M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible. &#8195;

Declaração de ética em pesquisa: Todos os experimentos envolvendo animais detalhados aqui foram aprovados pela University of Southern California Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e realizado em estrita conformidade com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e recomendações da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório animal Care International. 1. Rodent isolamento Cérebro e Preparação para imunocoloração DIA 1: <ol><li> Coloque ratos TgF344-AD com idade (14 meses de idade) ou APP ratos / PS1 (12 meses de idade), sob anestesia isoflurano profunda contínua (4%). Avaliar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé e ausência de reflexo de retirada. </li><li> Cortar ambos os lados da caixa torácica e levante para expor o coração. Inserir uma agulha G 23 para o ventrículo esquerdo do coração e fazer uma pequena incisão no átrio direito. Continuar a exsanguinação por perfusão transcardial com soro fisiológico tamponado com fosfato arrefecido com gelo(PBS) utilizando uma bomba peristáltica (30 mL para ratos; 150-200 mL para ratos). </li><li> Fazer uma incisão na linha média na pele caudal e mover a pele e músculo de lado. Cortar através da parte superior do crânio, ao longo da linha média e entre os olhos. Retirar as placas ósseas e isolar todo o cérebro do crânio. </li><li> Coloque o cérebro em uma matriz de roedores cérebro coronal e cortá-lo em quartos. Incubar quartos posteriores S / N (16 h) no fixador de paraformaldeído (PFA a 4% em PBS) a 4 ° C. Lavar 3x em PBS, e depois transferir para 70% de etanol. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser tratado sob um capuz químico com equipamento de protecção individual adequado. </li></ol> DIA 2: <ol start="5"><li> Coloque trimestres cerebrais em cassetes de embebimento e progressivamente desidratar o tecido em banhos de etanol 1 h sucessivamente mais concentrada (70%, 80%, 95%, e 100% x3). </li><li> Limpar o etanol a partir do tecido com três banhos sucessivos de xileno a 100% (1 h cada). Atenção: O xileno é tóxico e should ser tratadas sob um capuz químico com equipamento de protecção individual adequado. </li><li> Incorporar tecidos em blocos de parafina depois de dois banhos de fundição de cera de parafina (56-58 ° C, 90 min cada). </li></ol> DIA 3: <ol start="8"><li> Cortar 10 seções mm de espessura de cérebros embebidos em parafina usando um micrótomo. secções mergulhar em um banho de água (50 ° C durante 1 min) e aplicam-se a lâminas de microscópio. Deixar as lâminas secar S / N, garantindo adesão do tecido à lâmina. </li></ol> 2. A imunocoloração Nota: Diferentes combinações de anticorpos pode ser utilizada para o procedimento de coloração descrito a seguir. Misturas de anticorpos compatíveis com tecido cerebral de ratos e murganhos são listados na Tabela 1. DIA 4: <ol><li> Desparafinar secções cerebrais usando 2x 100% banhos de xileno (12 min cada). </li><li> Rehidratar secções do cérebro em banhos sucessivos de etanol - 100% durante 10 min, 95% durante 5 min, 80% durante 10 min, e, finalmente, 70% durante 15 min - followed por lavagens PBS 3x [5 min à temperatura ambiente, com agitação luz]. Enquanto isso, o calor solução de recuperação de antígenos a 95-97 ° C em uma placa quente com agitação barra magnética. </li><li> Incubar secções do cérebro em solução de recuperação de antigénio a 95-97 ° C durante 30 min. Em seguida, lavar 3x em PBS (5 min à temperatura ambiente, com agitação leve). </li><li> Rapidamente lâminas secas usando limpadores tarefa delicada para evitar a secagem do tecido, e desenhar uma barreira hidrofóbica ao redor da área do tecido com uma caneta barreira hidrofóbica. Encher o tecido região cercada com tampão de bloqueio [PBS contendo 0,3% de Triton X-100 e 10% de soro normal burro (NDS)], e incubar à temperatura ambiente durante 1 h numa câmara humidificada. </li><li> Substituir tampão com anticorpo primário Iba1 (diluído em tampão de bloqueio) a rotular fagócitos mononucleares, e incubar O / N a 4 ° C numa câmara humidif içada de bloqueio. Para hosts de anticorpos e diluições de trabalho, consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais. </li></ol> DIA 5: <ol start="6"><li> Rinseanticorpo primário com banhos 3x PBS (5 min à temperatura ambiente com agitação leve). Incubar com anticorpo fluorescente secundário (conjugado com um fluoróforo de emissão 594 nm) durante 1 h (em tampão à TA no escuro bloqueio) seguido de banhos 3x com PBS (5 min à temperatura ambiente com agitação luz). Neste momento, manter secções no escuro para evitar branqueamento sinal fluorescente. </li></ol> Dia 6 - 7: <ol start="7"><li> Repita os passos 2.5 e 2.6 com CD68 (cérebros de ratos) ou anticorpos LAMP1 (tecido mouse) e anticorpos secundários apropriados (juntamente com um fluoróforo emissão de 488 nm) para rotular phagolysosomes. </li></ol> DIA 7-8: <ol start="8"><li> Repita os passos 2.5 e 2.6 com OC (tecido de rato) ou anticorpos 4G8 (cérebro do rato) e anticorpos secundários apropriados (acoplado a um fluoróforo 647 nm) para rotular depósitos de Ap. NOTA: Como alternativa, o anticorpo 6E10 pode ser utilizado com sucesso tanto em tecidos do rato e rato. Para combinações de anticorpos adequado, consulte a Tabela de Materiais </strong&gt;. </li><li> Permitir seções completamente O seco / N à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, cobrir amostras com uma lamela selada por meios de montagem de fluorescência contendo DAPI. </li></ol> 3. Aquisição de grande Z-stack confocal conjuntos de dados Nota: Este protocolo requer um rastreio por laser microscópio confocal totalmente automatizado equipado com uma objectiva 60X e 405 nm, 488 nm, 594 nm e 647 nm lasers. Todo o equipamento é controlado por computador pelo software de imagem e controle laser. Antes de iniciar o protocolo de imagem, ligue o computador, lâmpada de epifluorescência, microscópio, lasers e câmera. DIA 9: <ol><li> Escolha a objetiva do microscópio 60X. Adicione o óleo de imersão para a lente, e colocar a amostra no suporte de microscópio estágio slide. Elevar o objetivo até que o óleo faz contato com o slide. Ajuste o plano focal para localizar placas amilóides no hipocampo ou córtex cerebral usando iluminação de epifluorescência através das oculares. </li><li> Adquirir im confocalidades de fagócitos mononucleares ativadas circundantes depósitos de amilóide no hipocampo ou córtex de roedores por microscopia confocal (60X ampliação, passos z-stack: 0,25 mm &lt;z &lt;0,40 mm, número de etapas de 25 &lt;n &lt;35). </li></ol> 4. q3DISM Nota: A fim de produzir resultados significativos, sugerimos analisar um mínimo de 3 imagens por animal / região de interesse. Para cada imagem, a abundância de células a analisar pode variar dependendo de paradigmas experimentais. Nos resultados representativos apresentados neste relatório, foram analisadas 3 células / condição (por exemplo, fagócitos mononucleares distantes ou associados com placas; ver Figuras 1C - D e 2C - D). DIA 10: <ol><li> Analisar conjuntos de dados confocal com co-localização de processamento de imagem 3D científico e análise de software (Coloc) módulo de proximidade espacial de Iba1 / CD68 (tecido de rato) ou Iba1 / LAMP1 (tecido mouse) coloração em todos os z-aviões simultaneamente.Criar Iba + / CD68 + ou canais Iba + / LAMP1 + co-localização que correspondem a phagolysosomes dentro de fagócitos mononucleares ativadas. <ol><li> Escolha TRITC para o canal A (correspondente a coloração Iba1 acoplada com 594 nm fluoróforo) e FITC para o canal B (que corresponde a CD68 ou coloração LAMP1 acoplada com 488 nm fluoróforo). No lado direito da janela do software para &#39;verificação modo,&#39; selecionar &#39;limite&#39; e por &#39;intensidades COLOC,&#39; selecionar &#39;canais de origem&#39;. </li><li> Clique em &quot;Editar&quot; para selecionar &quot;cor Coloc &#39;no lado direito da janela do software. </li><li> Para cada canal de forma independente, ajustar os limites para incluir coloração específica e não incluem sinais de fundo / não-específicos. Uma vez ajustado, não altere os limites entre as imagens para garantir uma análise imparcial. Os voxels colocalized (pixels de todos os z-stacks) será exibido na cor selecionada na etapa 4.1.2 em todas as z-stacks SIMultaneously. </li><li> Clique em &#39;construir canal Coloc&#39;. O canal de co-localização criado aparecerá na janela de ajuste de display. </li><li> Clique no canal Coloc para abrir estatísticas de canal. A &quot;% de volume de material / A acima limiar colocalized &#39;% representa o sinal de Iba1 (voxels correspondentes ao fluoróforo 594 nm) co-localizada com LAMP1 ou sinal de CD68 (voxels correspondentes ao fluoróforo 488 nm). Mais simplesmente, este é o volume ocupado pelos monócitos fagolisossomas (ver Figuras 1C e 2C). NOTA: &#39;% do volume de material / B acima do limiar colocalized&#39; corresponde a% de sinal LAMP1 ou CD68 colocalized com Iba1. Isto deve ser próximo de 100%, como fagolisossomas são estruturas intracelulares. Os valores são baseados na proporção de sinal de todos os z-stacks acima do limiar colocalized. </li></ol></li><li> Usando o módulo Coloc, analisar o canal Coloc criado na etapa 4.1 para proximidade espacial com OC (ti ratossue) ou 4G8 (tecido mouse) sinais de Ap. Isto permite a quantificação de Ap encapsulado dentro de fagolisossomas. <ol><li> Seleccionar o canal Um conjunto de dados Coloc (correspondente ao Iba1 / CD68 ou Iba1 / LAMP1 Coloc canal criado no passo 4.1) e Cy5 para o canal B (que corresponde a coloração ou OC 4G8 acoplada com 647 nm fluoróforo). </li><li> Construir um canal Coloc como descrito nos passos 4.1.2 a 4.1.5. </li><li> Clique no canal Coloc para abrir estatísticas de canal. A &quot;% de volume de material / A acima limiar colocalized &#39;representa a% de Iba1 / ou LAMP1 Iba1 / CD68 (voxels correspondente ao canal Coloc construído no passo 4.1.5.) Co-localizada com CO ou sinal 4G8 (voxels correspondente ao 647 fluoróforo nm). Este é o volume ocupado por fagolisossï¿½ico Ap (ver Figuras 1D e 2D). NOTA: &#39;% do volume de material / B acima do limiar colocalized&#39; corresponde a% de sinal de Ap total de colocalized com phagolysosomes.Isto pode ser usado para avaliar a fracção do total dos depósitos de Ap encapsulados dentro de fagolisossomas (não mostrado nos presentes resultados representativos). </li></ol></li><li> Use o módulo superar para reconstruir as pilhas de imagens confocal e gerar modelos 3D de Ap encapsulados dentro phagolysosomes monócitos. <ol><li> Na janela &quot;ajuste display &#39;, selecione TRITC (para mostrar coloração única Iba1). Na janela &quot;Propriedades de volume&quot;, clique em &quot;adicionar nova superfície&quot;. </li><li> No passo &#39;1/5 algoritmo&#39;, em &#39;Configurações&#39;, selecione &#39;superfície&#39;. Além disso, em &#39;cor&#39;, selecione o tipo de cor na paleta ou RGB e ajustar a transparência (vermelho é de transparência de 60% nas Figuras 1B e 2B). a caixa de seleção &quot;selecionar a região de interesse&quot;. Clique ao lado. </li><li> No Passo &#39;2/5 região de interesse, &quot;desenhar uma janela em torno da célula de interesse, ajustando X, Y e Z coordenadas (ver caixas brancas nas Figuras 1A </strong&gt; e 2A). Clique ao lado. </li><li> No Passo &#39;3/5 canal de origem &quot;, selecione o canal de origem TRITC. Marque a caixa &quot;suave&quot;, e definir o nível de detalhe área de superfície a 0,4 mm. Para &quot;limiar&quot;, selecione intensidade absoluta. Clique ao lado. </li><li> Na Etapa &#39;4/5 limiar,&#39; ajustar o limiar de forma que o volume criado sobrepõe-se perfeitamente com o sinal de canal TRITC. Clique ao lado. </li><li> No Passo &#39;5/5 classificar superfícies &quot;, na seção&quot; tipo de filtro &quot;, selecionar objetos dependendo do seu tamanho para ser incluído ou excluído dos volumes a serem criados. Clique em Concluir, executar todas as etapas de criação, e sair do assistente. </li><li> Repita os passos 4.3.1 a 4.3.6 para criar uma superfície 3D para o canal FITC (LAMP1 + ou CD68 + fagolisossomas). </li><li> Repita os passos 4.3.1 a 4.3.6 para criar uma superfície 3D para o canal Cy5 (depósitos 4G8 + Ap OC + ou). </li></ol></li></ol>

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L., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-Microglia+Cross+Talk+through+Complement+Activation+Modulates+Amyloid+Pathology+in+Mouse+Models+of+Alzheimer's+Disease.">Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease.</a> J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).</li><li>Novotny, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Synthetic+A&#946;+to+In+Vivo+Active+Seeds+and+Amyloid+Plaque+Formation+in+a+Hippocampal+Slice+Culture+Model.">Conversion of Synthetic A&#946; to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model.</a> J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).</li><li>Tartaro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fluorescence-based+in+vivo+phagocytosis+assay+to+measure+mononuclear+phagocyte+system+function+in+the+rat.">Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat.</a> J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O protocolo que descrevemos neste relatório para a verdadeira quantificação 3D de Ap fagocitose in vivo pelos fagócitos mononucleares depende de rotulagem específica dos compartimentos celulares e subcelulares, bem como depósitos de Ap. Especificamente, usamos Iba1 (ionizada-se ligar à molécula de cálcio Adaptador 1), uma proteína que está envolvida em membrana ruffling e fagocitose por activação de célula 18, 19, para corar os fagócitos mononucleares cerebrais. Enquanto as células Iba1 + são geralmente considerados como microglia cerebral residente, continua a ser possível que perifericamente fagócitos mononucleares infiltrantes compreender um subconjunto de células imunomarcadas. Phagolysosomes intracelulares são reveladas com anticorpos que reconhecem membros da família Lisossomal / glicoproteína de membrana associada à endossomal (LAMP): LAMP1 20 ou CD68 21. Este último está localizada principalmente para os lisossomas e dos endossomas, com uma fracção menor que circula à s célulasseu rosto. Anticorpos LAMP1 e CD68 têm ambos sido utilizado com sucesso no tecido de rato e rato, ea decisão sobre qual usar é principalmente dependente do acolhimento de outros anticorpos utilizados para co-coloração (ver Tabela 1). É importante ter consciência de que vários anticorpos podem ser utilizados para a detecção de Ap. Em tecidos de rato, 4G8 (reconhecendo os resíduos de aminoácidos de rato humanos e 17-24 de péptido Ap 22, Figura 1) e 6E10 (reconhecendo os resíduos de aminoácidos humana 1-17 23, dados não mostrados) foram usados com sucesso, permitindo a detecção e quantificação do conteúdo de Ap no LAMP1 + ou CD68 + phagolysosomes presentes em fagócitos mononucleares Iba1 +. Usando nossa metodologia q3DISM, observou-se aumento da carga de Ap em células Iba1 + associados à redução global de carga Aâ em cérebros de APPPS1 / IL-10 - / - ratos 16, enquanto outros mostraram redução da captação de Ap em Iba1 + &lt;<html> / sup&gt; células acompanhados por aumento de carga e placa de volume de Ap em cérebros de Rag-5xfAD ratos 24. Estes resultados sugerem que o fenómeno observado é um &quot;instantâneo&quot; de fagocitose Ap activo, embora o nosso método não pode ser utilizado para prever se o material fagocitado é digerido de forma eficiente e limpa. Em tecidos de rato, foi detectada utilizando depósitos de Ap OC (reconhecendo solúveis Ap 42 oligómeros / fibrilas 25,26, Figura 2) ou 6E10 17 (não mostrado). Curiosamente, muito pouco OC + fibrilas estavam presentes em phagolysosomes monócitos em cérebros de ratos TgF344-AD. Esse fenômeno tem sido relatado anteriormente em ratinhos transgénicos APP23 usando coloração imuno e reconstrução 3D 27. Nota: uma variedade de anticorpos para a detecção de diferentes espécies de Ap / confórmeros estão disponíveis e podem potencialmente ser testados e utilizados à discrição do utilizador. nt &quot;&gt; A nossa técnica q3DISM foi adoptada por nós e outros para quantificar Ap fagocitose no contexto da AD 16,24,28. No entanto, o método pode ser adaptado para avaliar virtualmente qualquer forma de fagocitose. Também pode ser aplicada a tecidos diferente do cérebro, e para outras espécies animais (incluindo seres humanos). os procedimentos descritos neste protocolo dependem de imunomarcação padrão, detectado com fluorescência e fotografada com um microscópio confocal. neste relatório, utilizou-se o tecido embebido em parafina de acordo com as directrizes fornecida pelos fabricantes de anticorpo. Se desejado, o protocolo pode também ser optimizada para o tecido fresco (incorporado em 2% de agarose em PBS). o protocolo também pode ser optimizado para detectar a fagocitose de coaggregating proteínas. Isto é tornado possível através da coloração e adquirir imagens composto por mais de 4 cores fluorescentes 29. neste caso, a criação do primeiro canal de colocalização (monócitos / fagolisossomo) seria seguido por criaçãode um segundo canal de co-localização (agregados de proteína 1 / co-agregados de proteína 2). Em seguida, os dois canais seria utilizada para a análise e modelagem 3D. A técnica q3DISM é limitada principalmente pela especificidade e sensibilidade da imunocoloração, a qualidade de anticorpos, e uma co-localização abordagem. Este procedimento de passos múltiplos tem alguns potenciais problemas que podem afectar a qualidade da coloração e, por conseguinte, a quantificação de Ap 3D de absorção. O primeiro passo crucial do processo é o isolamento de cérebros de roedores. Com efeito, a manipulação cuidadosa de tecidos é fundamental para evitar danos no cérebro e para garantir que as estruturas cerebrais permanecer intacta quando segmentado. Em segundo lugar, o tempo de fixação do tecido é muito importante uma vez que o excesso de fixação (mais de 16 h em 4% PFA) limita a detecção de phagolysosomes subcelulares e conteúdo de Ap. Importante, a coloração sucessivas de 1), 2) monócitos fagolisossomas e 3) Ap é crítico para o sucesso do método. É Essential para utilizar os anticorpos não consecutively- concomitantemente. Além disso, a aquisição das imagens confocais Z-pilha é da maior importância, uma vez que a modelagem 3D de células, e fagolisossomas péptido Ap, bem como co-localização analisa dependem da qualidade da imagiologia de estruturas celulares e subcelulares através da espessura da secção de tecido. Finalmente, o ajuste de limiares no software é crucial para a modelagem 3D e para a análise de co-localização. Com efeito, os limiares para os diferentes canais necessitam de ser cuidadosamente escolhido, uma vez que irá determinar qual o sinal é incluído (específico) ou excluídos (fundo) a partir da análise. É também fundamental que os limiares escolhidos permanecem consistentes entre amostras no caso de a comparação de diferentes animais / espécimes. Até agora, immunohistostaining clássica, tomografia de ressonância e de emissão de positrões magnética têm sido os métodos de imagem de escolha para visualização in vivo e quantificação de Ap30. Embora altamente útil para a quantificação em grande escala de carga amilóide nos cérebros de roedores ou de pacientes com AD, estes métodos são ineficientes para a visualização de Ap intracelular. Outras técnicas usando microscopia confocal, espectroscopia de fluorescência e citometria de fluxo existem e têm sido utilizados por nós e outros para discriminar e quantificar o conteúdo de Ap intracelular in vitro 16,31,32. Coloração imuno juntamente com reconstrução 3D foi usado anteriormente para destacar a ausência de fibrilas amilóides dentro microglia in vivo em APP23 camundongos transgênicos 27, e outro estudo utilizado com sucesso confocal de imagem e 3D reconstrução da superfície da microglia associada com placas de beta-amilóide para mostrar Ap limitada interação e absorção 33. No entanto, estas técnicas não permitem a quantificação da intra-fagolisossï¿½ico espécies de Ap. Outros têm desenvolvido recentemente um fluorescência baseado no ensaio in vivo, permitindo a mediçãoda atividade fagocítica pelos macrófagos periféricos em ratos 34. Este método permite que engenhosamente para quantificação de bioprobes fluorescentes em fagolisossomas in vivo, no entanto, os dados disponíveis até agora estão limitados a periferia. Para nosso conhecimento, q3DISM é o primeiro método que permite a visualização 3D e quantificação de Ap fagocitose nos cérebros de roedores modelos AD. Esta ferramenta formidável, sem dúvida, abrir o caminho para uma compreensão mais profunda cerebral fagocitose Aâ, e também pode ser útil em outros contextos.

Doença de Alzheimer (AD), a demência relacionada com a idade mais comum 1, caracteriza-se pela acumulação de amilóide cerebral-β (Ap) como placas &quot;senis&quot; beta-amilóide, neuroinflamaï¿½o baixo nível crónica, taupatia, perda neuronal, e perturbação cognitiva dois . No AD cérebros de pacientes, neuroinflamação é destinada pelos astrócitos e fagócitos mononucleares reativa (referido como microglia, embora as suas centrais vs. origem periférica permanece obscuro) em torno depósitos Ap 3. Como as sentinelas imunes inatas do SNC, microglia são posicionados centralmente para limpar Ap cérebro. No entanto, o recrutamento da microglia para placas de Ap é acompanhada por muito pouco, se algum, fagocitose Ap 4,5. Uma hipótese é que microglia são inicialmente neuroprotetor por phagocytozing pequenas montagens de Ap. No entanto, eventualmente estas células se tornam neurotóxico como carga Ap esmagadora e / ou d funcional relacionada com a idadeecline, provoca microglia em um fenótipo pró-inflamatório disfuncional, contribuindo para a neurotoxicidade e declínio cognitivo 6. Estudo de associação genômica ampla Recentes (GWAS) identificaram um conjunto de alelos de risco AD pertencentes ao núcleo vias imunitárias inatas 7 que modulam a fagocitose 8-11. Consequentemente, a resposta imune a deposição de amilóide cerebral tornou-se uma grande área de interesse, tanto em termos de compreender a etiologia AD e para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas 12-14. No entanto, existe uma necessidade vital para a metodologia para avaliar a fagocitose Ap in vivo. Para atender a essa necessidade não satisfeita, temos desenvolvido 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) para permitir uma verdadeira quantificação 3D da cerebral fagocitose Ap por fagócitos mononucleares em modelos de roedores de doença de Alzheimer-like. Limitado apenas pelo grau em que a doença recapitular, os modelos animais têmcomprovada de valor inestimável para a compreensão AD pathoetiology e para avaliar terapêutica experimental. Devido ao facto de que as mutações nos genes presenilina (PS) e da Proteína Precursora Amilóide (APP) independentemente causar AD autossómica dominante, estes transgenes mutantes têm sido extensivamente usados ​​para gerar modelos de roedores transgénicos. Camundongos transgênicos APP / PS1 coexpressï¿½ simultaneamente &quot;sueco&quot; mutante APP humana (swe APP) e Δ exon 9 mutante presenilina 1 humano (PS1ΔE9) presente com amiloidose cerebral acelerada e neuroinflamação 15,16. Além disso, geramos ratos bi-transgénicos co-injectado com APP swe e construções PS1ΔE9 (linha TgF344-AD, em um fundo Fischer 344). Ao contrário de modelos de ratos transgênicos de amiloidose cerebral, ratos TgF344-AD desenvolver amilóide cerebral que antecede tauopathy, perda apoptótica de neurônios, e comprometimento comportamental 17. Neste relatório, nós descrevemos um protocolo para immunostaining microglia, phagolysosomes e depósitos de Ap em seções do cérebro de ratinhos APP / PS1 e ratos TgF344-AD, e aquisição de imagens confocal grandes z-dimensional. Nós detalhe na geração e análise dos verdadeiros reconstruções 3D a partir de conjuntos de dados confocal permitindo a quantificação da captação de Ap em phagolysosomes microgliais silico. Mais amplamente, a metodologia que nós detalhes aqui pode ser usado para quantificar virtualmente qualquer forma de fagocitose in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:384px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:152px;">Abbott</td>
			<td style="width:127px;">NDC 0044-5260-05</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Dissecting scissors Blunt tip</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">82027-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Tweezers</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>94024-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">23G needle</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>BD305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">peristaltic pump FH10</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td>72-310-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:152px;">Bioland Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PBS01-02</td>
			<td>Working concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Kent Scientific</td>
			<td>RBMS-200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Kent Scientific</td>
			<td>RBMS-305C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:152px;">EMS</td>
			<td style="width:127px;">15714-S</td>
			<td>Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Ethanol</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Various concentrations, see protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>25608-774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Embedding and Infiltration Paraffin</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>15147-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Microtome Leica RM2125</td>
			<td style="width:152px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Disposable Microtome Blades&#160;</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Water bath Leica HI 1210</td>
			<td style="width:152px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Micro slide Superfrost plus</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Xylene</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">534056-4X4L</td>
			<td style="width:249px;">Caution: Toxic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Target Retrieval Solution 10X</td>
			<td style="width:152px;">DAKO</td>
			<td style="width:127px;">S1699</td>
			<td>Working concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KimWipes</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Hydrophobic PAP pen</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">95025-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:152px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:127px;">017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Coverslips</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">48393081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Glass Slide Rack</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">100492-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Iba1 antibody (polyclonal, rabbit)</td>
			<td style="width:152px;">Wako</td>
			<td style="width:127px;">019-19741&#160;</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Iba1 antibody (polyclonal, goat)</td>
			<td style="width:152px;">LifeSpan Bioscience</td>
			<td style="width:127px;">LS-B2645</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse)</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td style="width:127px;">ab955</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat)</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td style="width:127px;">ab53444</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat)</td>
			<td style="width:152px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:127px;">14-1071</td>
			<td>Working concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse)</td>
			<td style="width:152px;">Covance</td>
			<td style="width:127px;">SIG-39220</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse)</td>
			<td style="width:152px;">Covance</td>
			<td style="width:127px;">SIG-39320</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">OC antibody (polyclonal, rabbit)</td>
			<td colspan="2">Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 488&#160; mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">A-11001</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 488&#160; rat secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 594 goat secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11080</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21443</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:152px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">A1 Confocal microscope</td>
			<td style="width:152px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">NIS Elements Advanced Research software</td>
			<td style="width:152px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Imaris:Bitplane software version 7.6</td>
			<td style="width:152px;">Bitplane</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>&#34;coloc&#34; and &#34;supass&#34; modules are used.&#160;Alternatively, the open-source freeware&#160;ImageJ can be used for colocalization&#160;analysis of confocal z-stacks datasets.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative 3d in silico modeling (q3dism) of cerebral amyloid-beta phagocytosis in rodent models of alzheimer's disease

Neuroinflamação é agora reconhecido como um importante fator etiológico em doenças neurodegenerativas. fagócitos mononucleares são células imunitárias inatas responsáveis ​​pela fagocitose e remoção de escombros e detritos. Estas células incluem macrófagos residentes do SNC conhecidos como microglia e fagócitos mononucleares infiltrantes a partir da periferia. A microscopia de luz tem sido geralmente usado para visualizar a fagocitose em roedores ou espécimes do cérebro humano. No entanto, os métodos qualitativos não forneceram provas definitivas da fagocitose in vivo. Aqui, nós descrevemos 3D quantitativa na modelagem de silício (q3DISM), um método robusto para a verdadeira permitindo a quantificação de 3D-amilóide β (Ap) a fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD). O método envolve a fluorescência visualizando Ap encapsulado dentro phagolysosomes em seções roedor cerebrais. Grandes conjuntos de dados confocal z-dimensional são então reconstrução 3D para quantificação de A &amp;# 946; colocalized espacialmente no interior do fagolisossoma. Nós de demonstrar a aplicação bem sucedida de q3DISM de ratinho e de rato cérebros, mas esta metodologia pode ser estendida para virtualmente qualquer modo fagocitária em qualquer tecido.

Utilizando a metodologia multi-fase para q3DISM detalhado acima, que são capazes de quantificar a absorção de Ap em fagolisossomas monócitos nos cérebros de murganhos APP / PS1 (Figura 1) e ratos TgF344-AD (Figura 2). Portanto, a metodologia q3DISM permitiu a análise de fagócitos mononucleares em ratinhos e ratos modelos da doença de Alzheimer. Curiosamente, o volume ocupado pelo CD68 + fagolisossomas é aumentado significativamente em fagócitos mononucleares Iba1 + associados com comparação com distante de placas, tanto em ratos TgF344-AD (Figura 2B, C) de APP / PS1 ratinhos (Figura 1B, C) e. Estes dados mostram que os fagócitos mononucleares próximos placas estão prontas para a fagocitose em comparação com células localizadas longe da placa. A fim de ilustrar a gama de dados de coloração diferentes confórmeros Aâ, utilizou-se vários anticorpos de rato e de tecidos de rato (detalhado na Table 1 e discussão) - não estamos a tentar comparar diretamente ratos e de camundongos modelos de AD com relação ao Ap fagocitose. No entanto, foi notável que a placa associada fagócitos mononucleares havia aumento da captação de Ap em murganhos APP / PS1 em comparação com células distantes de placas (Figura 1D). Ratos TgF344-AD tinha absorção muito modesto de fibrilas de Ap total, e nenhuma alteração em Ap fibrila fagocitose como uma função da distância a partir de placas (Figura 2D). <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54868/54868table1.jpg" /> Tabela 1: A imunocoloração fagócitos mononucleares, fagolisossomos e amilóide-β no tecido cerebral de ratos APP / PS1 ou ratos TgF344-AD. Rato ou o ratinho cocktails de anticorpos específicos são listados com seus respectivos acolhimento entre parênteses. As cores indicam o fluoróforo utilizado para o anticorpo secundário. Vermelho: Alexa Fluor 594; verde: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54868/54868fig1.jpg" /> Figura 1: Visualização e quantificação de amilóide-β fagocitose em Brains APP / PS1 mouse. (A) imagens confocal de seções do cérebro de um / camundongo PS1 APP mostrando Iba1 células + (vermelho), LAMP1 + phagolysosomes (verde) e 4G8 + depósitos amilóides (magenta). Inserir uma destaca um fagócito mononuclear distante da placa, enquanto a margem interna 2 mostra um fagócito mononuclear associado com a placa. A barra de escala indica 50 um. Painéis menores à direita são alargamentos da Iba1, LAMP1 e 4G8 sinais dentro inserções 1 e reconstrução 2. (B) 3D de Iba1, LAMP1 e sinais 4G8 para inserções 1 e 2. A barra de escala indica 3 mm. (C) Quantificação do Iba1 + volume de fagócito mononuclear ocupada por LAMP1 + phagolysosomes. ( <strong&gt; D) Quantificação do LAMP1 + fagolisossï¿½ico de volume intracelular ocupada por 4G8 + Ap. Os valores são baseados na proporção de sinal (voxels) acima do limiar que são colocalized. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6 células) para os fagócitos mononucleares distantes de placas (1), ou associada com placas (2). ** P &lt;0,01 pelo teste t de estudante. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54868/54868fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54868/54868fig2.jpg" /> Figura 2: Visualização e quantificação de amilóide-β fagocitose em cérebros de ratos TgF344-AD. (A) imagens confocal de seções do cérebro de um rato TgF344-AD mostrando células Iba1 + (vermelho), CD68 + phagolysosomes (verde), e OC + fibrilar solúvel A &amp; #<html> 946; (magenta). Inserir uma destaca um fagócito mononuclear distante da placa, enquanto a margem interna 2 mostra um fagócito mononuclear associado com a placa. A barra de escala indica 50 um. Painéis menores à direita são alargamentos da Iba1, CD68 e sinais OC dentro inserções 1 e 2. (B) reconstrução 3D de Iba1, CD68 e sinais de OC para inserções 1 e 2. A barra de escala indica 3 mm. (C) Quantificação do Iba1 + volume de fagócito mononuclear ocupada por phagolysosomes CD68 +. (D) A determinação quantitativa de CD68 + fagolisossï¿½ico de volume intracelular ocupada por OC + Ap. Os valores são baseados na proporção de sinal (voxels) acima do limiar que são colocalized. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6 células) para os fagócitos mononucleares distantes de placas (1), ou associada com placas (2). ** P &lt;0,01 pelo teste t de estudante.rge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Desenvolvemos uma metodologia para 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) de amilóide cerebral-β (Aâ) fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método pode ser generalizado para a quantificação de praticamente qualquer evento fagocítica in vivo.

3D quantitativa<em&gt; In Silico</em&gt; Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

quantitative-3d-silico-modeling-q3dism-cerebral-amyloid-beta

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

7.9K visualizações.  University of Southern California (USC).  Desenvolvemos uma metodologia para 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) de amilóide cerebral-β (Aâ) fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método pode ser generalizado para a quantificação de praticamente qualquer evento fagocítica in vivo. 

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Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer's Disease

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic mild cognitive impairment (aMCI) and Alzheimer's disease (AD). Whereas behavioral data inform us about the patients' performance, ERPs allow us to record discrete changes in brain activity. Further, ERPs can give us insight into the onset, duration, and interaction of independent cognitive processes associated with memory retrieval. In patient populations, these types of studies are used to examine which aspects of memory are impaired and which remain relatively intact compared to a control population. The methodology for collecting ERP data from a vulnerable patient population while these participants perform a recognition memory task is reviewed. This protocol includes participant preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis. In addition to basic setup and acquisition, we will also demonstrate localization techniques to obtain greater spatial resolution and source localization using high-density (128 channel) electrode arrays.

The methodology for collecting high-density event-related potential data while patients with Alzheimer's disease perform a recognition memory task is reviewed. This protocol will include subject preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis.

Examinando as características de memória episódica com potenciais relacionados a eventos em Pacientes com Doença de Alzheimer

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic ...

Medicina

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Uso de ultra-alta MRI campo em pequeno roedor modelos de doença renal policística para<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotipagem and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle proliferation and obliteration of pulmonary arterioles. This in turn results in right ventricular (RV) failure, with significant morbidity and mortality. Rodent models of PAH, in the mouse and the rat, are important for understanding the pathophysiology underlying this rare disease. Notably, different models of PAH may be associated with different degrees of pulmonary hypertension, RV hypertrophy and RV failure. Therefore, a complete hemodynamic characterization of mice and rats with PAH is critical in determining the effects of drugs or genetic modifications on the disease. 
Here we demonstrate standard procedures for assessment of right ventricular function and hemodynamics in both rat and mouse PAH models. Echocardiography is useful in determining RV function in rats, although obtaining standard views of the right ventricle is challenging in the awake mouse. Access for right heart catheterization is obtained by the internal jugular vein in closed-chest mice and rats. Pressures can be measured using polyethylene tubing with a fluid pressure transducer or a miniature micromanometer pressure catheter. Pressure-volume loop analysis can be performed in the open chest. After obtaining hemodynamics, the rodent is euthanized. The heart can be dissected to separate the RV free wall from the left ventricle (LV) and septum, allowing an assessment of RV hypertrophy using the Fulton index (RV/(LV+S)). Then samples can be harvested from the heart, lungs and other tissues as needed.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease of pulmonary arterioles that leads to their obliteration and the development of right ventricular failure. Rodent models of PAH are critical in understanding the pathophysiology of PAH. Here we demonstrate hemodynamic characterization, with right heart catheterization and echocardiography, in the mouse and rat.

Hemodinâmica Caracterização de roedores modelos de Hipertensão Arterial Pulmonar

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It is well established that synapse loss and ensuing neurodegeneration are the best predictors for memory impairments in AD. Latest studies have emphasized the neurotoxic role of soluble amyloid-beta oligomers (A&#946;o) that begin to accumulate in the human brain approximately 10 to 15 yr before the clinical symptoms become apparent. Many reports indicate that soluble A&#946;o correlate with memory deficits in AD models and humans. The A&#946;o-induced neurodegeneration observed in neuronal and brain slice cultures has been more challenging to reproduce in many animal models. The model of repeated A&#946;o infusions shown here overcome this issue and allow addressing two key domains for developing new disease modifying therapies: identify biological markers to diagnose early AD, and determine the molecular mechanisms underpinning A&#946;o-induced memory deficits at the onset of AD. Since soluble A&#946;o aggregate relatively fast into insoluble A&#946; fibrils that correlate poorly with the clinical state of patients, soluble A&#946;o are prepared freshly and injected once per day during six days to produce marked cell death in the hippocampus. We used cannula specially design for simultaneous infusions of A&#946;o and continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps. This innovative in vivo method can now be used in preclinical studies to validate the efficiency of new AD therapies that might prevent the deposition and neurotoxicity of A&#946;o in pre-dementia patients.

To study the effects of A&#946;o in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble A&#946;o coupled with continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of A&#946;o.

Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated measurements over weeks or months of accessory respiratory muscle activity while simultaneously measuring ventilation in a non-anesthetized, freely behaving mouse. The technique includes the surgical implantation of a radio transmitter and the insertion of electrode leads into the scalene and trapezius muscles to measure the electromyogram activity of these inspiratory muscles. Ventilation is measured by whole-body plethysmography, and animal movement is assessed by video and is synchronized with electromyogram activity. Measurements of muscle activity and ventilation in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are presented to show how this tool can be used to investigate how respiratory muscle activity changes over time and to assess the impact of muscle activity on ventilation. The described methods can easily be adapted to measure the activity of other muscles or to assess accessory respiratory muscle activity in additional mouse models of disease or injury.

This paper introduces a method for repeated measurements of ventilation and respiratory muscle activity in a freely behaving amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mouse model throughout disease progression with whole-body plethysmography and electromyography via an implanted telemetry device.

Medida repetida de actividade muscular respiratória e Ventilação no rato modelos de doença neuromuscular

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Application of Granger Causality Analysis of the Directed Functional Connection in Alzheimer's Disease and Mild Cognitive Impairment

Impaired functional connectivity in the Default Mode Network (DMN) may be involved in the progression of Alzheimer&#39;s Disease (AD). The Posterior Cingulate Cortex (PCC) is a potential imaging marker for monitoring the progression of AD. Previous studies did not focus on the functional connectivity between the PCC and nodes in regions outside the DMN, but our study is an effort to explore these overlooked functional connections. For collecting data, we used functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) and Granger Causality Analysis (GCA). fMRI provides a non-invasive method for studying the dynamic interactions between the different brain regions. GCA is a statistical hypothesis test for determining whether one-time series is useful in forecasting another. In simple terms, it is judged by comparing the &#34;Known all the information on the last moment, the distribution of the probability of X at this time&#34; and the &#34;Known all the information on the last moment except Y, the distribution of the probability of X at this time&#34;, to determine whether there is a causal relationship between Y and X. This definition is based on the complete information source and stationary chronological sequence. The main step of this analysis is to use X and Y to establish the regression equation and draw a causal relationship by a hypothetical test. Since GCA can measure causal effects, we used it to investigate the anisotropy of the functional connectivity and explore the hub function of the PCC. Here, we screened 116 participants for MRI scanning, and after preprocessing the data obtained from neuroimaging, we used GCA to derive the causal relationship of each node. Finally, we concluded that the directed connection is significantly different between the Mild Cognitive Impairment (MCI) and AD groups, both from the PCC to the whole brain and from the whole brain to the PCC.

Based on resting-state functional magnetic resonance imaging with Granger causality analysis, we investigated the alterations in the directed functional connectivity between the posterior cingulate cortex and whole brain in patients with Alzheimer&#39;s Disease (AD), patients with Mild Cognitive Impairment (MCI), and healthy controls.

Aplicação da análise de causalidade de Granger da Conexão funcional direcionado na doença de Alzheimer e transtorno cognitivo leve

Impaired functional connectivity in the Default Mode Network (DMN) may be involved in the progression of Alzheimer&#39;s Disease (AD). The Posterior ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

3D quantitativa

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