This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.

NOTA: EMSAs utilizzando sonde di DNA fluorescente o altre forme di DNA marcato condividono gli stessi protocolli per la preparazione di proteine o estratto cellulare, la proteina-DNA reazione di legame, e la preparazione del gel PAGE e in esecuzione (Figura 1A). Le principali differenze sono procedure DNA di etichettatura, fasi di lavorazione gel post-visione e metodi di rilevamento. 1. Gel di Preparazione <ol><li> Preparare 5% gel di poliacrilammide nativo contenente 0,5x TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA) e il 2,5% glicerolo, utilizzando un mini sistema di gel di proteine ​​(8,3 cm di larghezza x 7.3 cm di spessore di lunghezza x 0,75 mm). <ol><li> Per preparare 30 mL di soluzione di gel per 4 gel, mescolare 5 ml di 30% acrilamide / Bis (37,5: 1), 3 mL di 5x TBE (0,45 M Tris-borato, 10 mM EDTA), 1,5 mL di 50% glicerolo, 300 ml di 10% persolfato di ammonio, 15 ml di TEMED, e 20,2 ml di DDH 2 O accuratamente. NOTA: L&#39;acrilamide è nocivo e tossico, gestire gli opportuni dispositivi di protezione individuale. </li&gt; </ol></li><li> Cast immediatamente la soluzione di gel. Dopo la polimerizzazione, avvolgere i gel nella pellicola trasparente pre-bagnato con 0,5x TBE e conservarli a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparazione di sonde a raggi infrarossi colorante fluorescente etichettati NOTA: Mantenere gli oligonucleotidi coloranti fluorescenti etichettati infrarosso lontano dalla luce il più possibile durante la preparazione, lo stoccaggio, ed esperimenti. <ol><li> Creare e ordinare oligonucleotidi. <ol><li> Disegno lungo oligonucleotide per ~ 51-mers. NOTA: La lunga sequenza di oligonucleotidi della sonda LIM-4 / SOX-2 è TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. oligonucleotidi lunghi non richiedono PAGE o purificazione HPLC. </li><li> Progettare oligonucleotidi brevi complementari per ~ 14-mers con fluorescenza a raggi infrarossi modifica colorante al &#39;capolinea 5 (5&#39;Dye) e una temperatura di fusione superiore a 37 ° C. NOTA: La breve sequenza di oligonucleotide della LIM-4 / SOX-2 sonda è 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG. La scala minima sintesi di oligonucleotidi brevi 5&#39;Dye-etichettati è 100 nm. Pertanto, gli oligonucleotidi richiedono purificazione HPLC. </li></ol></li><li> oligonucleotidi Risospendere in 1x tampone Tris-EDTA (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) alla concentrazione finale di 100 mM. </li><li> Ricottura Short (5&#39;Dye) e oligonucleotidi lunghi. <ol><li> Mescolare 0,6 ml di 5&#39;Dye-Short oligo (100 mM), 1,2 ml di oligo Long (100 mM) e 28,2 ml di cloruro di sodio-Tris-EDTA (STE: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Posizionare il tubo in acqua bollente per 5 min. Spegnere la fonte di calore e lasciare che l&#39;acqua con le oligos ricotto raffreddare O / N al buio. </li></ol></li><li> Compilare sbalzi di ricotto 5&#39;Dye corta / oligonucleotidi lunghi con polimerasi Klenow DNA 5 &#39;effettuare doppie sonde a DNA bloccati. <ol><li> Preparare la reazione mescolando30 ml di ricotto brevi lunghi oligo / con tag 5&#39;Dye, 8,5 ml di 10x Klenow tampone, 1,7 ml di 10 mM dNTP, 1,7 ml di Klenow (3 &#39;-&gt; 5&#39; eso) (5 U / mL), e 43,1 ml di DDH 2 O in un tubo di 0,2 ml PCR. </li><li> Incubare 60 minuti a 37 ° C in una macchina PCR. </li><li> Aggiungere 3,4 ml di 0,5 M EDTA per bloccare la reazione e inattivare a caldo a 75 ° C per 20 minuti in una macchina PCR. </li></ol></li><li> Diluire sonde compilati (0,7 micron) a STE per concentrazione finale di 0,1 micron. </li><li> oligo conservare a -20 ° C al buio fino al momento dell&#39;uso. Oligonucleotidi possono essere conservati fino a un anno in questa condizione. NOTA: Per generare sonde di DNA con siti di legame mutanti, le versioni mutanti di lunghe oligonucleotidi sono ricotto con oligonucleotidi brevi 5&#39;Dye-etichettati, seguita da fill-in di 5 &#39;strapiombi con Klenow. È stato dimostrato che la sonda con un filamento marcato con un fluorescente infrarossodye ha solo il 30% dell&#39;intensità della sonda con entrambi i filamenti etichettati con il colorante. Se l&#39;intensità del segnale deve essere rafforzata, lunghe oligos di entrambi i filamenti sono etichettati con coloranti fluorescenti infrarossi al 5 &#39;Termini e ricotta per rendere fluorescenti infrarossi sonde dye-etichettati. </li></ol> 3. Preparazione di adenoide / freddo Sonde (concorrenti) Nota: oligonucleotidi lunghi di sequenze complementari (lunghe e LongR) sono stati ricotto per rendere le sonde senza etichetta per l&#39;analisi della concorrenza con fluorescenti infrarossi sonde dye-etichettati. <ol><li> Mescolare 20 ml di 100 mM lunghi, 20 ml di 100 mM LongR oligonucleotidi, e 60 ml di STE in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Posizionare il tubo in acqua bollente per 5 minuti, spegnere la fonte di calore e lasciare che l&#39;acqua con le oligos ricotto raffreddare durante la notte. </li></ol> 4. reazione di legame e di elettroforesi <ol><li> Preparare 1 ml di tampone di legame 5x mescolando 50 microlitri60; di 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 10 ml di 5 M NaCl; 200 ml di 1 M KCl, 5 ml di 1 M MgCl 2, 10 ml di 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 ml di 1 M DTT; 25 ml di 10 mg / ml BSA, e 695 ml di DDH 2 O. NOTA: Il 5x Binding Buffer può essere aliquotati e conservati a -20 ° C. Un altro punto da considerare è che i diversi fattori di trascrizione avranno diverse modifiche al tampone di legame. </li><li> A destra prima di impostare le reazioni di legame, pre-eseguire il gel di poliacrilammide nativo 5% a 0,5x TBE + 2,5% glicerolo per rimuovere tutte le tracce di ammonio persolfato a 80 V per il 30 - 60 min, o fino a quando la corrente non è più varia nel tempo. </li><li> Impostare la reazione di legame in volume finale di 20 microlitri. <ol><li> Mescolare 4 ml di tampone di legame 5x 80 - 200 ng purificata proteina A (in 50% glicerolo, cioè, SOX-2), 1 ml di 0,1 pM sonda Dye-coniugato (conc finaleentration: 5 Nm), e DDH 2 O. </li><li> Opzionale: Quando sono richieste concorrenti della sonda fredda, aggiungere diverse concentrazioni (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) di sonde fredde. </li><li> Opzionale: Quando (cioè, SOX-2 e LIM-4) viene testato l&#39;interazione tra le proteine A e B, Aggiungere 80 - 200 ng purificata proteina B (in 50% glicerolo, cioè, LIM-4). </li><li> Opzionale: Quando si utilizza la preparazione estratto nucleare e legame specifico di proteina A deve essere convalidata, aggiungere anticorpo specifico per la proteina A (cioè, anti-6xHis, anti-FLAG, ecc). </li><li> Incubare a R / T in buio per 15 min. </li></ol></li><li> Caricare tutta la reazione di legame sul gel ed eseguire il gel a 10 V / cm a distanza desiderata. </li></ol> 5. Imaging NOTA: Il gel è stato scansionato direttamente nelle lastre di vetro con un sistema di imaging a raggi infrarossi avanzata. Pertanto, il gel può essere risolto ulteriormente e scansione ripetutamente (Figure 1C e <strong&gt; 2). Un sistema di imaging a fluorescenza vicino infrarosso principalmente per Western blot è stato testato anche per la scansione del gel, ma solo il sistema di imaging ad infrarossi è in grado di eseguire la scansione del gel con buona risoluzione. La metodologia descritta è specifico per un particolare software di imaging a raggi infrarossi, anche se altri pacchetti software possono essere utilizzati. <ol><li> Pulire il letto dello scanner con DDH 2 O e asciugare bene prima della scansione. Asciugare le lastre di vetro del gel e posizionare le piastre contenenti il ​​gel sul piano dello scanner. </li><li> Aprire il software di imaging a raggi infrarossi e passare alla scheda &#39;Acquire&#39;. Quando la piastra sottile (1 mm) è collocato sul piano dello scanner, utilizzare le impostazioni di canale: 700, Intensità: Auto, Risoluzione: 169 micron, Qualità: media, e Focus compensati: 1.5 mm. Quando la piastra spessa (3 mm) è collocato sul piano dello scanner, utilizzare le impostazioni di canale: 700, Intensità: Auto, Risoluzione: 84 micron, Qualità: media, e Focus offset: 3,5 mm. compensati fuoco dipende dallaspessore della lastra di vetro. </li><li> Selezionare l&#39;area che il gel occupa sullo scanner. Fare clic su &#39;Start&#39; per avviare la scansione. </li><li> Ripetere elettroforesi e scansione in aggiunta, se necessario. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

fEMSAs sono uno strumento efficace per studiare le interazioni proteina-DNA, e sono una alternativa alla marcatura radioattiva del DNA. Coloranti fluorescenti come coloranti infrarossi sono disponibili in commercio, e forniscono un metodo più sicuro e più ecologico rispetto all&#39;etichettatura DNA radioattivo. EMSAs utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato non richiedono fasi di lavorazione gel postrun, e quindi risparmiare tempo e costi rispetto ad altre tecniche di marcatura del DNA. Il tempo per rilevare bande utilizzando EMSAs radioattivi possono variare da 30 minuti a diversi giorni, a seconda della radioattività e concentrazione delle sonde di DNA testati 1. Al contrario, la scansione di gel FEMSA assume in media 25 minuti, riducendo significativamente il tempo di protocollo. fEMSAs anche fornire un vantaggio significativo rispetto marcatura radioattiva, come il gel non deve essere rimosso dalle piastre di vetro per l&#39;analisi. Questo permette il gel per una nuova scansione se il tempo di funzionamento iniziale non è sufficienteper risolvere i complessi proteina-DNA. L&#39;opzione di estendere l&#39;elettroforesi non è disponibile utilizzando isotopi radioattivi o biotina / streptavidina. Ancora più importante, la manipolazione di materiale radioattivo rappresenta un rischio per la sicurezza del personale di laboratorio, mentre l&#39;etichettatura fluorescente di sonde a DNA non è pericoloso, e può essere smaltito facilmente. L&#39;uso di streptavidina richiede anche un periodo più lungo fino al rilevamento (circa 3 ore) 12. Il protocollo ed i risultati qui presentati dimostrano che FEMSA è uno strumento efficace e conveniente per la ricerca biomedica. Abbiamo usato con successo FEMSA per fornire una visione meccanicistica in l&#39;effetto di SOX-2 G73E mutazione specifica attività di legame al DNA che porta alla olfattiva neurone identità trasformazione 5,10. Nel caso in cui nessun segnale debole o viene rilevato quando si analizza il gel, la concentrazione della sonda di DNA può essere aumentata. Le sonde di DNA utilizzati nelle nostre prove sono stati etichettati con un colorante fluorescente a infrarossi su unsingolo filamento. Mentre questo metodo ha lavorato con successo per sonde abbiamo testato, è stato riportato che marcatura fluorescente di un singolo filamento ha un&#39;intensità del 30% di sonde che sono stati etichettati su entrambi i filamenti. Se l&#39;intensità risulta essere troppo bassa, si raccomanda di etichettare entrambi i filamenti della sonda di DNA con un colorante fluorescente infrarossi. Se le bande spostate non vengono rispettate, il complesso proteina-DNA può essere instabile. Il glicerolo è fondamentale in questo protocollo per stabilizzare le interazioni proteina-DNA. Il glicerolo è incluso nel gel colato, la reazione di legame, e il tampone di corsa. Un altro punto di considerazione è la scelta di colorante durante l&#39;inseguimento di progressione dei campioni attraverso il gel durante la corsa. Arancio G è ideale per questo scopo, come altri tipi di coloranti carico come blu di bromofenolo possono interferire con la scansione del gel. Precorrendo il gel è anche importante garantire persolfato di ammonio viene rimosso dal gel prima caricato i campioni. Inoltre, l&#39;uso di poli dI-dC può interferire con binding della proteina di interesse con la sonda di DNA in fEMSAs. La purezza della proteina di interesse e l&#39;integrità del DNA bersaglio sono anche importanti per la loro interazione. È inoltre importante garantire impostazioni di scansione corrette quando si utilizza il software di imaging. L&#39;attenzione appropriata offset e parametri di intensità sono selezionati in base allo spessore delle lastre di gel e l&#39;intensità di sonde di DNA. Precedenti protocolli sono stati descritti per eseguire EMSAs fluorescenti 13,14. Tuttavia, questi protocolli hanno richiesto l&#39;uso di dl-dC, e / o pompe per la circolazione dell&#39;acqua di mantenere una determinata temperatura. Il protocollo qui descritto fornisce un metodo molto più dettagliata, e non richiede l&#39;utilizzo di eventuali pompe. Le future applicazioni di questo protocollo sono saggi di concorrenza di monitoraggio in tempo reale. sonde fluorescente ci forniscono questa intuizione aggiuntiva, come gel possono essere acquisiti più volte a diversi poin tempo elettroforesits. Inoltre, sonde di DNA di interesse e concorrente sonde possono essere etichettati con diversi coloranti fluorescenti infrarossi, consentendo di immagini a due colori. Come per tutte le tecniche, ci sono limitazioni all&#39;utilizzo di EMSAs fluorescenti. Sono necessari più alte concentrazioni di proteine ​​rispetto ai EMSAs tradizionali a causa di sensibilità relativamente più bassi. Un&#39;altra limitazione è necessità di un sistema di imaging specifico con alta risoluzione per rilevare il colorante fluorescente infrarosso. Anche se il costo iniziale è elevato per l&#39;acquisto dello scanner, l&#39;uso a lungo termine di infrarossi etichettatura colorante fluorescente è economicamente vantaggioso. Nonostante queste limitazioni, EMSAs fluorescenti forniscono un metodo importante per affrontare importanti questioni biologiche.

EMSAs sono utilizzati per analizzare interazioni tra DNA e proteine utilizzando nativo SDS-PAGE (PAGINA) per risolvere una miscela di una proteina di interesse e una sonda di DNA marcata contenente potenziali siti bersaglio della proteina 1. Una sonda DNA legato con proteine ​​migrerà più lento rispetto a una sonda di DNA libero, ed è quindi ritardato nella sua migrazione attraverso una matrice di poliacrilammide. Radiomarcatura di DNA da 32 P è stato il metodo predominante per il rilevamento in EMSAs. Anche se l&#39;applicazione di radiomarcatura in ricerca biochimica è stato vantaggioso, i metodi di etichettatura DNA alternativa con sensibilità paragonabile vengono impiegati a causa dei rischi per la salute e la sicurezza connessi con la gestione di radioattività. Questi metodi alternativi includono coniugazione del DNA con biotina 2 o digossigenina (DIG) 3 (entrambi i quali sono poi rilevati dai sistemi chemiluminescenza), SYBR colorazione verde del gel PAGE 4,o il rilevamento diretto di coniugati colorante DNA fluorescente attraverso la scansione del 5,6 gel. I gel risolti di EMSAs utilizzando sonde di DNA marcati radioattivamente richiedono l&#39;elaborazione postrun attraverso film autoradiografia o un sistema phosphorimager di rilevare i segnali radioattivi 1,7. Gel di EMSAs utilizzando biotin- 2 o DIG-coniugati sonde 3 di DNA devono essere elaborati e trasferiti su una membrana adatta e poi rilevati da chemiluminescenza 6. SYBR colorazione verde del gel richiede postrun colorazione del gel e uno scanner a fluorescenza 4. Dal momento che sono necessari fasi di lavorazione gel postrun per EMSAs che utilizzano queste tecniche di etichettatura di DNA, il gel può essere risolto solo una volta analizzati. Al contrario, sonde di DNA marcate con fluorofori possono essere rilevati direttamente nel gel all&#39;interno delle lastre di vetro da uno scanner. Pertanto, le interazioni proteina-DNA possono essere monitorati e analizzati più volte in diversi momenti durante la corsa, cheriduce significativamente i tempi ei costi. I coniugati colorante DNA fluorescente che sono stati utilizzati per EMSAs includono Cy3 6,8, 6,8 Cy5, fluoresceina 9, e coloranti fluorescenti infrarossi 4-6. Regolazione trascrizionale richiede interazioni proteina-DNA di fattori di trascrizione e dei loro geni bersaglio. Il coordinamento di queste interazioni genera diversi tipi di cellule da un progenitore comune durante lo sviluppo degli animali. Uno schermo genetica avanti imparziale identificato una mutazione missense, G73E, nel altamente conservato dominio HMG di legame al DNA del Caenorhabditis elegans fattore di trascrizione SOX-2. I risultati mutazione in una trasformazione dell&#39;identità cellulare dei neuroni olfattivi AWB in AWC neuroni olfattivi a livello molecolare, morfologico e funzionale 5,10. SOX-2 regola in maniera differenziale la differenziazione terminale dei neuroni AWB e AWC interagendo con fattori socio di trascrizione dipendenti dal contesto e rispettivoSiti bersaglio DNA 5,10. SOX-2 partner con LIM-4 (LHX) in terminale AWB differenziamento neuronale, mentre SOX-2 partner con CEH-36 (OTX / OTD) in terminale AWC differenziamento neuronale. Saggi di luciferasi mostrano che SOX-2 e mutante SOX-2 proteine G73E avere interazioni cooperative con cofattori trascrizionali LIM-4 e CEH-36 per attivare un promotore espresso nei neuroni AWB e AWC. Tuttavia, SOX-2 e mutante SOX-2 G73E visualizzate le proprietà di attivazione differenziale del promotore. Per studiare le basi molecolari del DNA differenziali attività vincolanti SOX-2 e SOX-2 G73E, fEMSAs sono stati eseguiti con queste proteine e le loro potenziali siti bersaglio. In primo luogo, un approccio bioinformatica è stato preso per identificare il DNA biologicamente rilevante sequenze di legame all&#39;interno della regione promotrice 1 kb usati nel saggio luciferasi. Dal momento che più potenziali SOX-2 siti di legame erano presenti in tutto il promotore, ci siamo concentratiil predetto SOX-2 siti di legame adiacenti putativo CEH-36 o LIM-4 siti di legame e evolutivamente conservati tra le varie specie di nematodi. Queste sequenze sono stati cancellati o mutati, e successivamente testati in vivo per la loro attività di esprimere GFP transgeni giornalista nei neuroni AWB o AWC. Grazie a questo approccio, abbiamo identificato potenziali LIM-4 / SOX-2 e CEH-36-2 SOX siti bersaglio adiacenti / che sono specificamente richiesti per l&#39;espressione di GFP in AWB e AWC neuroni, rispettivamente 5. Abbiamo studiato le potenziali differenze nel legame al DNA di SOX-2 e SOX-2 G73E utilizzando FEMSA con le identificati LIM-4 / SOX-2 e CEH-36 / SOX-2 siti bersaglio adiacenti. La nostra analisi ha mostrato che EMSA SOX-2 G73E non vincola la sonda di DNA che contiene le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti (necessari per l&#39;espressione genica in AWB) nel modo più efficiente WT SOX-2 ha fatto. Tuttavia, SOX-2 e SOX-2 G73E avevano alcuna differenza nel legame della sonda di DNA che contiene il CEH-36 / SOX-2 unsito di destinazione djacent (necessaria per l&#39;espressione genica in AWC) 5,10. Il nostro FEMSA analizza fornire la comprensione meccanicistica della natura del G73E mutazione SOX-2 in interessano specifica attività di legame al DNA per l&#39;identità delle cellule trasformazione fenotipo AWB-to-AWC. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato di FEMSA utilizzando 6xHis-SOX-2 purificati o 6xHis-SOX-2 G73E insieme a fluorescenza a raggi infrarossi sonde di DNA dye-marcato contenenti le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti come un caso di studio per affrontare un&#39;importante questione biologica.

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Acrylamide is harmful and toxic.</td></tr><tr><td>6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 antibody&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5&#039;IRDye700-labeled DNA Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom DNA oligo</td><td>These are referred to as &quot;5&#039;Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos&quot; in the manuscript. The company will custom synthesize 5&#039; IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100&amp;nbsp;&amp;mu;M scale synthesis and HPLC purification.</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3&#039;--&gt;5&#039; exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;nbsp;Vertical Electrophoresis Cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&amp;nbsp;</td><td>This is referred to as a &#039;mini protein gel system&#039; in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Infrared Imaging System</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey CLx Infrared Imagng System</td><td>This is referred to as an &#039;advanced infrared imaging system&#039; in the manuscript.</td></tr><tr><td>Odyssey Fc Imaging System&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td><td>This is referred as a &#039;near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots&#039; in the manuscript.</td></tr><tr><td>Image Studio software (version 4.0)</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio software&amp;nbsp;</td><td>This is referred to as a &#039;particular imaging software&#039; in the manuscript.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Orange loading dye</td><td></td><td></td><td>0.25% Orange G; 30% Glycerol</td></tr><tr><td>0.5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Binding Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 &amp;#956;g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides

Elettroforetiche saggi Mobility Shift (EMSA) sono uno strumento fondamentale per caratterizzare le interazioni tra proteine ​​e le loro sequenze di DNA bersaglio. La radioattività è stato il metodo predominante di etichettatura DNA in EMSAs. Tuttavia, recenti progressi nella coloranti fluorescenti e metodi di scansione hanno spinto l&#39;uso di marcatura fluorescente di DNA come alternativa alla radioattività per i vantaggi di maneggevolezza, risparmiando tempo, riducendo i costi e migliorare la sicurezza. Abbiamo recentemente utilizzato EMSA fluorescente (Femsa) per affrontare con successo un importante questione biologica. La nostra analisi FEMSA fornisce una visione meccanicistica in l&#39;effetto di una mutazione missenso, G73E, nel HMG fattore di trascrizione altamente conservata SOX-2 on olfattiva diversificazione tipo neurone. Abbiamo scoperto che mutante SOX-2 proteina G73E altera il DNA specifica attività di legame, causando in tal modo olfattiva trasformazione neurone identità. Qui, vi presentiamo un ottimizzato e conveniente step-by-step di protocolloper Femsa utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato contenenti le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti e purificati SOX-2 proteine (WT e mutanti SOX-2 proteine G73E) come un esempio biologico.

Arancio G loading dye (6x: 0,12 g arancione G in 100 ml 30% glicerolo) possono essere aggiunti alla reazione di legame prima del caricamento per visualizzare il progresso della elettroforesi. Altri coloranti di carico tra cui blu bromofenolo saranno rilevati durante la scansione e quindi interferire con l&#39;analisi delle immagini (Figura 1B). In alcuni casi di EMSAs, soprattutto se si utilizza la preparazione estratto nucleare, poli-deoxyinosinic deoxycytidylic (dI-dC) è incluso nella reazione di legame per ridurre legame non specifico di proteine al DNA 11. Tuttavia, 50 mg / ml di di-dC ha abolito il legame del 6xHis-SOX-2 purificati con sonde 5&#39;Dye DNA (Figura 1B). Per mostrare la specificità di legame delle sonde di DNA colorante fluorescente marcato infrarossi, abbiamo usato WT o sonde fredde mutanti come concorrenti ( <sTrong&gt; Figura 1C). In questo caso, la LIM-4 (M) / SOX-2 sonda fredda mutato nel sito di legame LIM-4 è efficiente come WT LIM-4 / SOX-2 sonda fredda in competizione con fluorescente infrarosso colorante marcato LIM-4 / sonda SOX-2 per il legame a 6xHis-SOX-2 G73E (Figura 1C, corsie 3-6 vs. 7-10). Tuttavia, l&#39;efficienza concorso del / SOX-2 (M) Sonda fredda LIM-4 mutato nel sito di legame SOX-2 è molto più basso di WT LIM-4 / SOX-2 sonda fredda per il legame al 6xHis-SOX-2 G73E (Figura 1C, corsie 13-16 vs. 17-20). La specificità di legame delle proteine può essere determinato eseguendo saggi supershift dell&#39;interazione proteina-DNA usando anticorpi specifici per le proteine o tag, soprattutto quando la preparazione dell&#39;estratto nucleare è utilizzata per il test 1. SOX-2 è stato taggato con 6xHis e epitopi FLAG. L&#39;aggiunta di 1 mg anti-6xHis o 2,5 mg Anti-Flag-M2 Antibo<html> muore determinato un supershifted banda SOX-2-DNA (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54863/54863fig1.jpg" /> Figura 1. Grafico Femsa utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente-etichettati. (A) Flusso di FEMSA. (B) L&#39;effetto di bromofenolo colorante blu, arancio G, e di-DC (1 mg) su FEMSA. 5 nM sonda 5&#39;Dye-LIM-4 / SOX-2 è stato utilizzato. (C) FEMSA mostra la specificità di legame di 6xHis-SOX-2 G73E al sito di destinazione SOX-2 dell&#39;elemento LIM-4 / SOX-2. 5 nM sonda 5&#39;Dye-LIM-4 / SOX-2 è stato utilizzato. LIM-4 / SOX-2 (M), siti bersaglio mutante. I gel sono stati scansionati a 20 e 40 minuti dopo l&#39;elettroforesi. L&#39;immagine digitalizzata ottenuta a 40 minuti dopo l&#39;elettroforesi è stata usata per quantificare l&#39;intensità della banda fluorescente, che è stata normalizzata per l&#39;intensità della corsia senza sonda fredda. AU, unità arbitrarie.ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54863/54863fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi supershift del Complesso SOX-2-DNA utilizzando Femsa e anticorpi. SOX-2 è stato taggato sia con 6xHis e epitopi FLAG. L&#39;aggiunta di anti-6xHis o anticorpi anti-FLAG causato una supershift del complesso SOX-2-DNA. 5&#39;Dye-LIM-4 / SOX-2 sonda è stata utilizzata. immagini di gel sono stati giuntati tra le corsie 2 e 3 per escludere corsie irrilevanti. Il gel è stato scansionato a 40, 60, e 90 minuti dopo l&#39;elettroforesi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54863/54863fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine ​​insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un&#39;importante questione biologica.

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.5K Views.  University of Illinois at Chicago.  Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine ​​insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica. 

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Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Ricerca

Biochimica

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Saggi per enzimi del DNA utilizzando oligonucleotidi sintetici

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

Autore in primo piano: Caratterizzazione di nuovi enzimi da estremofili e patogeni comuni per comprendere la riparazione e la replicazione del DNA

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo completo per l'identificazione cellulare e l'analisi metabolica con OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: OPTIR-FISH integrato per l'analisi metabolica e dell'identità a singola cellula in ambienti complessi

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Bioingegneria

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron regulatory proteins, IRP1 and IRP2. They bind to iron responsive elements (IREs) within the untranslated regions (UTRs) of several target mRNAs, thereby controlling the mRNAs translation or stability. IRE/IRP interactions have been widely studied by EMSA. Here, we describe the EMSA protocol for analyzing the IRE-binding activity of IRP1 and IRP2, which can be generalized to assess the activity of other RNA-binding proteins as well. A crude protein lysate containing an RNA-binding protein, or a purified preparation of this protein, is incubated with an excess of32 P-labeled RNA probe, allowing for complex formation. Heparin is added to preclude non-specific protein to probe binding. Subsequently, the mixture is analyzed by non-denaturing electrophoresis on a polyacrylamide gel. The free probe migrates fast, while the RNA/protein complex exhibits retarded mobility; hence, the procedure is also called &#8220;gel retardation&#8221; or &#8220;bandshift&#8221; assay. After completion of the electrophoresis, the gel is dried and RNA/protein complexes, as well as free probe, are detected by autoradiography. The overall goal of the protocol is to detect and quantify IRE/IRP and other RNA/protein interactions. Moreover, EMSA can also be used to determine specificity, binding affinity, and stoichiometry of the RNA/protein interaction under investigation.

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

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Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

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Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

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Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio