-25R</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">Gamma counter</td>
			<td style="width:255px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:199px;">Wizard 1470 Automatic Gamma Counter</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Animal room scale&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:199px;">XP105 Delta Range</td>
			<td style="width:559px;">---</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Microwave vials&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Biotage&#160;</td>
			<td style="width:199px;">355629</td>
			<td>0.5-2 mL&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and evaluation of 99mtc-labeled tridentate chelates for pre-targeting using bioorthogonal chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

I leganti sono stati sintetizzati utilizzando diversi linker e chelanti tramite una semplice strategia amminazione riduttiva (figura 2), seguita da accoppiamento del prodotto ad un tetrazina disponibile in commercio 22, 23. Radiomarcatura è stata effettuata utilizzando lo stesso metodo per tutti i composti ed era altamente riproducibile. Il processo è stato ottimizzato variando il pH, quantità di ligando, tempo di reazione e la temperatura dopo di che il 99m Tc-radiomarcato composti 1-5 sono stati ottenuti in moderata ad alta resa radiochimica: 83% (1), 45% (2), 31% (3), 42 (4)% e 54% (5). Dopo purificazione HPLC da legante non reagito ed evaporazione usando un evaporatore, i composti sono stati formulati in PBS contenente 0,5% di BSA e 0,01% Tween80 prima dell&#39;iniezione. L&#39;attività specifica del p<html> tetrazina urified 99m Tc-marcato era ~ 1,48 MBq / mg. Gli studi sono stati condotti per valutare la stabilità dei 99m Tc-marcato ligandi tetrazina prima degli studi in vivo. La stabilità è stata monitorata mediante HPLC a 1, 4 e 6 h senza degradazione visibile su 6 h (R t = 14 min), come visibile in figura 3 per il composto 4 come esempio. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55188/55188fig2.jpg" /> Figura 2: Composti 1-5 sono stati prodotti utilizzando diversi linker (Y) e chelanti (X) come mostrato (in basso). Tutti i composti sono stati radiomarcati con [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + usando le stesse condizioni di reazione (in alto), con l&#39;eccezione di 1, che non richiedeva stadio (ii). <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55188 / 55188fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3: risultati di test di stabilità utilizzando composti 4. tracce γ-HPLC su 4 incubate in PBS a 37 ° C per 1, 4 e 6 h. Per le prove in vivo, sono stati usati topi sani Balb / c. In breve, per ogni composto, gruppi di topi (n = 3) sono stati iniettati con TCO-BP (100 ml, 20 mg / kg), che è stata seguita dalla somministrazione di composti 99m Tc-etichettati 1 ore più tardi. A 6 ore dopo l&#39;iniezione delle 99m Tc complessi, gli animali sono stati sacrificati e le concentrazioni di attività in vari tessuti e fluidi determinati. I dati risultanti vengono riportati come percentuale della dose iniettata per grammo di tessuto (% ID / g) ed è mostrato in Figura 4. Indici rappresentativi di osso (ginocchio o spalla) al sangue per ciascuno dei composti Tz cinque 99m Tc-marcati sono riportati nella tabella 1. Questi dati indicano clpresto che mescola 3 fornito ottimale di targeting in combinazione con gioco dal sangue, e che non vi era notevole variazione tra i composti 99m Tc-etichettati in materia di non centra la porta di localizzazione dei tessuti. Uno studio negativo di controllo utilizzando topi CD1 (n = 3) è stata condotta, in cui i topi sono stati iniettati con ligandi 99m Tc-tetrazina in assenza di TCO-BP. I topi sono stati sacrificati a 0,5, 1, 4 e 6 h e% ID / g è stato determinato per tutti i tessuti e fluidi. Per tutti i composti testati, in cui i dati per il composto 2 è presentata nella figura 5, nessun assorbimento significativo è stato osservato in osso o altri tessuti (cuore, polmoni, milza, muscolo scheletrico) non mostrate in figura 4. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55188/55188fig4.jpg" /> Figura 4. Risultati Bio-distribuzione per 99m Tc-marcato derivati tetrazina 1-5 (bar indicaTed). I dati indicati sono stati ottenuti da tessuti selezionati e fluidi prelevati 6 ore dopo l&#39;iniezione dei derivati ​​radiomarcati, e l&#39;attività è stata normalizzata al tessuto o del peso del fluido, come percentuale media iniettato dose per grammo di tessuto o fluido (% ID / g) ± SEM. obiettivi Bone sono indicati da •. NOTA: Tutte le rimanenti tessuti non mostrati avuto media% ID / g che è stata inferiore all&#39;1%. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55188/55188fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55188/55188fig5.jpg" /> Figura 5. Risultati Bio-distribuzione per lo studio di controllo utilizzando tetrazina 99m Tc-marcato (2) senza iniezione prima di TCO-BP. I dati indicati sono stati ottenuti da tessuti selezionati e fluidi prelevati da 3 topi a 0,5, 1, 4, e 6 ore dopo l&#39;iniezione di 2. L&#39;attività è stata normalizzata al tessuto oil peso del fluido, come dose media cento iniettata per grammo di tessuto o fluido (% ID / g) ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55188/55188fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="5"> Composto </td></tr><tr><td> Rapporto </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Spalla: Blood </td><td> 3.5: 1 </td><td> 3.5: 1 </td><td> 21: 1 </td><td> 7.8: 1 </td><td> 0.8: 1 </td></tr><tr><td> Ginocchio: Blood </td><td> 6.9: 1 </td><td> 5.6: 1 </td><td> 26: 1 </td><td> 12: 1 </td><td> 1.3: 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. TESSUTO OSSEO: rapporti di sangue determinati da studi bio-distribuzione.

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Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Preparazione e valutazione di<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marcato tridentate chelati di pre-targeting Utilizzando Bioorthogonal Chimica

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

preparation-evaluation-99mtc-labeled-tridentate-chelates-for-pre

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

8.1K Views.  McMaster University. Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry. 

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Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1&#945; (Stromal cell-derived factor-1&#945;), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1&#945;-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1&#945; is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1&#945;, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1&#945; from the nanoparticles.

Preparazione e caratterizzazione di SDF-1α-Chitosan-Destrano solfato nanoparticelle

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Ricerca

Chimica

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparazione di Mica e Silicon substrati per il DNA Origami Analisi e sperimentazione

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Preparation of Biopolymer Aerogels Using Green Solvents

Although the first reports on aerogels made by Kistler1 in the 1930s dealt with aerogels from both inorganic oxides (silica and others) and biopolymers (gelatin, agar, cellulose), only recently have biomasses been recognized as an abundant source of chemically diverse macromolecules for functional aerogel materials. Biopolymer aerogels (pectin, alginate, chitosan, cellulose, etc.) exhibit both specific inheritable functions of starting biopolymers and distinctive features of aerogels (80-99% porosity and specific surface up to 800 m2/g). This synergy of properties makes biopolymer aerogels promising candidates for a wide gamut of applications such as thermal insulation, tissue engineering and regenerative medicine, drug delivery systems, functional foods, catalysts, adsorbents and sensors. This work demonstrates the use of pressurized carbon dioxide (5 MPa) for the ionic cross linking of amidated pectin into hydrogels. Initially a biopolymer/salt dispersion is prepared in water. Under pressurized CO2 conditions, the pH of the biopolymer solution is lowered to 3 which releases the crosslinking cations from the salt to bind with the biopolymer yielding hydrogels. Solvent exchange to ethanol and further supercritical CO2 drying (10 - 12 MPa) yield aerogels. Obtained aerogels are ultra-porous with low density (as low as 0.02 g/cm3), high specific surface area (350 - 500 m2/g) and pore volume (3 - 7 cm3/g for pore sizes less than 150 nm).

A new way for the production of biopolymer-based aerogels by carbon dioxide (CO2) induced gelation is shown. The technique utilizes pressurized carbon dioxide (5 MPa) for the production of biopolymer hydrogels and supercritical CO2 (12 MPa) to convert gels into aerogels. The only solvents needed besides CO2 are water and ethanol.

Preparazione del biopolimero Aerogels che utilizzano solventi verdi

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The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ethylene-propylene rubber, grafted with maleic anhydride, is thermo-reversibly cross-linked in two steps. The pending anhydride moieties are first modified with furfurylamine to graft furan groups to the rubber backbone. These pendant furan groups are then cross-linked with a bis-maleimide via a Diels-Alder coupling reaction. Both reactions can be performed under a broad range of experimental conditions and can easily be applied on a large scale. The material properties of the resulting Diels-Alder cross-linked rubbers are similar to a peroxide-cured ethylene/propylene/diene rubber (EPDM) reference. The cross-links break at elevated temperatures (&#62; 150 &#176;C) via the retro-Diels-Alder reaction and can be reformed by thermal annealing at lower temperatures (50-70 &#176;C). Reversibility of the system was proven with infrared spectroscopy, solubility tests and mechanical properties. Recyclability of the material was also shown in a practical way, i.e., by cutting a cross-linked sample into small parts and compression molding them into new samples displaying comparable mechanical properties, which is not possible for conventionally cross-linked rubbers.

A simple two-step approach involving rubber modification and cross-linking yields fully reworkable, elastic rubber products.

La preparazione e la proprietà di Thermo-reversibile reticolato Chimica Gomma Via Diels-Alder

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Simple Methods for the Preparation of Non-noble Metal Bulk-electrodes for Electrocatalytic Applications

The rock material pentlandite with the composition Fe4.5Ni4.5S8 was synthesized via high temperature synthesis from the elements. The structure and composition of the material was characterized via powder X-ray diffraction (PXRD), M&#246;ssbauer spectroscopy (MB), scanning electron microscopy (SEM), differential scanning calorimetry (DSC) and energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX). Two preparation methods of pentlandite bulk electrodes are presented. In the first approach a piece of synthetic pentlandite rock is directly contacted via a wire ferrule. The second approach utilizes pentlandite pellets, pressed from finely ground powder, which is immobilized in a Teflon casing. Both electrodes, whilst being prepared by an additive-free method, reveal high durability during electrocatalytic conversions in comparison to common drop-coating methods. We herein showcase the striking performance of such electrodes to accomplish the hydrogen evolution reaction (HER) and present a standardized method to evaluate the electrocatalytic performance by electrochemical and gas chromatographic methods. Furthermore, we report stability tests via potentiostatic methods at an overpotential of 0.6 V to explore the material limitations of the electrodes during electrolysis under industrial relevant conditions.

A facile preparation method of electrodes using the bulk material Fe4.5Ni4.5S8 is presented. This method provides an alternative technique to conventional electrode fabrication and describes prerequisites for unconventional electrode materials including a straightforward electrocatalytic testing method.

Metodi semplici per la preparazione di elettrodi di metallo non nobili per applicazioni elettrocatalitiche

The rock material pentlandite with the composition Fe4.5Ni4.5S8 was synthesized via high temperature synthesis from the elements. The structure and ...

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We present methods for depositing and passively manipulating C60 molecules on rippled graphene that advance the pursuit of realizing applications involving 1D C60/graphene hybrid structures. The techniques applied in this exposition are geared towards high vacuum systems with preparation areas capable of supporting molecular deposition as well as thermal annealing of the samples. We focus on C60 deposition at low pressure using a homemade Knudsen cell connected to a scanning tunneling microscopy (STM) system. The number of molecules deposited is regulated by controlling the temperature of the Knudsen cell and the deposition time. One-dimensional (1D) C60 chain structures with widths of two to three molecules can be prepared via tuning of the experimental conditions. The surface mobility of the C60 molecules increases with annealing temperature allowing them to move within the periodic potential of the rippled graphene. Using this mechanism, it is possible to control the transition of 1D C60 chain structures to a hexagonal close packed quasi-1D stripe structure.

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Here we present a protocol for the fabrication of C60/graphene hybrid nanostructures by physical thermal evaporation. Particularly, the proper manipulation of deposition and annealing conditions allow the control over the creation of 1D and quasi 1D C60 structures on rippled graphene.

Preparazione e caratterizzazione di nanostrutture ibride C60/Graphene

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Preparazione di stabile biciclico Aziridinium ioni e loro anello-apertura per la sintesi di Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally purify the same by acid elution. By combining sodium silicate with a polyfunctional bioinspired additive, silica is rapidly formed at ambient conditions upon neutralization. 
The effect of neutralization rate and biomolecule addition point on silica yield are investigated, and biomolecule immobilization efficiency is reported for varying addition point. In contrast to other porous silica synthesis methods, it is shown that the mild conditions required for bioinspired silica synthesis are fully compatible with the encapsulation of delicate biomolecules. Additionally, mild conditions are used across all synthesis and modification steps, making bioinspired silica a promising target for the scale-up and commercialization as both a bare material and active support medium.
The synthesis is shown to be highly sensitive to conditions, i.e., the neutralization rate and final synthesis pH, however tight control over these parameters is demonstrated through the use of auto titration methods, leading to high reproducibility in reaction progression pathway and yield. 
Therefore, bioinspired silica is an excellent active material support choice, showing versatility towards many current applications, not limited to those demonstrated here, and potency in future applications.

Here, we present a protocol to synthesize bioinspired silica materials and immobilize enzymes therein. Silica is synthesized by combining sodium silicate and an amine &#39;additive&#39;, which neutralize at a controlled rate. Material properties and function can be altered either by in situ enzyme immobilization or post-synthetic acid elution of encapsulated additives.

Preparazione di silice funzionale utilizzando un metodo bioinalati

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally ...

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different positions. Preclinical studies have shown that the therapeutic index of these traditional ADCs can be improved by the site-specific linkage of toxins. However, current approaches to produce homogeneous ADCs have several limitations, such as low protein expression and slow reaction kinetics. In this protocol we describe how to set up an expression system to incorporate a cyclopropene derivative of lysine (CypK) into antibodies using genetic code expansion. This minimal bioorthogonal handle allows rapid conjugation of tetrazine derivatives through an inverse-demand Diels-Alder cycloaddition. The expression system here reported enables the facile production and purification of trastuzumab bearing CypK in each of the heavy chains. We explain how to link the antibody to the toxin monomethyl auristatin E and characterize the immunoconjugate by hydrophobic interaction chromatography and mass spectrometry. Finally, we describe assays to assess the stability in human serum of the dihydropyridazine linkage resulting from the conjugation and to test the selective cytotoxicity of the ADC for breast cancer cells with high levels of HER2 receptor.

Incorporating a cyclopropene derivative of lysine into antibodies allows the site-specific, rapid and efficient linkage of tetrazine-bearing molecules to generate antibody-drug conjugates.

Codifica genetica di un aminoacido Non-canonica per la generazione di anticorpo-farmaco coniugati attraverso una reazione di Bioorthogonal veloce

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...