M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible. &#8195;

Dichiarazione di etica della ricerca: Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali descritti nel presente documento sono stati approvati dalla University of Southern California Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) ed eseguito in stretta conformità con National Institutes of linee guida per la salute e le raccomandazioni della Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento del laboratorio Animal Care International. 1. roditori Cervello Isolamento e preparazione per Immunocolorazione GIORNO 1: <ol><li> Posizionare ratti TgF344-AD di età (14 mesi) o APP / PS1 topi (12 mesi) in continuo anestesia isoflurano profonda (4%). Valutare la profondità di anestesia pinch punta e l&#39;assenza di recesso reflex. </li><li> Tagliare i due lati della gabbia toracica e sollevare per esporre il cuore. Inserire un ago G 23 nel ventricolo sinistro del cuore e fare una piccola incisione nell&#39;atrio destro. Procedere alla dissanguamento da perfusione transcardial con PBS ghiacciata(PBS) utilizzando una pompa peristaltica (30 mL per topi; 150 - 200 ml per i ratti). </li><li> Effettuare una incisione mediana caudale nella pelle e spostare la pelle ei muscoli da parte. Tagliare attraverso la parte superiore del cranio lungo la linea mediana e tra gli occhi. Rimuovere le piastre ossee e isolare l&#39;intero cervello dal cranio. </li><li> Mettere il cervello in una matrice roditore cervello coronale e si taglia in quarti. Incubare quarti posteriori O / N (16 h) in paraformaldeide fissativo (4% PFA in PBS) a 4 ° C. Lavare 3x in PBS, e poi il trasferimento al 70% di etanolo. Attenzione: PFA è tossico e deve essere manipolato sotto una cappa chimica con opportuni dispositivi di protezione individuale. </li></ol> GIORNO 2: <ol start="5"><li> Posizionare quarti cerebrali in cassette incorporamento e progressivamente disidratano tessuto in bagni di etanolo 1 h in successione più concentrate (70%, 80%, 95% e 100% x3). </li><li> Cancella l&#39;etanolo dal tessuto con tre bagni successivi xilene 100% (1 ora ciascuno). Attenzione: xilene è tossico e should essere trattati sotto una cappa chimica con opportuni dispositivi di protezione individuale. </li><li> Incorpora tessuti in blocchi di paraffina dopo due bagni fusi paraffina (56-58 ° C, 90 min ciascuna). </li></ol> 3 ° GIORNO: <ol start="8"><li> Tagliare 10 sezioni micron di spessore di cervelli in paraffina utilizzando un microtomo. sezioni Dip in un bagno d&#39;acqua (50 ° C per 1 min) e si applicano a vetrini da microscopio. Lasciare le diapositive asciugare O / N, garantendo l&#39;adesione dei tessuti alla diapositiva. </li></ol> 2. immunocolorazione Nota: differenti combinazioni di anticorpi possono essere utilizzati per la procedura di colorazione descritta di seguito. Cocktail di anticorpi compatibili con il tessuto cerebrale di ratti e topi sono elencati nella tabella 1. 4 ° GIORNO: <ol><li> Deparaffinare sezioni del cervello che utilizzano 2x 100% bagni xilene (12 min ciascuna). </li><li> Reidratare sezioni di cervello in bagni etanolo successive - 100% per 10 min, 95% per 5 min, 80% per 10 min, ed infine 70% per 15 min - followed da lavaggi PBS 3x [5 minuti a temperatura ambiente, con l&#39;agitazione luce]. Nel frattempo, il calore soluzione antigene di recupero di 95-97 ° C su una piastra calda con magnetica barra di agitazione. </li><li> Incubare sezioni di cervello in soluzione recupero dell&#39;antigene a 95 - 97 ° C per 30 min. Poi, lavare 3x in PBS (5 minuti a temperatura ambiente, con l&#39;agitazione della luce). </li><li> Rapidamente diapositive a secco che utilizzano delicati tergicristalli attività per evitare l&#39;essiccamento dei tessuti, e disegnare una barriera idrofobica intorno alla zona di tessuto con una penna barriera idrofoba. Riempire la regione tessuto circondato con tampone di bloccaggio [PBS contenente 0,3% Triton X-100 e il 10% Normal Donkey Serum (NDS)], ed incubare a temperatura ambiente per 1 h in una camera umidificata. </li><li> Sostituire tampone di bloccaggio con Iba1 anticorpo primario (diluito in tampone bloccante) per etichettare fagociti mononucleari, e incubare O / N a 4 ° C in una camera umidificata. Per gli host di anticorpi e diluizioni di lavoro, vedi Tabella 1 e la Tabella dei Materiali. </li></ol> GIORNO 5: <ol start="6"><li> Sciacquareanticorpo primario con i bagni 3x PBS (5 minuti a temperatura ambiente con agitazione luce). Incubare con immunofluorescenza secondario (coniugato con un fluorocromo di emissione 594 nm) per 1 h (in tampone di bloccaggio a RT al buio) seguita da bagni 3x PBS (5 min a RT agitazione luce). In questo momento, mantenere sezioni al buio per evitare fluorescente sbiancamento segnale. </li></ol> Giorno 6 - 7: <ol start="7"><li> Ripetere i punti 2.5 e 2.6 con CD68 (cervello dei topi) o LAMP1 (tessuto mouse) anticorpi e appropriati anticorpi secondari (accoppiato con un fluoroforo emissione di 488 nm) per etichettare phagolysosomes. </li></ol> Giorno 7 - 8: <ol start="8"><li> Ripetere i punti 2.5 e 2.6 con OC (tessuto di ratto) o 4G8 (cervello di topo) anticorpi e appropriati anticorpi secondari (accoppiato ad un fluoroforo 647 nm) per etichettare depositi Ap. NOTA: In alternativa, 6E10 anticorpo può essere utilizzato con successo sia sul topo e ratto tessuti. Per opportune combinazioni di anticorpi, vedere la tabella dei materiali </strong&gt;. </li><li> Lasciare sezioni completamente asciutta O / N a RT al buio. Poi, la copertura campioni con un vetrino sigillato da mezzi di montaggio fluorescenza contenenti DAPI. </li></ol> 3. Acquisizione di grande Z-stack confocale Dataset Nota: Questo protocollo richiede una scansione laser confocale completamente automatizzato dotato di un obiettivo 60X e 405 nm, 488 nm, 594 nm e 647 nm laser. Tutto l&#39;equipaggiamento è controllato da imaging e controllo laser software per computer. Prima di iniziare la procedura di imaging, accendere il computer, lampada epifluorescente, microscopio, laser e macchina fotografica. 9 ° giorno: <ol><li> Selezionare l&#39;obiettivo microscopio 60X. Aggiungere l&#39;olio di immersione alla lente, e posizionare il campione sul supporto del microscopio fase di diapositive. Sollevare l&#39;obiettivo finché l&#39;olio entra in contatto con la slitta. Regolare il piano focale per individuare placche amiloidi nell&#39;ippocampo o corteccia cerebrale che utilizzano illuminazione epifluorescente attraverso gli oculari. </li><li> Acquisire im confocaleetà compresa tra i fagociti mononucleari attivate circostanti depositi di amiloide nell&#39;ippocampo o corteccia di roditori mediante microscopia confocale (ingrandimento 60X, passi z-stack: 0.25 micron &lt;z &lt;0.40 micron, il numero di passi 25 &lt;n &lt;35). </li></ol> 4. q3DISM Nota: Al fine di produrre risultati significativi, si consiglia l&#39;analisi di un minimo di 3 immagini per animale / regione di interesse. Per ogni immagine, l&#39;abbondanza di cellule da analizzare può variare a seconda paradigmi sperimentali. Nei risultati rappresentativi riportati nella presente relazione, abbiamo analizzato 3 cellule / condizione (per esempio, fagociti mononucleari distanti da o associati a placche, vedi figure 1C - D e 2C - D). GIORNO 10: <ol><li> Analizzare i set di dati confocale con colocalization elaborazione delle immagini 3D e analisi scientifiche software (coloc) modulo per la vicinanza spaziale di Iba1 / CD68 (tessuto di ratto) o Iba1 / LAMP1 (tessuto mouse) colorazione in tutte le z-aerei simultaneamente.Creare Iba + / CD68 + o canali Iba + / + LAMPADA1 colocalizzazione che corrispondono a phagolysosomes all&#39;interno di fagociti mononucleari attivate. <ol><li> Selezionare TRITC per il canale A (corrispondente al Iba1 colorazione accoppiato con 594 nm fluoroforo) e FITC per il canale B (corrispondente al CD68 o colorazione LAMPADA1 accoppiato con 488 nm fluoroforo). Sul lato destro della finestra del software per il &#39;controllo modalità,&#39; selezionare &#39;soglia&#39; e per &#39;intensità coloc,&#39; Select &#39;canali sorgente. </li><li> Fare clic su &#39;Modifica&#39; per selezionare &#39;colore coloc&#39; sul lato destro della finestra del software. </li><li> Per ogni canale in modo indipendente, regolare le soglie per includere colorazione specifica ed escludere sfondo / segnali non specifici. Una volta regolato, non modificare le soglie tra le immagini al fine di garantire un&#39;analisi imparziale. I voxel colocalized (pixel da tutti gli z-stack) apparirà nel colore selezionato al punto 4.1.2 in tutte le z-stack SIMultaneously. </li><li> Fare clic su &#39;costruire canale Coloc&#39;. Il canale co-localizzazione creato apparirà nella finestra di regolazione del display. </li><li> Fare clic sul canale coloc per aprire le statistiche del canale. Il &#39;% del volume / materiale A di sopra della soglia colocalized&#39; rappresenta la% di segnale Iba1 (voxel corrispondente al fluoroforo 594 nm) colocalizzava con LAMPADA1 o il segnale CD68 (voxel corrispondente al fluoroforo 488 nm). Più semplicemente, questo è il volume occupato da monociti phagolysosomes (vedi figure 1C e 2C). NOTA: &#39;% del volume / materiale B di sopra della soglia colocalized&#39; corrisponde ad% di LAMPADA1 o CD68 segnale colocalized con Iba1. Questo dovrebbe essere vicino al 100%, come phagolysosomes sono strutture intracellulari. I valori sono basati sul rapporto tra segnale da tutte z-stack sopra soglia colocalized. </li></ol></li><li> Utilizzando il modulo coloc, analizzare il canale coloc creato nel passo 4.1 per la vicinanza spaziale con OC (ti rattoSSUE) o 4G8 (tessuto mouse) segnali Ap. Ciò consente la quantificazione di Ap incapsulati all&#39;interno phagolysosomes. <ol><li> Selezionare il canale A dataset coloc (corrispondente al Iba1 / CD68 o canale Iba1 / LAMP1 coloc creato nel passo 4.1) e Cy5 per il canale B (corrispondente a OC o 4G8 colorazione accoppiato con 647 nm fluoroforo). </li><li> Costruire un canale coloc come descritto ai punti 4.1.2 a 4.1.5. </li><li> Fare clic sul canale coloc per aprire le statistiche del canale. Il &#39;% del volume / materiale A di sopra della soglia colocalized&#39; rappresenta la% di Iba1 / LAMPADA1 o Iba1 / CD68 (voxel corrispondente al canale coloc costruito nel punto 4.1.5.) Colocalized con OC o il segnale 4G8 (voxel corrispondente al 647 nm fluoroforo). Questo è il volume occupato da fagolisosomale Ap (vedi figure 1D e 2D). NOTA: &#39;% del volume / materiale B di sopra della soglia colocalized&#39; corrisponde% del segnale Ap totale colocalized con phagolysosomes.Questo può essere utilizzato per valutare la frazione dei depositi totali Ap incapsulati all&#39;interno phagolysosomes (non mostrato nelle presenti risultati rappresentativi). </li></ol></li><li> Utilizzare il modulo superare per ricostruire le pile di immagini confocale e generare modelli 3D di A? Incapsulati all&#39;interno phagolysosomes monociti. <ol><li> Nella finestra &#39;di regolazione del display&#39;, selezionare TRITC (per mostrare colorazione solo Iba1). Nella finestra &#39;Proprietà volume&#39;, clicca su &#39;aggiungi nuova superficie&#39;. </li><li> Nel passo &#39;1/5 algoritmo&#39;, in &#39;Impostazioni&#39;, selezionare &#39;superficiale.&#39; Inoltre, in &#39;colore&#39;, selezionare il tipo di colore nella tavolozza o RGB e regolare la trasparenza (rosso è fissato al 60% di trasparenza nelle figure 1B e 2B). Casella &#39;di selezionare la regione di interesse&#39;. Fare clic su Avanti. </li><li> Nel passaggio &#39;2/5 regione di interesse,&#39; disegnare una finestra attorno alla cella di interesse regolando x, y, z coordinate (vedi caselle bianche in figure 1A </strong&gt; e 2A). Fare clic su Avanti. </li><li> Nel passaggio &#39;3/5 canale sorgente&#39;, selezionare il canale di origine TRITC. Selezionare la casella &#39;liscia&#39;, e impostare il livello di dettaglio superficie di 0,4 micron. Per &#39;soglia&#39;, selezionare l&#39;intensità assoluta. Fare clic su Avanti. </li><li> Nel passaggio &#39;4/5 soglia,&#39; regolare soglia in modo che il volume creato sovrappone perfettamente con il segnale del canale TRITC. Fare clic su Avanti. </li><li> Nel passaggio &#39;5/5 classificare superfici,&#39; nella sezione &#39;filtro&#39;, selezionare gli oggetti in base alla loro dimensione per includere o escludere dai volumi da creare. Fare clic su Fine, eseguire tutte le fasi di creazione, e uscire dalla procedura guidata. </li><li> Ripetere i punti da 4.3.1 a 4.3.6 per creare una superficie 3D per il canale FITC (LAMPADA1 + o CD68 + phagolysosomes). </li><li> Ripetere i punti da 4.3.1 a 4.3.6 per creare una superficie 3D per il canale Cy5 (OC + o depositi 4G8 + Ap). </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+amyloid+plaques+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).</li><li>Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -. A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-Microglia+Cross+Talk+through+Complement+Activation+Modulates+Amyloid+Pathology+in+Mouse+Models+of+Alzheimer's+Disease.">Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease.</a> J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).</li><li>Novotny, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Synthetic+A&#946;+to+In+Vivo+Active+Seeds+and+Amyloid+Plaque+Formation+in+a+Hippocampal+Slice+Culture+Model.">Conversion of Synthetic A&#946; to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model.</a> J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).</li><li>Tartaro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fluorescence-based+in+vivo+phagocytosis+assay+to+measure+mononuclear+phagocyte+system+function+in+the+rat.">Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat.</a> J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo che descriviamo in questa relazione per una vera quantificazione 3D di Ap fagocitosi in vivo dai fagociti mononucleari si basa sulla etichettatura specifica dei compartimenti cellulari e subcellulari così come depositi di Ap. In particolare, usiamo Iba1 (ionizzata-calcio Binding Adaptor molecola 1), una proteina che è coinvolta nella arruffarsi membrana e fagocitosi delle cellule dopo l&#39;attivazione 18, 19, a macchia fagociti mononucleari cerebrali. Mentre le cellule Iba1 + sono generalmente considerati come microglia del cervello residente, resta possibile che perifericamente infiltranti fagociti mononucleari comprendono un sottogruppo di cellule immunolabeled. Phagolysosomes intracellulari vengono rivelati con anticorpi riconoscere i membri della famiglia Lysosomal / glicoproteina di membrana endosomal-associato (LAMP): LAMPADA1 20 o CD68 21. Quest&#39;ultimo è localizzato principalmente lisosomi e endosomi, con una frazione minore circolazione alla cella sla tua faccia. LAMPADA1 e CD68 anticorpi sono stati utilizzati con successo sia nel tessuto ratto e nel topo, e la decisione su quale usare dipende in primo luogo la miriade di altri anticorpi utilizzati per la co-colorazione (vedi Tabella 1). È importante tenere presente che vari anticorpi possono essere utilizzati per il rilevamento di Ap. Nel tessuto del mouse, 4G8 (riconoscendo residui di aminoacidi del mouse umani e 17 - 24 di Ap peptide 22, Figura 1) e 6E10 (riconoscimento di residui di aminoacidi umano 1-17 23, i dati non riportati) sono stati utilizzati con successo, permettendo la rilevazione e quantificazione di contenuti Ap in LAMPADA1 + o CD68 + phagolysosomes presenti in fagociti mononucleari Iba1 +. Utilizzando la nostra metodologia q3DISM, abbiamo osservato un aumento del carico Ap a + cellule Iba1 connessi con la riduzione globale di carico Ap nel cervello dei APPPS1 / IL-10 - / - mice 16, mentre altri hanno mostrato diminuito assorbimento Ap in Iba1 + &lt;<html> / sup&gt; cellule accompagnati da carico e placca aumento del volume Ap nel cervello di Rag-5xfAD topi 24. Questi risultati suggeriscono che il fenomeno osservato è una &quot;istantanea&quot; attiva fagocitosi Ap, anche se il metodo non può essere usato per predire se il materiale fagocitato è efficacemente digerito ed eliminato. Nel tessuto ratto, abbiamo rilevato depositi Ap utilizzando OC (riconoscendo solubili Ap 42 oligomeri / fibrille 25,26, Figura 2) o 6E10 17 (non mostrato). È interessante notare che, molto poco OC + fibrille erano presenti in phagolysosomes monociti nel cervello di ratto TgF344-AD. Questo fenomeno è stato riportato in precedenza in APP23 topi transgenici che utilizzano immunogold colorazione e la ricostruzione 3D 27. Nota: una varietà di anticorpi per il rilevamento di differenti specie / Ap conformeri sono disponibili e possono potenzialmente essere testato e impiegato a discrezione dell&#39;utente. nt &quot;&gt; nostra tecnica q3DISM è stata adottata da noi e altri per quantificare Ap fagocitosi nel contesto AD 16,24,28. Tuttavia, il metodo può essere adattato per valutare praticamente qualsiasi forma di fagocitosi. Esso può essere applicato anche ai tessuti diverso il cervello, e ad altre specie animali (uomo compreso). le procedure descritte in questo protocollo si basano su immunostaining di serie, rilevato con fluorescenza e ripreso con un microscopio confocale. in questo rapporto, abbiamo utilizzato il tessuto incluso in paraffina secondo le linee guida fornite dai produttori di anticorpi. Se lo si desidera, la presente protocollo potrebbe anche essere ottimizzato per tessuto fresco (incorporato in 2% agarosio in PBS). il protocollo può anche essere ottimizzato per rilevare fagocitosi di coaggregating proteine. Ciò è reso possibile dalla colorazione e acquisendo immagini composte da più di 4 colori fluorescenti 29. In questo caso, la creazione del primo canale colocalizzazione (monociti / fagolisosoma) sarà seguita dalla creazionedi un secondo canale colocalizzazione (aggregate proteina 1 / co-aggregati protein 2). Poi, i due canali sarebbero stati utilizzati per l&#39;analisi e modellazione 3D. La tecnica q3DISM è limitata principalmente dalla specificità e sensibilità di immunostaining, qualità di anticorpi, e l&#39;approccio colocalizzazione. Questa procedura multistep ha alcuni potenziali insidie ​​che possono influenzare la qualità della colorazione e, quindi, quantificazione 3D di Ap assorbimento. Il primo passo fondamentale della procedura è l&#39;isolamento di cervello di roditori. Infatti, la gestione attenta dei tessuti è fondamentale per evitare danni al cervello e per garantire che le strutture cerebrali rimangono intatti quando sezionato. In secondo luogo, tempo di fissazione dei tessuti è molto importante in quanto un eccesso di fissaggio (più di 16 ore in 4% PFA) limiti di rivelazione di phagolysosomes subcellulari e contenuti Ap. È importante sottolineare che la colorazione successiva di 1), 2) monociti phagolysosomes e 3) Ap è critico per il successo del metodo. E &#39;EssentIAL per utilizzare gli anticorpi non consecutively- concomitanza. Inoltre, l&#39;acquisizione delle z-stack immagini confocali è di estrema importanza, poiché modellazione 3D di cellule, phagolysosomes e Ap peptide nonché colocalizzazione analisi dipende dalla qualità delle immagini di strutture cellulari e subcellulari attraverso lo spessore della sezione di tessuto. Infine, la regolazione delle soglie nel software è di fondamentale importanza per la modellazione 3D e per l&#39;analisi colocalizzazione. Infatti, le soglie per i vari canali devono essere scelti con cura, poiché condizionano il quale segnale è incluso (specifico) o escludere (background) dall&#39;analisi. È anche essenziale che le soglie prescelte restano coerenti tra i campioni nel caso del confronto di diversi animali / campioni. Finora, immunohistostaining classica, la risonanza magnetica e la tomografia ad emissione di positroni sono stati i metodi di imaging di scelta per la visualizzazione in vivo e la quantificazione di A?30. Anche se molto utile per la quantificazione su larga scala di carico di amiloide nel cervello di roditori o pazienti AD, questi metodi sono inefficienti per la visualizzazione di intracellulare Ap. Altre tecniche che utilizzano la microscopia confocale, spettroscopia di fluorescenza e citometria a flusso esistono e sono state utilizzate da noi e gli altri di discriminare e quantificare il contenuto Ap intracellulare in vitro 16,31,32. Colorazione immunogold accoppiato con ricostruzione 3D è stato precedentemente utilizzato per evidenziare l&#39;assenza di fibrille amiloidi all&#39;interno microglia in vivo in APP23 topi transgenici 27, e un altro studio ha utilizzato con successo confocale di imaging e 3D ricostruzione superficie della microglia-associata a placche beta-amiloide a mostrare Ap limitata interazione e assorbimento 33. Tuttavia, queste tecniche non consentono per la quantificazione degli scambi intra-specie fagolisosomale Ap. Altri hanno recentemente sviluppato un basato sulla fluorescenza in vivo test permette di misuraredi attività fagocitaria dai macrofagi periferici nel ratto 34. Questo metodo consente ingegnosamente per la quantificazione di bioprobes fluorescenti phagolysosomes in vivo, tuttavia, i dati finora disponibili sono limitate alla periferia. A nostra conoscenza, q3DISM è il primo metodo che permette la visualizzazione 3D e la quantificazione di Ap fagocitosi nel cervello di modelli di roditori AD. Questo strumento formidabile senza dubbio aprire la strada ad una più profonda comprensione cerebrale fagocitosi Ap, e può rivelarsi utile anche in altri contesti.

La malattia di Alzheimer (AD), la demenza legata all&#39;età più comune 1, è caratterizzata da accumulo cerebrale amiloide-β (Ap) come placche &quot;senili&quot; beta-amiloide, neuroinfiammazione cronica di basso livello, tauopathy, perdita neuronale, e disturbi cognitivi 2 . In AD cervelli di pazienti, neuroinflammation è destinato dagli astrociti e fagociti mononucleari reattiva (indicato come microglia, anche se le loro centrali vs. origine periferica rimane poco chiaro) che circonda depositi Ap 3. Come le sentinelle del sistema immunitario innato del sistema nervoso centrale, microglia sono posizionati centralmente per cancellare il cervello Ap. Tuttavia, il reclutamento della microglia placche Ap è accompagnata da molto piccolo, all&#39;occorrenza, Ap fagocitosi 4,5. Una ipotesi è che la microglia sono inizialmente neuroprotettivi da phagocytozing piccole assemblee di Ap. Tuttavia, alla fine queste cellule diventano neurotossico come opprimente fardello Ap e / o legate all&#39;età d funzionaleecline, provoca microglia in un fenotipo proinfiammatoria disfunzionale, contribuendo alla neurotossicità e cognitivo declino 6. Recenti studi genome-wide (GWAS Association) hanno identificato un gruppo di alleli di rischio AD appartenenti al nucleo innate percorsi immunitario 7 che modulano la fagocitosi 8-11. Di conseguenza, la risposta immunitaria alla deposizione di amiloide cerebrale è diventato un importante area di interesse, sia in termini di comprensione AD eziologia e per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici 12-14. Tuttavia, vi è la necessità vitale per metodologia per valutare fagocitosi Ap in vivo. Per rispondere a questa necessità insoddisfatte, abbiamo sviluppato 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) per consentire una vera quantificazione 3D cerebrale fagocitosi Ap dai fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer-like. Limitata solo dalla misura in cui esse ricapitolare malattia, modelli animali hannodimostrato prezioso per la comprensione AD pathoetiology e per la valutazione delle terapie sperimentali. A causa del fatto che le mutazioni nei geni presenilina (PS) e della proteina precursore dell&#39;amiloide (APP) causano indipendentemente autosomica dominante dC, questi transgeni mutanti sono stati ampiamente utilizzati per generare modelli di roditori transgenici. Topi transgenici APP / PS1 coexpressing simultaneamente &quot;svedese&quot; mutante umano APP (APP SWE) e Δ esone 9 mutante presenilina umana 1 (PS1ΔE9) presente con accelerata amiloidosi cerebrale e neuroinfiammazione 15,16. Inoltre, abbiamo generato topi bi-transgenici coinjected con APP SWE e costrutti PS1ΔE9 (linea TgF344-AD, su uno sfondo di Fischer 344). A differenza dei modelli di topi transgenici di amiloidosi cerebrale, ratti TgF344-AD sviluppano amiloide cerebrale che precede tauopathy, perdita apoptotica di neuroni, e compromissione del comportamento 17. In questo rapporto, si descrive un protocollo per immunostaining microglia, phagolysosomes e depositi Ap in sezioni del cervello di topi APP / PS1 e ratti TgF344-AD, e l&#39;acquisizione di immagini di grandi dimensioni confocale z-dimensionale. Noi dettaglio nella generazione e l&#39;analisi di veri ricostruzioni 3D di set di dati confocale che consentono la quantificazione di Ap assorbimento in phagolysosomes microgliali silico. Più in generale, la metodologia che we dettaglio qui può essere utilizzato per quantificare praticamente qualsiasi forma di fagocitosi in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:384px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:152px;">Abbott</td>
			<td style="width:127px;">NDC 0044-5260-05</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Dissecting scissors Blunt tip</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">82027-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Tweezers</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>94024-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">23G needle</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>BD305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">peristaltic pump FH10</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td>72-310-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:152px;">Bioland Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PBS01-02</td>
			<td>Working concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Kent Scientific</td>
			<td>RBMS-200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Kent Scientific</td>
			<td>RBMS-305C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:152px;">EMS</td>
			<td style="width:127px;">15714-S</td>
			<td>Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Ethanol</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Various concentrations, see protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>25608-774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Embedding and Infiltration Paraffin</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>15147-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Microtome Leica RM2125</td>
			<td style="width:152px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Disposable Microtome Blades&#160;</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Water bath Leica HI 1210</td>
			<td style="width:152px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Micro slide Superfrost plus</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Xylene</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">534056-4X4L</td>
			<td style="width:249px;">Caution: Toxic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Target Retrieval Solution 10X</td>
			<td style="width:152px;">DAKO</td>
			<td style="width:127px;">S1699</td>
			<td>Working concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KimWipes</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Hydrophobic PAP pen</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">95025-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:152px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:127px;">017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Coverslips</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">48393081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Glass Slide Rack</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">100492-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Iba1 antibody (polyclonal, rabbit)</td>
			<td style="width:152px;">Wako</td>
			<td style="width:127px;">019-19741&#160;</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Iba1 antibody (polyclonal, goat)</td>
			<td style="width:152px;">LifeSpan Bioscience</td>
			<td style="width:127px;">LS-B2645</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse)</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td style="width:127px;">ab955</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat)</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td style="width:127px;">ab53444</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat)</td>
			<td style="width:152px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:127px;">14-1071</td>
			<td>Working concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse)</td>
			<td style="width:152px;">Covance</td>
			<td style="width:127px;">SIG-39220</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse)</td>
			<td style="width:152px;">Covance</td>
			<td style="width:127px;">SIG-39320</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">OC antibody (polyclonal, rabbit)</td>
			<td colspan="2">Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 488&#160; mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">A-11001</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 488&#160; rat secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 594 goat secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11080</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21443</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:152px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">A1 Confocal microscope</td>
			<td style="width:152px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">NIS Elements Advanced Research software</td>
			<td style="width:152px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Imaris:Bitplane software version 7.6</td>
			<td style="width:152px;">Bitplane</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>&#34;coloc&#34; and &#34;supass&#34; modules are used.&#160;Alternatively, the open-source freeware&#160;ImageJ can be used for colocalization&#160;analysis of confocal z-stacks datasets.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative 3d in silico modeling (q3dism) of cerebral amyloid-beta phagocytosis in rodent models of alzheimer's disease

Neuroinfiammazione è ormai riconosciuto come un importante fattore eziologico nella malattia neurodegenerativa. fagociti mononucleari sono cellule immunitarie innate responsabili della fagocitosi e la bonifica di detriti e detriti. Queste cellule sono macrofagi CNS residenti note come microglia, e fagociti mononucleari infiltrati dalla periferia. La microscopia ottica è stata generalmente utilizzati per la visualizzazione fagocitosi in roditori o campioni di cervello umano. Tuttavia, i metodi qualitativi non hanno fornito la prova definitiva di fagocitosi in vivo. Qui, descriviamo 3D quantitativa nella modellazione in silico (q3DISM), un metodo affidabile che permette una reale quantificazione 3D di amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori malattia di Alzheimer (AD). Il metodo consiste nel visualizzare fluorescente Ap incapsulato all&#39;interno phagolysosomes nelle sezioni roditore cervello. Grandi serie di dati confocale z-dimensionale vengono poi ricostruite in 3D per la quantificazione di A &amp;# 946; spazialmente colocalized all&#39;interno del fagolisosoma. Dimostriamo l&#39;applicazione di successo di q3DISM di topo e ratto cervello, ma questa metodologia può essere esteso a qualsiasi evento di fagocitosi in qualsiasi tessuto.

Utilizzando la metodologia più stadi per q3DISM dettagliato sopra, siamo in grado di quantificare l&#39;assorbimento Ap in phagolysosomes monociti nel cervello di APP / PS1 topi (figura 1) e ratti TgF344-AD (Figura 2). Pertanto, la metodologia q3DISM ha permesso l&#39;analisi dei fagociti mononucleari in modelli di topo e ratto di AD. È interessante notare che il volume occupato da CD68 + phagolysosomes è significativamente aumentata in fagociti mononucleari Iba1 + associati rispetto alla distanza dalle placche sia nei ratti TgF344-AD (Figura 2B, C) APP / PS1 topi (Figura 1B, C) e. Questi dati mostrano che fagociti mononucleari vicino placche sono pronti per la fagocitosi rispetto alle cellule situate lontano dalla placca. Al fine di illustrare la gamma di dati da macchie diversi conformeri Ap, abbiamo utilizzato vari anticorpi nel topo e nel tessuto di ratto (dettagliato in TaBLE 1 e discussione) - noi non stiamo cercando di confrontare direttamente i modelli topi e ratti di AD per quanto riguarda la A? fagocitosi. Ciò nonostante, è stato degno di nota che placca associato fagociti mononucleari erano aumentati Ap assorbimento nei topi APP / PS1 rispetto alle cellule distanti dal placche (Figura 1D). Ratti TgF344-AD avuto molto modesto assorbimento di fibrille Ap complessiva, e nessun cambiamento in Ap fibrille fagocitosi in funzione della distanza da placche (Figura 2D). <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54868/54868table1.jpg" /> Tabella 1: Immunocolorazione Mononuclear fagociti, phagolysosomes e Amiloide-β nel tessuto cerebrale di topi APP / PS1 o ratti TgF344-AD. Ratto o il topo specifici cocktail di anticorpi sono elencati con il loro rispettivo ospite in parentesi. I colori indicano il fluoroforo utilizzato per l&#39;anticorpo secondario. Rosso: Alexa Fluor 594; verde: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54868/54868fig1.jpg" /> Figura 1: Visualizzazione e quantificazione di amiloide-β fagocitosi in Brains APP / PS1 mouse. (A) immagini confocale di sezioni del cervello da un mouse / PS1 APP che mostrano Iba1 cellule + (rosso), LAMP1 + phagolysosomes (verde) e 4G8 + depositi di amiloide (magenta). Inserto 1 mette in evidenza una fagociti mononucleari distante dalla targa, mentre inserto 2 mostra una fagociti mononucleari associato alla targa. barra della scala indica 50 micron. Pannelli più piccoli sulla destra sono ingrandimenti di Iba1, LAMPADA1 e 4G8 segnali all&#39;interno inserti 1 e ricostruzione 2. (B) 3D di Iba1, LAMPADA1 e segnali 4G8 per inserti 1 e 2. Barra di scala denota 3 micron. (C) Quantificazione del Iba1 + volume di fagociti mononucleati occupato da LAMP1 + phagolysosomes. ( <strong&gt; D) quantitativa di intracellulare LAMPADA1 + fagolisosomale volume occupato dal 4G8 + Ap. I valori sono basati sul rapporto del segnale (voxel) sopra la soglia che sono colocalizzava. I dati sono mostrati come media ± errore standard della media (n = 6 cellule) per fagociti mononucleari lontane dalle placche (1), o associata a placche (2). ** P &lt;0.01 da test t. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54868/54868fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54868/54868fig2.jpg" /> Figura 2: Visualizzazione e quantificazione di amiloide-β fagocitosi nel cervello dei topi TgF344-AD. (A) immagini confocale di sezioni del cervello di un ratto TgF344-AD mostrano cellule Iba1 + (rosso), CD68 + phagolysosomes (verde), e OC + solubile fibrillare A &amp; #<html> 946; (magenta). Inserto 1 mette in evidenza una fagociti mononucleari distante dalla targa, mentre inserto 2 mostra una fagociti mononucleari associato alla targa. barra della scala indica 50 micron. Pannelli più piccoli sulla destra sono ingrandimenti di Iba1, CD68 e segnali OC all&#39;interno di inserti 1 e 2. (B) ricostruzione 3D di Iba1, CD68 e segnali OC per inserti 1 e 2. Barra di scala denota 3 micron. (C) Quantificazione del Iba1 + volume di fagociti mononucleati occupato da CD68 + phagolysosomes. (D) La determinazione quantitativa di intracellulare CD68 + fagolisosomale volume occupato da OC + Ap. I valori sono basati sul rapporto del segnale (voxel) sopra la soglia che sono colocalizzava. I dati sono mostrati come media ± errore standard della media (n = 6 cellule) per fagociti mononucleari lontane dalle placche (1), o associata a placche (2). ** P &lt;0.01 da test t.rge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Abbiamo sviluppato una metodologia per il 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) di cerebrale amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer. Questo metodo può essere generalizzato per la quantificazione di praticamente qualsiasi evento fagocitaria in vivo.

3D Quantitative<em&gt; In Silico</em&gt; Modeling (q3DISM) di cerebrale amiloide-beta fagocitosi in roditori modelli di malattia di Alzheimer

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

quantitative-3d-silico-modeling-q3dism-cerebral-amyloid-beta

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

7.9K Views.  University of Southern California (USC).  Abbiamo sviluppato una metodologia per il 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) di cerebrale amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer. Questo metodo può essere generalizzato per la quantificazione di praticamente qualsiasi evento fagocitaria in vivo. 

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Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer's Disease

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic mild cognitive impairment (aMCI) and Alzheimer's disease (AD). Whereas behavioral data inform us about the patients' performance, ERPs allow us to record discrete changes in brain activity. Further, ERPs can give us insight into the onset, duration, and interaction of independent cognitive processes associated with memory retrieval. In patient populations, these types of studies are used to examine which aspects of memory are impaired and which remain relatively intact compared to a control population. The methodology for collecting ERP data from a vulnerable patient population while these participants perform a recognition memory task is reviewed. This protocol includes participant preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis. In addition to basic setup and acquisition, we will also demonstrate localization techniques to obtain greater spatial resolution and source localization using high-density (128 channel) electrode arrays.

The methodology for collecting high-density event-related potential data while patients with Alzheimer's disease perform a recognition memory task is reviewed. This protocol will include subject preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis.

Esaminando le caratteristiche della memoria episodica con potenziali evento-correlati nei pazienti con malattia di Alzheimer

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic ...

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Medicina

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Corsa di modellazione in Mouse: Coagulazione permanente dell&#39;arteria cerebrale media distale

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-elettrodi array registrazioni di umano Epileptic postoperatoria corticale del tessuto

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

L&#39;uso di ultra-alto campo MRI in piccolo roditore modelli di malattia del rene policistico per<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotipizzazione and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle proliferation and obliteration of pulmonary arterioles. This in turn results in right ventricular (RV) failure, with significant morbidity and mortality. Rodent models of PAH, in the mouse and the rat, are important for understanding the pathophysiology underlying this rare disease. Notably, different models of PAH may be associated with different degrees of pulmonary hypertension, RV hypertrophy and RV failure. Therefore, a complete hemodynamic characterization of mice and rats with PAH is critical in determining the effects of drugs or genetic modifications on the disease. 
Here we demonstrate standard procedures for assessment of right ventricular function and hemodynamics in both rat and mouse PAH models. Echocardiography is useful in determining RV function in rats, although obtaining standard views of the right ventricle is challenging in the awake mouse. Access for right heart catheterization is obtained by the internal jugular vein in closed-chest mice and rats. Pressures can be measured using polyethylene tubing with a fluid pressure transducer or a miniature micromanometer pressure catheter. Pressure-volume loop analysis can be performed in the open chest. After obtaining hemodynamics, the rodent is euthanized. The heart can be dissected to separate the RV free wall from the left ventricle (LV) and septum, allowing an assessment of RV hypertrophy using the Fulton index (RV/(LV+S)). Then samples can be harvested from the heart, lungs and other tissues as needed.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease of pulmonary arterioles that leads to their obliteration and the development of right ventricular failure. Rodent models of PAH are critical in understanding the pathophysiology of PAH. Here we demonstrate hemodynamic characterization, with right heart catheterization and echocardiography, in the mouse and rat.

Emodinamica Caratterizzazione di roditori modelli di ipertensione arteriosa polmonare

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It is well established that synapse loss and ensuing neurodegeneration are the best predictors for memory impairments in AD. Latest studies have emphasized the neurotoxic role of soluble amyloid-beta oligomers (A&#946;o) that begin to accumulate in the human brain approximately 10 to 15 yr before the clinical symptoms become apparent. Many reports indicate that soluble A&#946;o correlate with memory deficits in AD models and humans. The A&#946;o-induced neurodegeneration observed in neuronal and brain slice cultures has been more challenging to reproduce in many animal models. The model of repeated A&#946;o infusions shown here overcome this issue and allow addressing two key domains for developing new disease modifying therapies: identify biological markers to diagnose early AD, and determine the molecular mechanisms underpinning A&#946;o-induced memory deficits at the onset of AD. Since soluble A&#946;o aggregate relatively fast into insoluble A&#946; fibrils that correlate poorly with the clinical state of patients, soluble A&#946;o are prepared freshly and injected once per day during six days to produce marked cell death in the hippocampus. We used cannula specially design for simultaneous infusions of A&#946;o and continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps. This innovative in vivo method can now be used in preclinical studies to validate the efficiency of new AD therapies that might prevent the deposition and neurotoxicity of A&#946;o in pre-dementia patients.

To study the effects of A&#946;o in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble A&#946;o coupled with continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of A&#946;o.

Neurodegenerazione in un modello animale di cronica amiloide-beta Oligomer infusione viene neutralizzata da anticorpi trattamento infuso con pompe osmotiche

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated measurements over weeks or months of accessory respiratory muscle activity while simultaneously measuring ventilation in a non-anesthetized, freely behaving mouse. The technique includes the surgical implantation of a radio transmitter and the insertion of electrode leads into the scalene and trapezius muscles to measure the electromyogram activity of these inspiratory muscles. Ventilation is measured by whole-body plethysmography, and animal movement is assessed by video and is synchronized with electromyogram activity. Measurements of muscle activity and ventilation in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are presented to show how this tool can be used to investigate how respiratory muscle activity changes over time and to assess the impact of muscle activity on ventilation. The described methods can easily be adapted to measure the activity of other muscles or to assess accessory respiratory muscle activity in additional mouse models of disease or injury.

This paper introduces a method for repeated measurements of ventilation and respiratory muscle activity in a freely behaving amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mouse model throughout disease progression with whole-body plethysmography and electromyography via an implanted telemetry device.

Misurazione ripetuta di attività muscolare respiratoria e ventilazione in modelli murini di malattie neuromuscolari

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Application of Granger Causality Analysis of the Directed Functional Connection in Alzheimer's Disease and Mild Cognitive Impairment

Impaired functional connectivity in the Default Mode Network (DMN) may be involved in the progression of Alzheimer&#39;s Disease (AD). The Posterior Cingulate Cortex (PCC) is a potential imaging marker for monitoring the progression of AD. Previous studies did not focus on the functional connectivity between the PCC and nodes in regions outside the DMN, but our study is an effort to explore these overlooked functional connections. For collecting data, we used functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) and Granger Causality Analysis (GCA). fMRI provides a non-invasive method for studying the dynamic interactions between the different brain regions. GCA is a statistical hypothesis test for determining whether one-time series is useful in forecasting another. In simple terms, it is judged by comparing the &#34;Known all the information on the last moment, the distribution of the probability of X at this time&#34; and the &#34;Known all the information on the last moment except Y, the distribution of the probability of X at this time&#34;, to determine whether there is a causal relationship between Y and X. This definition is based on the complete information source and stationary chronological sequence. The main step of this analysis is to use X and Y to establish the regression equation and draw a causal relationship by a hypothetical test. Since GCA can measure causal effects, we used it to investigate the anisotropy of the functional connectivity and explore the hub function of the PCC. Here, we screened 116 participants for MRI scanning, and after preprocessing the data obtained from neuroimaging, we used GCA to derive the causal relationship of each node. Finally, we concluded that the directed connection is significantly different between the Mild Cognitive Impairment (MCI) and AD groups, both from the PCC to the whole brain and from the whole brain to the PCC.

Based on resting-state functional magnetic resonance imaging with Granger causality analysis, we investigated the alterations in the directed functional connectivity between the posterior cingulate cortex and whole brain in patients with Alzheimer&#39;s Disease (AD), patients with Mild Cognitive Impairment (MCI), and healthy controls.

Applicazione dell'analisi di causalità di Granger del diretto collegamento funzionale nella malattia di Alzheimer e Mild Cognitive Impairment

Impaired functional connectivity in the Default Mode Network (DMN) may be involved in the progression of Alzheimer&#39;s Disease (AD). The Posterior ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...